Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Механизмы ЭМП 17
1.1.1 Внеклеточные сигналы-индукторы ЭМП 17
1.1.2 Транскрипционные факторы 20
1.1.3 МикроРНК 23
1.1.4 Альтернативный сплайсинг 24
1.1.5 Разрушение межклеточных контактов и нарушение полярности 25
1.1.6 Аутофагия 31
1.2 Эпителио-мезенхимные переходы в патогенезе фиброза 33
1.2.1 Фиброз почек 35
1.2.2 Идиопатический легочный фиброз 37
1.2.3 Фиброз печени 39
1.2.4 Келоидные рубцы 40
1.2.5 Фиброзные изменения в сетчатке глаза 42
1.2.6 Слизистая ротовой полости 43
1.2.7 Диагностика и терапия фиброза 44
1.3 ЭМП/МЭП в репрограммировании соматических клеток in vitro 46
1.4 ЭМП и 3D культивирование 49
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1 Культивирование клеток 53
2.1.1 2D культуры 53
2.1.2 3D культуры 56
2.1.3 Вторичноприкрепленные культуры 56
2.2 Прижизненная цейтраферная (time-lapse) микроскопия 57
2.3 Математическое моделирование 58
2.4 Гистология и электронная микроскопия 61
2.4.1 Фиксация образцов 61
2.4.2 Гистология – полутонкие срезы 62
2.4.3 Просвечивающая электронная микроскопия 62
2.4.4 Растровая электронная микроскопия 63
2.5 Проточная цитофлуориметрия 63
2.6 Иммуноцитохимия и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 64
2.7 Репарация 3D культуры ретинального пигментного эпителия после повреждения наносекундным лазерным скальпелем 65
Глава 3. Результаты 66
3.1 Монослойные культуры 66
3.1.1 Буккальный эпителий 66
3.1.2 Ретинальный пигментный эпителий 73
3.1.3 Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки лимба 78
3.1.4 Фибробласты собственной пластинки слизистой щеки 83
3.1.5 Сравнение миграционной активности клеток эпителиального и мезенхимного фенотипов повреждения монослоя в 2D культуре в тесте «заживление царапины» 86
3.2 Математическое моделирование для определения оптимальных параметров 3D культивирования клеток эпителиального и мезенхимного фенотипов 89
3.2.1 Моделирование процесса сфероидогенеза из клеток эпителиального фенотипа 90
3.2.2 Моделирование процесса сфероидогенеза из клеток мезенхимного фенотипа 96
3.2.3 Сравнение результатов моделирования процесса компактизации для сфероидов из клеток эпителиального и мезенхимного фенотипов 104
3.3 3D Культивирование 107
3.3.1 Буккальный эпителий 107
3.3.2 Ретинальный пигментный эпителий 112
3.3.3 Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки лимба 118
3.3.4 Фибробласты собственной пластинки слизистой щеки 123
3.4 Анализ пролиферативной активности клеток в 3D культуре 124
3.5 Вторичноприкрепленные культуры 126
3.6 Репарация 3D культур РПЭ после повреждения наносекундным лазерным скальпелем 130
Глава 4. Обсуждение 134
Заключение 149
Выводы 152
Список использованной литературы 154
- Разрушение межклеточных контактов и нарушение полярности
- Буккальный эпителий
- Моделирование процесса сфероидогенеза из клеток эпителиального фенотипа
- Ретинальный пигментный эпителий
Разрушение межклеточных контактов и нарушение полярности
Диссоциация плотных контактов
Плотные контакты являются самыми апикальными в комплексе межклеточных контактов характерных для эпителиальных клеток, куда также входят адгезивные контакты и десмосомы. Плотные контакты являются важным структурным компонентом, который связан с актиновым цитоскелетом клетки и участвует в регуляции пролиферации, поляризации и дифференцировки эпителиальных клеток [8 , 118]. В структуре плотных контактов можно выделить трансмембранные и цитоплазматические домены (Табл. 1.1)
Диссоциация плотных контактов – один из ключевых моментов начального этапа ЭМП, и происходит за счет TGF-индуцированного разрушения белкового комплекса плотных контактов. Этот механизм обусловлен тем, что один из трансмембранных компонентов данного комплекса - окклюдин - постоянно связан с рецептором TGFP I типа (TGFPR1), а одним из субстратов действия TGFPR1 является цитоплазматический белок-маркер апикальной поверхности эпителиальных клеток - PAR6. При TGFp-индуцированном ЭМП TGFPR1 формирует гетеродимер с рецептором TGFP II типа - TGFpR2, который за счет своей киназной активности фосфорилирует PAR6 и таким образом обеспечивает его связывание с Е3 убиквитинлигазой -SMURF1. Мишенью SMURF1 является малая ГТФаза RhoA, деградация которой приводит к изменениям в структуре кортикального цитоскелета и разборке белковых комплексов, формирующих плотный контакт [125].
Диссоциация адгезивных контактов
Адгезивные контакты - якорные межклеточные соединения, сформированные с помощью кадгеринов и катенинов и ассоциированные с актиновым цитоскелетом и микротрубочками. Так, для нормального функционирования данного типа контактов в эпителиальных клетках необходим Е-кадгерин - Са2+-зависимый белок, с цитоплазматическим доменом которого связаны Р-катенин и р120 катенин [118]. Стабильность адгезивных Е-кадгериновых контактов обеспечивается также за счет того, что р120 катенин регулирует активность малых ГТФаз и соответствующих им факторов обмена гуаниновых нуклеотидов GEFs (guanine nucleotide exchange factors) [89].
Разрушение эпителиальных адгезивных контактов может происходить несколькими путями. Во-первых, за счет прямого подавления экспрессии Е-кадгерина транскрипционными факторами Snail и Zeb [60 , 95 , 130 , 189]. В результате разрушения белкового комплекса высвободившийся Р-катенин становится компонентом Wnt-сигнального пути, фосфорилируется, транслоцируется в ядро, где взаимодействует с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF и активирует экспрессию маркеров мезенхимного ряда [42 , 143]. Во-вторых, стабильность адгезивных контактов может нарушаться при появлении альтернативных изо форм р120 катенина [169], при этом происходит экспорт Е-кадгерина с плазматической мембраны в цитоплазму, где может произойти его деградация с участием лизосом. Захват Е-кадгерина лизосомами регулируется субстратом тирозинкиназы, регулируемой фактором роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate - Hrs), а также тирозинкиназой Src [127].
Диссоциация десмосом
Десмосомы - наиболее устойчивые межклеточные соединения эпителиальных клеток, находятся на латеральной мембране базальнее, чем плотные и адгезивные контакты. В основной состав десмосом входят белки трех семейств: кадгеринов (десмоглеины и десмоколины), семейства белков armadillo (плакоглобин и плакофилины), а также плакинов (десмоплакин). Кадгерины находятся на мембране и соединяются между собой через внеклеточные домены, а десмоплакин является связующим звеном между белками контакта и промежуточными филаментами [74].
Диссоциация контактов данного типа при ЭМП возникает после того, как были разрушены плотные контакты, часто одновременно с адгезивными, это связано с тем, что гены плакофилина и десмоплакина, как и ген Е-кадгерина, являются непосредственной мишенью транскрипционного фактора Zeb2 [164]. Кроме того, стабильность десмосом нарушается фосфорилированием ее компонентов по серину протеинкиназой С (РКС). В частности, PKCа регулирует динамику содержания десмоплакина через Са2+ АТФазу SERCA2 [63].
Транспорт белков адгезии в ядро
Обратимость ЭМП, а, следовательно, и эпителио-мезенхимная пластичность клеток, тесно связаны с динамичностью процесса ремоделирования всех типов комплексов межклеточных контактов. Так, белки адгезивных комплексов, не захваченные для деградации лизосомами, могут циркулировать внутри клетки. Например, Е-кадгерин может поступать в адгезивные комплексы или выходить из их состава за счет последовательных циклов эндо- и экзоцитоза [28]. В составе p120 катенина присутствуют последовательности ядерной локализации (nuclear localization sequences – NLSs), что делает возможным его циркуляцию между ядром и цитоплазмой [138]. В ядре р120 катенин взаимодействует с транскрипционным фактором Kaiso, а мишенями этого комплекса являются гены-мишени канонического Wnt/ катенин сигнального пути, такие как циклин D1 и Wnt-11 [89]. Свободные формы этих белков транслоцируются в ядро, где взаимодействуют с транскрипционными факторами, которые подавляют дальнейший их синтез [45]. А ядерный -катенин, как было отмечено ранее, в комплексе с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF активирует экспрессию маркеров мезенхимного ряда [42 , 143]. Нарушение полярности клеток Одной из отличительных черт клеток эпителиального фенотипа является апико-базальная полярность. Апикальную сторону эпителиальных клеток определяют белковые комплексы partitioning defective (PAR) и Crumbs (CRB). В PAR комплекс входят два адапторных белка PAR3 и PAR6, а также атипичная протеинкиназа С (aPKC). PAR3 обеспечивает взаимодействие комплекса с плотными контактами через адгезивную молекулу контактов-1 (junctional adhesion molecule-1 – JAM-1) и с адгезивными контактами через нектин-1 и -3. PAR6 связывается с малой ГТФазой Cdc42, регулируя таким образом киназную активность аРКС [168]. В комплекс CRB также входят 3 белка: CRB, белок, ассоциированный с Lin Seven 1 (protein associated with Lin Seven 1 – PALS1), и PALS1-ассоциированный белок плотных контактов (PALS1-associated tight junction protein – PATJ). Комплекс CRB играет важную роль в формировании плотных контактов [168].
Scribble-комплекс определяет базолатеральную поверхность эпителиальных клеток и включает 3 белка: SCRIB, lethal giant larvae (LGL) и disc large (DLG). Этот комплекс взаимодействует с PAR-комплексом и отвечает за стабилизацию адгезивных контактов [81]. Транскрипционные факторы Zebl и Snail 1 могут напрямую подавлять экспрессию СгЬЗ, Lgl2 и Patj [56]. Однако и белки комплексов полярности могут участвовать в контроле экспрессии этих транскрипционных факторов. Так, Scribble способен за счет регуляции МАРК-ERK сигнального пути снижать экспрессию индуктора ЭМП - ZEB [32], а LGL по принципу обратной отрицательной связи может способствовать подавлению экспрессии Snail 1 [79]. PAR6, наоборот, может участвовать в разрушении комплекса плотных контактов, когда при взаимодействии с TGFpR способствует убиквитинированию малой ГТФазы RhoA, которая обеспечивает стабильность плотных контактов [125]. Разрушение базальной мембраны и изменения в экспрессии интегринов Еще одним из ключевых событий во время ЭМП является потеря клетками связи с базальной мембраной. Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом (ВКМ) обеспечивают интегрины - гетеродимерные трансмембранные белки, которые состоят из одной и одной субъединицы. Существует как минимум 24 разных интегриновых гетеродимера, каждый из которых отвечает за связь с разными компонентами ВКМ - ламинином, коллагеном, фибронектином и другими. В ответ на изменение состава ВКМ, которое происходит при ЭМП (увеличивается количество фибронектина, коллагена I типа), происходит изменение профиля экспрессии интегринов в клетке [106].
В свою очередь, изменение состава интегринов в клетке может привести к разрушению межклеточных контактов, нарушению апико-базальной полярности клеток, реорганизации цитоскелета. Так, например, интегрин v6 способен активировать один из основных индукторов ЭМП - TGFP, это происходит за счет связывания интегрина с латентным комплексом TGFP-LAP (latency associated peptide) и высвобождения активного TGFP [147]. А интегрин аЗрі, взаимодействующий с ламинином и Е-кадгерином, необходим для протекания ЭМП, так как без его 3-субъединицы не формируется комплекс фосфорилированного Smad2 с -катенином [85]. Увеличение экспрессии еще одного интегрина oc5pi во время ЭМП усиливает адгезию клеток к фибронектину - компоненту внеклеточного матрикса, необходимому для миграции клеток [114]. Кроме того, усиление экспрессии интегринов аїр1 и oc2p1 и их взаимосвязь с коллагеном I типа способствует разрушению Е-кадгериновых адгезивных контактов и обеспечивает транслокацию свободного Р-катенина в ядро [86]. Существует также очень тонкая взаимосвязь между жесткостью субстрата, TGF и ЭМП. На жестком фибронектиновом матриксе при повышенной сократимости эпителиальных клеток происходит интегрин-опосредованная активация TGF, что приводит к спонтанному ЭМП [16].
Буккальный эпителий
Для получения культуры клеток буккального эпителия был выбран метод эксплантационного культивирования. Для этого фрагменты ткани слизистой оболочки щеки после первичной обработки в растворе Хэнкса с антибиотиками и противогрибковыми средствами механически измельчали и помещали на поверхность чашки Петри в небольшом количестве полной ростовой среды, чтобы обеспечить адгезию эксплантатов в культуральному пластику. Через несколько дней после получения материала (3-14 сутки) наблюдали начало миграции клеток эпителиального фенотипа (Рис. 3.1А). При помещении эксплантатов на покровные стёкла с целью дальнейшего проведения иммуноцитохимического анализа первичной культуры адгезии эксплантатов и миграции клеток не наблюдали.
Первичная культура представляла собой пласт эпителиальных клеток с характерной морфологией «булыжная мостовая» (Рис. 3.1Б). Формирование монослоя происходило за счет пролиферации отдельных клеток, а также коллективной миграции клеток «единым фронтом» (Рис. 3.1В) из фрагментов ткани, адгезировавшихся к культуральному пластику. Единичных клеток, дающих начало колониям, в культуре не наблюдали. Кроме того, в первичной культуре присутствовали в большом количестве неадгезировавшиеся клетки (Рис. 3.1Г), которые постепенно исчезали при смене культуральной среды.
При достижении первичной культурой 100% конфлуэнтности осуществляли пассирование. В начале работы была испробована стандартная методика пассирования, применяемая для клеток мезенхимного фенотипа, когда клетки в 0,25% растворе трипсина пересевают на чашку большей площади для дальнейшего роста культуры. Данный подход для культуры буккального эпителия оказался неэффективным – потребовалась более мягкая и более продолжительная ферментативная обработка (2 смены смеси 0.25% раствора трипсина и раствора версена 1:1 при +37С), при этом часть клеток оставляли на исходной чашке в виде островков эпителия. Полученную в результате суспензию собирали в 15мл пробирки, блокировали действие трипсина эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и центрифугировали (7минут, 1000об/мин). Полученный осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на чашку Петри того же или большего размера, что и исходная чашка.
Контроль культуры через сутки после пассирования показал, что ферментативная обработка приводит к гибели большого количества клеток, несмотря на блокирующее действие сыворотки, причем при высевании клеток на чашки Петри большего объема процент жизнеспособных клеток резко снижался. Высевание культуры в высокой плотности способствовало тому, что уже через сутки клетки формировали плотные островки, сохраняя при этом эпителиальную морфологию (Рис. 3.2А). Для того, чтобы избавиться от нежизнеспособных клеток, на следующий день после пассирования перед сменой ростовой среды отмывали чашки раствором версена.
Культура буккального эпителия на первом пассаже имела характерную морфологию «булыжной мостовой» (Рис. 3.2Б), клетки экспрессировали маркеры эпителиальных клеток – ZO-1 (белок плотных межклеточных контактов) на цитоплазматической мембране (Рис. 3.2В) и цитокератин 19 (белок промежуточных филаментов цитоскелета) в цитоплазме (Рис.3.2Г).
Анализ культуры буккального эпителия первого пассажа методом проточной иммуноцитофлуориметрии показал, что более 90% клеток в популяции несли на поверхности эпителиальный маркер CD326+ (Epithelial Cell Adhesion Molecule – EpCAM) (Рис 3.3В). У 9.9% наблюдали экспрессию маркера CD56+ (Neural Cell Adhesion Molecule – NCAM), который характерен для мигрирующих мезенхимных клеток (Рис. 3.3Г). Около 25% клеток в культуре первого пассажа несли на себе поверхностный маркер CD44+ (Рис. 3.3Д), который является интегральным клеточным гликопротеином и играет важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. Анализ экспрессии поверхностных маркеров, используемых для описания культур мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, в культуре буккального эпителия первого пассажа показал, что для клеток была характерна низкая экспрессия основных маркеров ММСК – CD105, CD90, CD73 (Рис. 3.3 Е-З). Кроме того, клетки первого пассажа практически не экспрессировали маркеры клеток гемопоэтического и лимфоцитарного ряда – CD45, CD34, CD14 (Рис. 3.3 И-Л). Таким образом, культура буккального эпителия первого пассажа была практически полностью представлена клетками эпителиального фенотипа.
При дальнейшем пассировании культуры буккального эпителия, количество клеток с эпителиальной морфологией снижалось – в то время как большая часть культуры 4 пассажа сохраняла морфологию типа «булыжная мостовая» (Рис. 3.4А), одновременно в ней появлялись клетки с морфологией более близкой к мезенхимному фенотипу (Рис. 3.4Б), то есть в культуре наблюдали появление переходной формы клеток.
Эти наблюдения подтвердили данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии: количество клеток, несущих эпителиальный маркер CD326 снижалось до 50% (Рис. 3.5А), в то время как количество CD56+ и CD44+ клеток резко возрастало до 85% и 90%, соответственно (Рис. 3.5 Б, В ). Экспрессию эндоглина CD105 по-прежнему наблюдали менее, чем в 10% клеток (Рис. 3.5Г), в то время как экспрессия маркеров CD90 и CD73 возрастала до 60-70% (Рис. 3.5 Д,Е). Количество клеток, несущих маркеры клеток гемопоэтического и лимфоцитарного ряда – CD45, CD34, CD14 практически не изменялось по сравнению с культурой первого пассажа (Рис. 3.5 Ж-И). Таким образом, в культуре буккального эпителия четвертого пассажа наблюдали признаки ЭМП и появления популяции со смешанным Э/М фенотипом.
Моделирование процесса сфероидогенеза из клеток эпителиального фенотипа
Наблюдение за общей динамикой сфероидогенеза из клеток буккального эпителия методом прижизненной цейтраферной микроскопии выявило основное качественное отличие процесса сфероидогенеза из клеток эпителиального фенотипа, которое состояло в том, что вокруг плотного жизнеспособного сфероида формировалось окружение из апоптотировавших клеток, которые не входили в состав сфероида. С увеличением исходного числа клеток в составе сфероида количество мертвых клеток, окружающих структуру, увеличивалось (Рис. 3.18).
Результаты экспериментов при разном сочетании факторов, влияющих на процесс формирования сфероидов, основанный на подсчете площади проекции сфероидов на полученных в результате цейтраферной фотосъемки изображениях, представлен на Рис. 3.19.
Верхняя пара кривых на Рис. 3.19 представляет собой отражение результатов формирования сфероидов при начальном количестве клеток равном 3000. Нижняя пара кривых – динамика изменения площади при количестве клеток в сфероиде равном 1000. В каждой из описываемых пар кривых одна отличается от другой концентрацией ЭТС в среде. Левее вертикальной красной прямой располагается первый характерный участок клеточной динамики сфероидогенеза (до 24 часов), а правее ее второй, пологий, участок динамики формирования сфероидов (после 24 часов). Результаты обработки экспериментальных данных по всем трем моделям в соответствии с выражением: Y = а0 + а1 Х1 + а2 Х2 + а3 Х3 + а12 Х±Х2 + а13 Х±Х3 + а23 Х2Х3 + а123 XtX2X3 + є для участков кривых в первые сутки 3D культивирования (левее вертикальной красной линии) приведены в таблице 3.1.
Как видно из результатов, приведенных в таблице 3.1, все 3 модели для первого временного участка процесса компактизации имеют очень хорошее качество – коэффициенты детерминации (R2) для них имеют высокие значения (выше 0,98). Но, исходя из критерия минимально необходимой сложности, мы выбрали в качестве модели, описывающей процесс компактизации, третью модель. Именно ее мы и разберем более подробно в качестве описания и объяснения процесса формирования многоклеточного сфероида из клеток эпителиального фенотипа. Модель включает в себя шесть параметров, значения которых позволяют оценить значимость различных факторов на процесс формирования сфероидов. Наиболее значимым прямым эффектом является количество клеток, из которых формируется сфероид. Значимость этого эффекта отражается величиной соответствующего коэффициента, который равен 0,56. Данный коэффициент имеет знак «+», что говорит о том, что при росте начального количества клеток в растворе, из которых впоследствии формируется сфероид с 1000 до 3000. площадь сфероида растет. При этом, данный коэффициент определен достаточно точно – его стандартная ошибка среднего равна 0,01. То есть истинное значение коэффициента лежит в интервале от 0,55 до 0,57 и прямой эффект на площадь сфероида от начального количества клеток в суспензии значимо отличен от "0".
Следующим по уровню значимости является прямой эффект от времени, прошедшего с момента начала культивирования клеток в неадгезивных условиях. Его величина равна 0,29, и он имеет отрицательный знак. Последнее означает, что с ростом времени от начала культивирования площадь сфероида уменьшается. Но прямым эффектом влияние времени на компактизацию сфероидов не ограничивается. Влияние времени настолько сильно, что оно сказывается и в эффекте двойного взаимодействия: эффект от совместного влияния на площадь сфероида времени и концентрации ЭТС в среде имеет знак минус перед значением коэффициента. Это означает, что взаимодействие факторов ЭТС и времени приводит к уменьшению площади сфероида, а значимость этого уменьшения характеризуется величиной -0,037. Этот коэффициент имеет относительно большую величину ошибки, равную 0,015, что означает, что эффект парного взаимодействия лежит в интервале от -0,042 и до -0,025. Эффект парного взаимодействия значимо выделяется из статистического шума – он отличен от "0". В процесс уменьшения площади сфероида значимый вклад вносит и эффект парного взаимодействия времени с начала компактизации и начального количества клеток. Величина данного коэффициента равна -0,078 с интервалом неопределенности ±0,018. То есть, значение коэффициента лежит в интервале от -0,06 до -0,096.
Результаты обработки экспериментальных данных по трем моделям (в соответствии с выражением 1) для участков кривых после первых суток компактизации сфероидов приведены в таблице 3.2.
Как и в случае моделей для первого участка кривых, качество всех трех моделей на втором (пологом) участке кривых тоже было высоким (R20,97), то есть все они точно описывают процесс компактизации. Самым адекватным описанием процесса компактизации, как и для первых суток сфероидогенеза, является третья модель, которая описывает только главные эффекты и эффекты парных взаимодействий. Единственным отличием, с точки зрения состава выделяемых факторов, является тот факт, что для адекватного описания процесса компактизации требуется не шесть, а семь коэффициентов – добавляется коэффициент, от влияния парного взаимодействия концентрации ЭТС в среде и количества клеток, формирующих сфероид. Как видно из таблицы 3.2, все выявленные эффекты статистически значимо отличаются от «0». Самым «мощным» эффектом, определяющим компактизацию сфероидов на этом участке кривых, является эффект от исходного количества клеток. Он обладает положительным влиянием на площадь сфероида и имеет численно значение 0,98±0,005. Следующим, по силе влияния, является эффект парного взаимодействия времени от начала процесса компактизации и количества клеток. Что очень важно, он имеет отрицательное влияния на площадь сфероида – с течением времени и при увеличении начального количества клеток от 1000 до 3000 процесс компактизации сфероида усиливается. Значение, характеризующее силу влияния этого парного взаимодействия на размер сфероида составило -0,6±0,006. Видно, что сила влияния уступает главному эффекту около 30%. Следующим по силе влияния является фактор двойного взаимодействия между концентрацией ЭТС в среде и начальным количеством клеток. Он имеет знак «минус», то есть с ростом концентрации фактора роста и с ростом количества клеток сфероид сжимается, уменьшая свою площадь. Сила его влияния на размер сфероида составила -0,19±0,004. Приблизительно такой же силы влияние, но со знаком «плюс» на площадь сфероидов имеет чистый фактор концентрации ЭТС в среде – он равен 0,15±0,004, то есть, с ростом концентрации фактора роста размер сфероид увеличивается. И, наконец, чистый эффект от времени от начала процесса компактизации на этом участке был самым низким – этот эффект имеет положительное влияние и характеризуется величиной 0,019±0,006. Обращает на себя внимание изменение как знака у этого эффекта, так и его величины; время становится не столь значимым по сравнению с начальным этапом компактизации.
Для более глубокого понимания процесса формирования сфероидов из эпителиальных клеток провели сравнение математических моделей, описывающих начальные (в первые сутки) и более поздние (после первых суток) механизмы сфероидогенеза. Главным общим элементом в обеих моделях являлась максимальная значимость эффекта от начального количества клеток, формирующих сфероид. На обеих стадиях процесса значимость этого эффекта была максимальна – большее количество клеток при формировании сфероида приводило к тому, что его размер увеличивался.
Главным отличием между двумя моделями являлся тот факт, что на начальной стадии формирования сфероида (в первые сутки) высокую значимость имел фактор времени от начала процесса и этот эффект оказывал минимизирующее влияние на размер сфероида – с течением времени размер уменьшался. После первых суток картина менялась – этот эффект становился положительным, но при этом его значимость, по сравнению с остальными эффектами, резко падала.
Значимость концентрации ЭТС в среде в первой и второй фазах компактизации резко различалась. Значимость этого фактора после первых суток формирования сфероида возрастала почти в три раза. На обоих участках кривой динамики площади сфероидов данный эффект имел положительное влияние – рост концентрации вызывал увеличение размера сфероидов.
Во вторую фазу процесса компактизации (после первых суток) резко возрастала значимость эффектов от парных взаимодействий (времени и количества клеток, а также начального количества клеток и концентрации фактора роста). На поздних стадиях процесса эффект от парных взаимодействий резко возрастал и по масштабу величин становился близким главным эффектам. При этом в процессе компактизации эти парные эффекты на поздних стадиях имели отрицательное влияние на размер сфероидов – они способствовали его уменьшению.
Ретинальный пигментный эпителий
Клетки культуры РПЭ второго пассажа, в которых наблюдали лишь начальные признаки ЭМП к седьмым суткам формировали компактные жизнеспособные сфероиды, в которых поверхностные клетки полностью восстанавливали исходный эпителиальный фенотип, о чем свидетельствовало образование четкой сети плотных контактов между поверхностными клетками (Рис. 3.26А). Кроме того, в поверхностной зоне наблюдали мембранную локализацию маркера эпителиальных адгезивных контактов Е-кадгерина (Рис. 3.26Б, зеленый), в то время как маркер мезенхимных адгезивных контактов экспрессировался в цитоплазме клеток внутренней области (Рис. 3.26Б, красный). В поверхностных клетках также локализовался маркер низкодифференцированных клеток – нестин (Рис. 3.26В, зеленый), а в межклеточном пространстве по всей толще сфероида наблюдали экспрессию ламинина (Рис. 3.26В, красный). В то же время во всех клетках наблюдали слабую экспрессию маркера мезенхимных клеток – виментина (Рис. 3.26Г). Таким образом, при получении сфероидов из клеток РПЭ второго пассажа с начальными признаками ЭМП в монослойной культуре, мы наблюдали восстановление эпителиальной морфологии в поверхностных клетках, о чем свидетельствует восстановление высокого уровня экспрессии ZO-1 на мембранах клеток. Этот же переход, вероятно, способствует сегрегации низкодифференцированных (нестин+) клеток на поверхности сфероида.
Далее наблюдали динамику формирования и изучали структуру сфероидов из клеток РПЭ 5 пассажа, в которых в большей степени были выражены признаки ЭМП. Клетки за семь дней формировали плотный жизнеспособный сфероид, все клетки из исходной суспензии, помещенные на агарозный планшет, входили в состав получившейся структуры, дебриса вокруг сфероидов не образовывалось. Общая степень компактизации была не очень высокой (Рис. 3.27).
Ультраструктурный анализ сформировавшихся семидневных сфероидов из клеток РПЭ 5 пассажа показал, что поверхностные, плотно упакованные клетки на апикальной мембране формировали большое количество ворсинок (Рис. 3.28А), как и в случае со сфероидами из клеток буккального эпителия. Другой общей чертой, которую наблюдали в сфероидах из этих двух культур были клеточные отростки, которые образовывали небольшие просветы между соседними клетками, хотя их количество в сфероидах из РПЭ было меньше (Рис. 3.28Б). Как в поверхностных, так и внутренних клетках в цитоплазме наблюдали признаки хорошо развитого цитоскелета (Рис. 3.28 В,Г), а также большое количество микровезикул (Рис. 3.28 Г,Д). В просветах между клетками центральной области наблюдали присутствие волокон внеклеточного матрикса (Рис. 3.28Е).
Иммуноцитохимический анализ семидневных сфероидов из РПЭ 5 пассажа показал, что между поверхностными клетками пркатически не формировались плотные контакты – ZO-1 локализовалась точечно на мембране единичных клеток (Рис. 3.29А). Экспрессия нестина (Рис. 3.29Б) в поверхностных клетках была слабее, чем в сфероидах из клеток второго пассажа, как и экспрессия ламинина в межклеточных пространствах (Рис. 29В). Хорошо развитый цитоскелет как в поверхностных, так и внутренних клетках, который отчетливо прослеживался при ультраструктурном анализе сфероидов, по-видимому был представлен белком промежуточных филаментов – виментином (Рис. 3.29Г).
Таким образом, при сдвиге статуса исходных клеток в суспензии от эпителиального к мезенхимному, снижается возможность вернуть клетки к полноценному исходному фенотипу в 3D условиях культивирования.