Введение к работе
Актуальность проблемы. Клеточный стрессовый ответ относится к числу механизмов, лежащих в основе патогенеза широкого спектра заболеваний. Изменения внутренней среды организма при патологических состояниях могут индуцировать стрессовые ответы определенных типов клеток в зависимости от их чувствительности к меняющимся факторам среды.
Клеточный стресс представляет собой универсальную неспецифическую форму системной реакции клетки на любую форму макромолекулярных повреждений, превышающих пороговую величину (Kultz D., 2003; Кубатиев А.А. и др., 2012). Стрессовая реакция необходима для временного увеличения толерантности к повреждениям макромолекул посредством использования филогенетически консервативных наборов генов и биохимических путей, которые опосредуют макромолекулярную стабилизацию и репарацию в клетке для обеспечения клеточной и организменной целостности в субоптимальных условиях (Kultz D, 2003). Структурированность эукариотической клетки, наличие отличающихся по составу внутренней среды компартментов с мембранами, выполняющими барьерные функции, и защитными системами, индуцируемыми независимо от цитоплазматических, обусловливают неодинаковую чувствительность к воздействиям и разную степень вовлеченности структурно-функциональных модулей клетки в стрессовый ответ. Факт наличия активных, стабилизирующих структуру и функцию биологического модуля, неспецифических «буферных» механизмов позволил масштабировать и использовать понятие «стресс» на субклеточном уровне, то есть рассматривать компартментализованный вариант клеточного стресса.
К числу компартментов эукариотической клетки, способных к инициации специальной формы стрессового ответа, относится эндоплазматический ретикулум (ЭПР) - многофункциональная органелла, одной из важнейших функций которой является конформационное созревание белков - в ЭПР осуществляется фолдинг около 30% белков эукариот (Hetz C., 2012). Нарушения процессов конформационного созревания белков могут стать причиной развития протеотоксического стресса, динамика которого определяется интенсивностью de novo синтеза и обновления клеточных и экстраклеточных белков. Продукты незаконченной трансляции, интермедиаты фолдинга с некорректной конформацией, а также субъединицы, не включенные в олигомерные белковые комплексы, могут экспонировать гидрофобные области (Hart F.U., Hayer-Hartl M., 2009), которые становятся дополнительными, «незаконными» интерфейсами для межмолекулярного взаимодействия и могут приводить к агрегации белков, формированию токсичных и иммуногенных продуктов. Накопление конформационно-дефектных белков в люмене ЭПР в связи со множественностью функций и единым объемом этого компартмента может инициировать нарушения работы других систем ЭПР, и тем самым индуцировать состояние, характеризуемое как стресс эндоплазматического ретикулума (Ron D., Walter P., 2007).
Для защиты от протеотоксического стресса и ошибок работы системы конформационного созревания белков в ЭПР эукариот возникли следующие приспособления: 1) рецепция белков c ненативными конформациями в ЭПР; 2) обработка и передача информации в ядро о детектированных белках с дефектными
или незрелыми конформациями; 3) адаптационные изменения ЭПР и ассоциированных структур, общим результатом действия которых должно стать снижение концентрации дефектных белков в люмене ЭПР.
Перечисленные функции реализуются посредством нескольких механизмов, действующих зачастую совместно: 1) система сигнальных каскадов ответа на белки с ненативными конформациями (Unfolded Protein Response, UPR); 2) контроль трансляции - аттенюация кеп-зависимой трансляции, опосредуемая киназой PERK; 3) активация транскрипционного фактора ATF6; 4) ответ на избыток белка в люмене ЭПР, или «перегрузку» ЭПР (endoplasmic reticulum overload response, EROR), опосредуемый активированным транскрипционным фактором NF-kappaB.
Таким образом, в компартменте ЭПР при различных нарушениях может иметь место локализованный протеотоксический стресс. При дефектах или функциональной недостаточности системы контроля качества стресс может быть «генерализован» во внутри- и внеклеточном пространстве. Невозможности компенсации стресса индуцирует программированную клеточную гибель (Szegezdi E. et al, 2006).
Несмотря на значительный интерес исследователей, динамические аспекты регуляции стресса ЭПР в клетках человека различных типов изучены недостаточно. Способность клеток различных типов к эффективной реализации во времени адаптивной фазы стресса ЭПР определяет устойчивость клеток к стрессу и их дальнейшую выживаемость. В этой связи, анализ тканеспецифичных особенностей временных профилей экспрессии генов системы UPR, в частности, BiP, XBP1, кинетики сплайсинга XBP1 и соотнесение динамики этих процессов с индукцией проапоптотического гена CHOP, а также анализом клеточной гибели представляются актуальными задачами исследования.
При гипергомоцистеинемии - распространенном патологическом состоянии (Hashimoto T. et al, 2007), ассоциированном с сердечно-сосудистыми, нейродегенеративными заболеваниями, инсулиннезависимым диабетом и рядом других патологий, возросший уровень аминокислоты гомоцистеина в плазме крови может оказывать стресс-индуцирующее действие на клетки. Предполагается, что гомоцистеин может активировать стрессовый ответ эндотелиоцитов и быть причиной развития эндотелиальной дисфункции, при этом формой стрессовой реакции может быть стресс ЭПР и IREl-зависимый апоптоз (Zhang C. et al, 2001).
ЭПР-стресс как результат нарушений конформационного созревания белков может играть ключевую роль в патогенезе ассоциированных с гипергомоцистеинемией заболеваний и способен рассматриваться как типовой молекулярно-патофизиологический процесс. В связи с этим, исследование ЭПР- стрессовых ответов клеток разных типов и различной тканевой принадлежности имеет важнейшее фундаментальное и прикладное значение для патофизиологии и биомедицинской науки в целом. С учетом вовлеченности сосудистой стенки в развитие патологического состояния гипергомоцистеинемии (Kubatiev A. et al, 2005), изучение стресса эндоплазматического ретикулума в эндотелиоцитах и взаимодействующих с ними клетках иммунной системы является актуальной задачей.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является сравнительный анализ экспрессионных профилей генов, вовлеченных в стресс эндоплазматического ретикулума, а также выявление неизвестных ранее тканеспецифических особенностей их регуляции под действием гомоцистеина in vitro и в условиях экспериментальной гипергомоцистеинемии in vivo. Задачи исследования:
-
Провести исследование уровней мРНК генов XBP1, BiP и CHOP, ассоциированных со стрессом ЭПР, в клетках T-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926 под действием гомоцистеина in vitro.
-
Изучить динамику внутриклеточных концентраций белков стрессового ответа BiP и CHOP в клетках линий Jurkat и EA.hy926 под действием гомоцистеина.
-
Установить взаимосвязь временных профилей экспрессии генов стрессового ответа и концентраций их белковых продуктов с процессами клеточной гибели и распределением клеток по фазам клеточного цикла.
-
Выявить особенности экспрессии генов стрессового ответа на модели гипергомоцистеинемии in vivo.
Научная новизна исследования. Впервые проанализирована экспрессия генов BiP, CHOP и XBP1, участвующих в формировании стрессового ответа, в клетках линии Т-лимфобластной лейкемии человека Jurkat. Получены временные профили экспрессии генов в линиях клеток Jurkat и EA.hy926, свидетельствующие о клеточно- специфичной динамике стрессового ответа, определяемой морфофункциональными особенностями эндоплазматического ретикулума этих клеток. Впервые показано отсутствие корреляции между изменением уровня мРНК гена CHOP и его белкового продукта в клетках Jurkat и EA.hy926, что может указывать на важность посттранскрипционных механизмов в регуляции экспрессии генов системы сигнальных каскадов UPR, участвующих в принятии решения клеткой о запуске про- или антиапоптотических механизмов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные углубляют существующие представления о динамике развития стрессового ответа в линиях клеток, различающихся по морфофункциональным свойствам эндоплазматического ретикулума, но имеющих идентичную организацию системы сигнальных каскадов UPR. Обнаруженные в работе особенности экспрессии проапоптотического гена CHOP могут указывать на существование нового регуляторного механизма при стрессе эндоплазматического ретикулума. Практическая значимость полученных данных состоит в возможности использования белков BiP и CHOP в качестве маркеров для диагностики стресса ЭПР in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Гомоцистеин способен вызывать стресс ЭПР в клетках различного тканевого происхождения (клетки T-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926).
-
Степень чувствительности и устойчивости к стрессу ЭПР под действием гомоцистеина зависит от типа клеток и их тканевого происхождения.
-
Специфичность функционирования системы UPR в клетках Т-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926 выражается в различной динамике и уровнях экспрессии генов стрессового ответа.
-
Неполная корреляция между уровнями мРНК и концентрациями белковых продуктов генов стрессового ответа, прежде всего CHOP, указывает на возможность вовлечения дополнительных посттранскрипционных механизмов регуляции в систему сигнальных каскадов UPR.
-
Ключевую роль при стрессе ЭПР играет времязависимая регуляция системы UPR.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на межлабораторной конференции Отдела молекулярной и клеточной патофизиологии ФГБУ «НИИОПП» РАМН (Россия, Москва, 26 июня 2012), на Циклах усовершенствования врачей и научно-педагогических кадров по молекулярной и клеточной патологии в РМАПО МЗ РФ (Россия, Москва, 2011 - 2012), на VII съезде аллергологов и иммунологов стран СНГ (Россия, Санкт-Петербург, 2009), IV международном конгрессе «Stress Responses in Biology and Medicine» (Япония, Саппоро, 2009).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов, объектов и экспериментальных методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 166 источников.
Похожие диссертации на Тканеспецифичные особенности экспрессии генов, ассоциированных со стрессом эндоплазматического ретикулума под действием гомоцистеина
-
