Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Механизмы влияния гипоксии на клетки головного мозга млекопитающих .15
1.2 Влияние антенатальной гипоксии на головной мозг млекопитающих .24
1.3. Влияние лигандов опиоидных рецепторов на морфофункциональное состояние головного мозга млекопитающих 29
1.4. Нейропротективные эффекты лигандов опиоидных рецепторов 36
1.5. Заключение .41
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Характеристика экспериментальных животных 42
2.2. Характеристика объектов исследования 43
2.3. Характеристика исследуемых веществ 44
2.4. Организация экспериментов .47
2.5. Соматометрические и гравиметрические методы исследования 49
2.6. Методы исследования поведенческих реакций
2.6.1. Тест «Отрицательный геотропизм» 50
2.6.2. Тест «Вис на горизонтальной проволоке» 50
2.6.3. Тест «Спуск с высоты» 50
2.6.4. Тест «Открытое поле» .51
2.6.5. Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»
2.7. Гистологическая обработка экспериментального материала .53
2.8. Метод авторадиографического исследования 53
2.9. Метод гистохимического исследования ядрышек (AgNORs)
2.10. Метод хемилюминесценции 59
2.11. Определение уровня NGF методом иммуноферментного анализа 60
2.12. Статистические методы исследования 62
Глава 3. Результаты исследования 63
3.1. Влияние антенатальной гипоксии на морфофункциональные характеристики головного мозга белых крыс .63
3.1.1. Влияние антенатальной гипоксии на общесоматические и гравиметрические показатели подопытных животных в возрастной динамике .63
3.1.1.1. Влияние антенатальной гипоксии на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс антенатального периода и раннего постнатального периода 63
3.1.1.2. Влияние антенатальной гипоксии на общесоматические и гравиметрические показатели 30- и 60-суточных белых крыс .65
3.1.2. Влияние антенатальной гипоксии на процессы синтеза ДНК в неокортексе и гиппокампе новорожденных белых крыс 67
3.1.3. Влияние антенатальной гипоксии на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс 68
3.1.3.1. Влияние антенатальной гипоксии на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа 1- и 7-суточных белых крыс 68
3.1.3.2. Влияние антенатальной гипоксии на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа 60-суточных белых крыс .69
3.1.4. Влияние антенатальной гипоксии на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге белых крыс 71
3.1.4.1. Влияние антенатальной гипоксии на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге белых крыс позднего антенатального периода и раннего неонатального возраста 71
3.1.4.2. Влияние антенатальной гипоксии на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге 60-суточных белых крыс .73
3.1.5. Влияние антенатальной гипоксии на поведенческие реакции белых крыс .74
3.1.5.1. Влияние антенатальной гипоксии на поведенческие реакции белых крыс раннего периода постнатального онтогенеза .74
3.1.5.2. Влияние антенатальной гипоксии на поведенческие реакции 30- и 60-суточных белых крыс исследуемых групп 76
3.2 Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на морфофункциональные характеристики головного мозга белых крыс .81
3.2.1. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс в возрастной динамике .81
3.2.1.1. Влияние раннего постнатального введения даларгина на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс в возрастной динамике .81
3.2.1.2. Влияние раннего постнатального введения пептида НАЛЭ на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс в возрастной динамике .82
3.2.2. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на процессы синтеза ДНК в неокортексе и гиппокампе 7-суточных белых крыс .84
3.2.3. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс 85
3.2.3.1. Влияние раннего постнатального введения даларгина на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс в возрастной динамике 85
3.2.3.2. Влияние раннего постнатального введения пептида НАЛЭ на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс 88
3.2.4. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на поведенческие реакции белых крыс 91
3.2.4.1. Влияние раннего постнатального введения пептида даларгин на поведенческие реакции белых крыс в возрастной динамике 91
3.2.2. Влияние раннего постнатального введения пептида НАЛЭ на поведенческие реакции белых крыс в возрастной динамике 94
3.3. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на морфофункциональные характеристики головного мозга белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 96
3.3.1. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 96
3.3.1.1. Влияние раннего постнатального введения пептида даларгин на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 96
3.3.1.2. Влияние раннего постнатального введения пептида НАЛЭ на общесоматические и гравиметрические показатели белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии .99
3.3.2. Влияние неонатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на процессы синтеза ДНК в неокортексе и гиппокампе 7-суточных белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 102
3.3.3. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии .104
3.3.3.1. Влияние раннего постнатального введения пептида даларгин на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии .104
3.3.3.2. Влияние раннего постнатального введения пептида НАЛЭ на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 108
3.3.4. Влияние неонатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 112
3.3.4.1. Влияние неонатального введения пептида даларгин на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксия 112
3.3.4.2. Влияние неонатального введения пептида НАЛЭ на процессы свободнорадикального окисления в тканях головного мозга белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 114
3.3.5. Влияние неонатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на уровень NGF в сыворотке крови белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 116
3.3.6. Влияние раннего постнатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на поведенческие реакции белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 117
3.3.6.1. Влияние раннего постнатального введения пептида даларгин на поведенческие реакции белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 117
3.3.6.2. Влияние раннего постнатального введения пептида НАЛЭ на поведенческие реакции белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии 120
Глава 4. Обсуждение полученнных результатов 123
Выводы .142
Список литературы
- Влияние лигандов опиоидных рецепторов на морфофункциональное состояние головного мозга млекопитающих
- Соматометрические и гравиметрические методы исследования
- Влияние антенатальной гипоксии на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа 60-суточных белых крыс
- Влияние раннего постнатального введения даларгина на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс в возрастной динамике
Влияние лигандов опиоидных рецепторов на морфофункциональное состояние головного мозга млекопитающих
Постгипоксическая длительная активация NMDA-рецепторов индуцирует увеличение концентрации Са2+ в клетках. В настоящее время считается, что поступление ионов Са2+ внутрь клетки через каналы NMDA-рецепторов является ключевым событием в реализации токсических эффектов глутамата (Bading H. et al., 1993). Насыщение нейронов ионами кальция служит триггером для мобилизации ионов из внутриклеточного депо (Hillman H., 1970; Frandsen A. et al., 1992; Lei S.Z. et al., 1992). За счёт кальциевой перегрузки развивается гиперактивация синтазы окиси азота (NO). При этом образуется избыточное количество NO, которая вовлекается в свободнорадикальные реакции (Akira T. et al., 1994; Zubrow A.B. et al., 2000). Таким образом, «кальциевая перегрузка» нейронов и активация Са2+- зависимых процессов (повышение активности протеаз, киназ, эндонуклеаз, липооксигеназ, фосфолипазы А2 и др. ферментов) ведет к значительным изменениям в метаболизме и генетическом аппарате клетки, неконтролируемому действию свободных радикалов и может привести к необратимой клеточной гибели (Choi D.W., 1985).
Однако, гипоксия не всегда индуцирует гибель клеток, при определенных условиях гипоксическое воздействие способно привести к нейропротективному эффекту. Существуют понятия гипоксического пре- и посткондиционирования.
Ранним (классическим) прекондиционированием принято называть повышение устойчивости органа к действию длительной ишемии-реперфузии, выполненной непосредственно после 1-3 сеансов кратковременной ишемии-реперфузии; поздним – повышение устойчивости через 24 ч после нескольких сеансов кратковременной ишемии-реперфузии (Лишманов Ю.Б. и соавт., 2006). Раннее и позднее ишемическое прекондиционирование (ИП) мозга оказывает мощный нейропротекторный эффект, механизм которого остается не вполне ясным. Эффект связывают с ограничением кальциевой перегрузки нейронов (Маслов Л.Н., 2011), с подавлением активации микроглиальных клеток, индуцирующих воспалительные реакции (Chen C.Y. et al., 2015; Parmar J., Jones N.M., 2015). Гипоксия/ишемия вызывает достоверное уменьшение количества нейронов во всех исследуемых областях головного мозга, но применение гипоксического прекондиционирования приводит к значительному снижению числа погибших нейронов в коре больших полушарий, гиппокампе и полосатом теле (Galle A.A. et al., 2013).
Гипоксическое посткондиционирование (использование кратковременных сеансов гипоксии слабой степени, проведенное после неонатального гипоксически/ишемического повреждения головного мозга) нивелирует постгипоксические нарушения, однако, механизм нейропротекторного действия также не ясен (Teo J.D. et al., 2015). Применение слабой, кратковременной гипобарический гипоксии после гипоксическо- ишемического стресса, в эксперименте in vivo на 7-суточных крысах, приводит к уменьшению снижения абсолютной массы полушарий головного мозга (Gamdzyk M. et al., 2014). Galle A.A. et al. (2013) в аналогичном эксперименте показали, что гипоксическое посткондиционирование уменьшает потери нейронов в коре больших полушарий и полосатом теле. Гипоксическое посткондиционирование улучшает структурно-функциональную реабилитацию клеток после воздействия тяжелой гипоксии: имеет место существенное увеличение уровня противоапоптотического белка Bcl-2, нейтротрофина BDNF в клетках СА1 поля гиппокампа по сравнению с постгипоксическим уровнем (Vetrovoi O.V. et al., 2014). В эксперименте, проведенном in vivo на 7-суточных крысах, установлено, что гипоксическое посткондиционирование вызывает достоверное уменьшение индекса апоптоза астроцитов; снижение уровня воспалительных медиаторов (интерлейкина -1; каспазы) (Teo J.D. et al., 2015). Защитное действие гипоксического посткондиционирования проявляется не только в отношении гипоксии/ишемии, но и в отношении посттравматических стрессовых расстройств, что указывает на универсальность механизмов нейропротективного эффекта (Zen ko M.Y. et al., 2014). Гипоксическое посткондиционирование приводит к снижению уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках головного мозга, нивелирует падение концентрации глутатиона и повышает активность глутатионпероксидазы
(Gamdzyk M. et al., 2014). Проведение пре- и посткондиционирования вызывает уменьшение концентрации внутриклеточного Ca2+, снижает накопление АФК и увеличивает порог МРТ-пор митохондриальной мембраны (Halestrap A.P. 2009; Rasola A. et al., 2010). Стимуляция толерантности головного мозга к асфиксии посредством применения пре- и посткондиционирования является перспективным методом предотвращения гипоксического повреждения головного мозга (Gamdzyk M. et al., 2014). Эффекта прекондиционирования можно добиться не только гипоксией. Некоторые фармакологические препараты имеют сходный механизм действия: активируют множество белков, ферментов, рецепторов, факторов транскрипции и биомолекул, что, в конечном итоге, приводит к генетическому перепрограммированию работы клетки (N T.V. et al., 2016).
В механизмах адаптации к гипоксии существенная роль принадлежит окиси азота (NO) (Moncada S. et al., 1991; Nathan C., Xie Q.W., 1994; Baader S.L. et al., 1997). NO является т риггером и медиатором ишемиче ского прекондиционирования (Cho S. et al., 2005). В ответ на гипоксию наблюдается резкое возрастание продукции окиси азота, что способствует поддержанию кальциевого гомеостаза клеток, защите их от гибели (Реутов В.П. и соавт., 1998; Kaur C. et al., 2008). NO является одним из основных регуляторов тонуса мозговых сосудов (Шантарина Е.Л. и соавт., 2006). Повышенная продукция NO в условиях гипоксии способствует снижению тонуса пиальных артерий головного мозга, улучшению микроциркуляции и питания нервных клеток, ингибированию образования свободных радикалов (Fleming I. et al., 1991; Allen J. D. et al., 2009).
Вместе с тем, влияние NO на нервную ткань неоднозначно: малая концентрация NO дает нейропротективный эффект, а большая – обуславливает повреждение нейронов (Горбачев В.И. и соавт., 2002; Austin S.A. et al., 2010; Liu H. et al., 2015).
Соматометрические и гравиметрические методы исследования
Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» рекомендуют как наиболее адекватный способ определения уровня тревожности и уровня исследовательской активности у лабораторных животных отряда грызунов (Григорьев Н.Р., 1996). Данная методика хорошо себя зарекомендовала (Moser P.C., 1989; Lee C. et al., 1990; Батуев А.С., Виноградова Е.П., 1994). Метод исследования основан на безусловно-рефлекторной боязни высоты, боязни открытых пространств, страха падения (Григорьев Н.Р. и соавт., 2007).
Установка представляла собой крестообразную площадку, состоящую из двух открытых рукавов и двух закрытых рукавов. Площадка находилась на подставке, которая обеспечивала подъем арены на 55 см. от уровня пола. Высота бортов закрытых («темных») рукавов составляла 30 см. Длина открытых и закрытых рукавов равна 50 см., ширина – 15 см. Вся установка выполнена из жесткого поливинилхлорида (ПВХ) и обработана покрытием, не впитывающим запах и не разрушающимся после обработки 96% этанолом. Тестирование проводили при дневном освещении с 9:00 по 13:00 часов, в закрытой аудитории (File S.E. et al., 1987; Baldwin H.A. et al., 1989; Morato S. and Castrechini P., 1989; Treit D. et al., 1993), уровень уличного шума и интенсивность дневного света не учитывали.
Тестированию подвергали 30-суточных животных обоего пола и 60-суточных крыс-самцов. При тестировании животное помещали в центр установки, поведенческие реакции фиксировали в течение 3 минут с помощью оригинальной компьютерной программы «Rat Test Version 1.0» (Сапожников Ю.А. и соавт., 2002). При тестировании регистрировали следующие параметры: время бездействия; время движения; время грумминга; время, проведенное в открытых и закрытых рукавах; количество посещений открытых и закрытых рукавов; количество свешиваний, стоек и дефекаций.
Сразу после эвтаназии у новорожденных белых крыс обоего пола и у 60-суточных крыс-самцов выделяли собственно теменную долю левого полушария головного мозга, для чего проводили разрез между переднетеменной (ПТД) и собственно теменной (СТД) долями строго перпендикулярно длиннику и верхней поверхности по схемам В.М. Светухиной (1962).
Фиксацию полученного материала проводили в жидкости Карнуа (6:3:1 – С2Н5ОН: хлороформ: ледяная уксусная кислота) (Коржевский Д.Э., 2001) в течении 1,5 часов, затем материал промывали в 2-х порциях 96% этанола, и хранили до обработки в 70% этаноле. Обезвоживание проводили в батарее восходящих спиртов. Биоптаты заливали в парафиновые блоки и готовили срезы толщиной 5-6 мкм на микротоме «Leiсa». Депарафинирование гистологических срезов проводили по общепринятой методике (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1982).
Для анализа ДНК-синтетической активности клеток неокортекса собственно-теменной доли и гиппокампа, 7-суточным животным вводили 3Н-тимидин в дозе 1 мкКюри на грамм массы (уд.активность 84 Кюри/моль) внутрибрюшинно за 1 час до выведения из эксперимента. Данный метод выявляет ядра клеток, находящиеся в S-фазе клеточного цикла, и является наиболее объективным и точным способом оценки пролиферативной активности тканей (Епифанова О.И., 1969; Андреева Л.Ф., 1983; Scholzen T., Gerdes J., 2000).
Для приготовления радиоавтографов срезы ткани помещали на обезжиренные стекла. Депарафинирование срезов осуществляли по стандартной методике. Использовали ядерную фотоэмульсию Ilford (Великобритания). Покрытие срезов фотоэмульсией осуществляли в затемненном помещении, используя фонарь малой мощности с желто-зеленым светофильтром. Фотоэмульсию расплавляли в ультратермостате при 42оС, разводили дистиллированной водой в соотношении 1:1 и наносили на препараты прямоугольной проволочной петлей. После высыхания фотоэмульсии, препараты в светонепроницаемых футлярах подвергали экспозиции в течение 28 дней при 4 C. Радиоавтографы обрабатывали проявителем Д-19, фиксировали в 33% растворе гипосульфита натрия, промывали водой и окрашивали гематоксилином Лилли-Майера. Время проявления подбирали индивидуально по пробным стеклам.
ДНК-синтетическую активность оценивали путем подсчета индекса меченых ядер ИМЯ (%). Индекс меченых ядер (ИМЯ) оценивали как отношение количества ядер, меченых 3Н-тимидином, к общему количеству просмотренных ядер, выраженное в процентах. Мечеными считали ядра, над которыми проецировалось 5 и более треков. Для оценки ИМЯ просматривали не менее 1000 ядер клеток неокортекса и поля СА1 гиппокампа. Микроскопирование проводили с помощью микроскопа «Jenalumar» (Германия), иммерсионного объектива 90х, окуляра 10х.
Влияние антенатальной гипоксии на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа 60-суточных белых крыс
Таким образом, антенатальная гипоксия имеет отдаленные структурные церебральные последствия в виде существенного снижения кариометрических показателей и параметров ядрышкового аппарата клеток головного мозга половозрелых белых крыс. Количество ядрышек в ядрах нейронов имеет прямую корреляционную связь с синаптической активностью клеток (Politz J.C. et al., 2009). Возможно, уменьшение количества ядрышек в нейронах после воздействия антенатальный гипоксии обусловлено снижением синаптической активности нейронов, что может носить компенсаторный защитный характер в условиях оксидативного стресса. Кроме того, показано, что репрессия ядрышкового аппарата в незрелых нейронах может быть необходимым элементом их дифференцировки (Parlato R. et al., 2013).
В проведенных нами исследованиях, у животных различных возрастных периодов (1-,7- и 60-суточных крыс), перенесших антенатальную гипоксию, количественные изменения ядрышек в ядрах клеток происходили преимущественно во II слое неокортекса и поле СА1 гиппокампа. Этот факт согласуется с данными литературы о наибольшей чувствительности этих топографических областей головного мозга к действию гипоксии/ишемии (Silver
Влияние антенатальной гипоксии на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге белых крыс позднего антенатального периода и раннего неонатального возраста Анализ ХМЛ-показателей гомогенатов головного мозга 20-суточных плодов белых крыс и 1-суточных животных (таблица 10) продемонстрировал, что антенатальная гипоксия интенсифицировала свободнорадикальное окисление (СРО) в тканях головного мозга: величина Sсп. возросла в 1,88 и 3,22 раза, соответственно. Значительно активировалось перекисное окисление липидов, о чем свидетельствуют: увеличение концентрации гидроперекисей (амплитуда Н1 возросла в 1,78 и 1,91 раза, соответственно) и ускорение образования перекисных радикалов (величина Sинд.1 возросла в 2,43 и 3,32 раза, соответственно). Выявлено ослабление антиоксидантной защиты (величина Sинд.2 возросла в 2,16 и 2,98 раза, соответственно) и снижение резистентности к перекисному окислению (амплитуда Н2 увеличилась в 2,02 и 2,81 раза, соответственно). Полученные нами данные свидетельствуют об активации процессов перекисного окисления липидов и угнетении антиоксидантной защиты в фетальном и неонатальном головном мозге после гипоксического воздействия.
Интересно, что у 1-суточных животных изменения свободнорадикального окисления были значительно более выражены, чем у 20-суточных плодов, хотя в более отдаленные сроки можно было бы ожидать нормализации исследуемых показателей. Этот вопрос требует дополнительного исследования. 3.1.4.2. Влияние антенатальной гипоксии на процессы свободнорадикального окисления в головном мозге 60-суточных белых крыс
Анализ ХМЛ-показателей гомогенатов головного мозга 60-суточных животных (таблица 11) продемонстрировал, что антенатальная гипоксия интенсифицировала СРО в тканях головного мозга крыс: величина Sсп. возросла 1,86 раза. Значительный вклад в этот процесс вносит активация перекисного окисления липидов, о чем свидетельствуют: увеличение концентрации гидроперекисей (амплитуда Н1 возрасла в 1,83 раза) и ускорение образования перекисных радикалов (величина Sинд.1 возросла в 2,10 раза). Выявленные нарушения свободнорадикального статуса обусловлены ослаблением антиоксидантной защиты (величина Sинд.2 возросла в 1,37 раза соответственно) и снижением резистентности к перекисному окислению (амплитуда Н2 увеличилась в 1,65 раза). Таблица 11 Хемилюминисцентный анализ гомогенатов головного мозга 60-суточных крыс-самцов, подвергнутых антенатальной гипоксии Параметр Контроль Антенатальная гипоксия Sсп (отн. ед) 0,10 ± 0,01 0,19 ± 0,02 Инд. ХМЛ (Fe2+) Н1 (отн. ед.) 0,65 ± 0,03 1,19 ± 0,06 Sинд.1 (отн.ед.) 0,41 ± 0,03 0,84 ± 0,06 Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2) Н2 (отн. ед.) 1,41 ± 0,04 2,32 ± 0,07 Sинд.2 (отн.ед) 2,94 ± 0,09 4,05 ± 0,27 Примечание: – р 0,05 по отношению к группе «Контроль».
Таким образом, антенатальная гипоксия с 14 по 19 сутки гестации индуцирует длительную активацию свободнорадикальных процессов в головном мозге плодов, а также животных раннего и отдаленного периода постнатального онтогенеза. Выявленные изменения свободнорадикального статуса расцениваются как наличие оксидативного стресса на органном уровне.
Это может привести к структурно-функциональной дестабилизации клеточных мембран и подавлению анаболических процессов в клетках головного мозга (Mover - Lev H. et al 1997; Maiti P. et al., 2006). Следует отметить, что наибольшие изменения показателей СРО были зарегистрированы у новорожденных животных подопытной группы. Это, возможно, обусловлено большим количеством ненасыщенных жирных кислот в головном мозге животных раннего периода постнатального онтогенеза (Тюлькова
Новорожденные животные, перенесшие антенатальную гипоксию, достоверно хуже выполняли тест отрицательного геотропизма (таблица 12). У 1-суточных животных, перенесших антенатальную гипоксию, наблюдали достоверное уменьшение угла поворота в 1,7 раза. Также, воздействие антенатальный гипоксии достоверно (в 2,8 раза) снижало количество односуточных животных, способных к полному повороту (180), в тесте отрицательного геотропизма. Анализ теста отрицательного геотропизма в баллах по Н.М. Дубровской и И.А. Журавину (2008) показал, что средний балл подопытных животных был достоверно (на 36,70%) ниже аналогичного показателя животных группы «Контроль».
Отчетливая статистическая тенденция к снижению показателей выполнения теста отрицательного геотропизма сохранялась до 5 суток постнатального развития: угол поворота 5-суточных животных, перенесших антенатальную гипоксию, был в 1,35 раза меньше показателя контрольных животных (р = 0,09) (таблица 12). 7-суточные подопытные животные не отличались по показателям теста отрицательного геотропизма от контрольных животных, что свидетельствует об окончании формирования реакции поворота к возрасту 7-ми суток жизни (Тюлькова Е.И., 2015). Полученные нами данные согласуются с данными других авторов (Waddell J. et al., 2015). 7-суточные животные, перенесшие антенатальную гипоксию, имели достоверно меньшее время удержания (на 48,32%) в тесте «Вис на горизонтальной проволоке», по сравнению с животными контрольной группы (Таблица 12). Полученные нами данные также согласуются с описанными в литературе (Карасев А.В. и соавт., 2010; Отеллин В.А. и соавт., 2012). По данным Карасева А.В. и соавт. (2010), гипоксия/ишемия головного мозга приводит к существенному снижению способности крыс удерживаться на струне в тесте «Вис на горизонтальной проволоке» в течение как первых недель жизни, так и в последующие отдаленные периоды постнатального онтогенеза.
Влияние раннего постнатального введения даларгина на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс в возрастной динамике
Таким образом, введение пептида НАЛЭ на фоне последствий антенатальной гипоксии не корректировало индуцированные гипоксическим воздействием снижения массы тела и абсолютной массы полушарий мозга 7-суточных животных. Вместе с тем, относительная масса полушарий головного мозга животных группы «Антенатальная гипоксия + НАЛЭ» не имела достоверных отличий от контроля.
При исследовании массы тела 30-суточных животных подопытной группы без разделения по гендерному признаку мы выявили достоверное увеличение показателя (таблица 35), что аналогично эффекту, зарегистрированному при введении пептида даларгин (Глава 3.3.1.1.).
У 60-суточных белых крыс, подвергнутых воздействию антенатальной гипоксии и неонатальному введению пептида НАЛЭ, было выявлено достоверное уменьшение абсолютной массы полушарий головного мозга на 8% (таблица 36). Эффект был сходен с изменением абсолютной массы полушарий головного мозга, индуцированным антенатальной гипоксией. Вместе с тем, показатель массы тела у животных этой подопытной группы не имел достоверных отличий от контрольного параметра, что свидетельствует о частичной коррекции последствий антенатальной гипоксии.
Результаты анализа гравиметрических показателей выявили значительное сходство эффектов пептидов даларгин и НАЛЭ при их использовании в раннем постнатальном периоде после антенатальной гипоксии. Однако, в отличие от опиоидного пептида даларгина, пептид НАЛЭ, лишенный опиоидной активности, не вызывал снижения относительной массы полушарий головного мозга у 7-суточных подопытных животных и нормализовал массу тела 60-суточных животных, подвернутых антенатальной гипоксии.
3.3.2. Влияние неонатального введения биологически активных пептидов группы опиоидов на процессы синтеза ДНК в неокортексе и гиппокампе 7-суточных белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии
У животных, подвергнутых воздействию антенатальной гипоксии и неонатальному введению регулярных пептидов, мы выявили достоверное увеличение ДНК-синтетической активности клеток неокортекса и гиппокампа по отношению к показателям контрольной группы: для пептида НАЛЭ это увеличение составило 28,6% и 171,2%, соответственно; для даларгина – 44,2% и 191,8%, соответственно (таблица 37).
Таким образом, пятикратное введение регуляторных пептидов с 2-х по 6-е сутки жизни нивелировало угнетение синтеза ДНК в нейрональных структурах, индуцированное антенатальной гипоксией (Глава 3.1.2.). Более того, даже после перенесенной антенатальной гипоксии, реализовалось стимулирующее влияние пептидов на пролиферативные процессы в гиппокампе животных на раннем этапе постнатального онтогенеза. Выявленная нами стимуляция ДНК-синтетических процессов в неокортексе животных, подвергнутых введению пептидов на фоне перенесенной антенатальной гипоксии, требует дальнейшего изучения.
Влияние раннего постнатального введения пептида даларгин на кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа белых крыс, подвергнутых антенатальной гипоксии Морфометрические показатели площади сечения ядра и суммарной площади сечения ядрышек в ядрах клеток исследованных зон головного мозга у 7-суточных животных подопытных групп не отличались от контрольных параметров (таблица 38). При изучении количества ядрышек, было выявлено, что неонатальное введение даларгина на фоне последствий антенатальной гипоксии достоверно уменьшало этот показатель всех исследованных зон головного мозга у 7-суточных животных (таблица 38). Интересно, что внутриутробное гипоксическое воздействие (группа «Антенатальная гипоксия») вызывало статистически значимое уменьшение количества ядрышек только в клетках II слоя неокортекса собственно теменной доли. Таким образом, неонатальное введение даларгина усугубило постгипоксические изменения ядрышкового аппарата клеток головного мозга 7-суточных белых крыс.
Кариометрические показатели и параметры ядрышкового аппарата неокортекса и гиппокампа 7-суточных животных, подвергнутых воздействию антенатальной гипоксии и неонатальному введению пептида даларгин Площадьсечения ядра(мкм2) Суммарнаяплощадьсеченияядрышек(мкм2) Количество ядрышек II слой неокортекса собственно теменной доли Контроль (п= 10) 28,39 ± 1,74 2,85 ± 0,11 1,98 ± 0,09 Антенатальная гипоксия (п = 10) 29,56 ± 2,07 3,21 ± 0,19 1,60 ± 0,02 Антенатальная гипоксия + даларгин (п = 10) 26,88 ± 0,55 2,85 ± 0,14 1,63 ± 0,04 V слой неокортекса собственно теменной доли Контроль (п= 10) 52,58 ± 3,83 4,13 ± 0,35 1,46 ± 0,06 Антенатальная гипоксия (п = 10) 54,72 ± 2,60 4,74 ± 0,26 1,35 ± 0,05 Антенатальная гипоксия + даларгин (п = 10) 48,86 ± 1,71 4,20 ± 0,19 1,21 ± 0,02 поле СА1 гиппокампа Контроль (п= 10) 30,58 ± 2,09 3,42 ± 0,05 1,92 ± 0,08 Антенатальная гипоксия (п = 10) 25,18 ± 1,76 3,04 ± 0,28 1,81 ± 0,06 Антенатальная гипоксия + даларгин (п = 10) 27,11 ± 1,21 3,04 ± 0,17 1,52 ± 0,06 Примечание: — р 0,01; — р 0,001 по отношению к группе «Контроль».
При анализе кариометрических показателей и параметров ядрышкового аппарата у 60-суточных животных, подвергнутых антенатальной гипоксии и введению с 2-х по 6-е сутки жизни пептида даларгин, мы выявили эффекты, представленные в таблице 39. По показателю площади сечения ядра имела место нормализация показателя в клетках V слоя неокортекса собственно теменной доли. По суммарной площади сечения ядрышек, мы выявили полное нивелирование постгипоксического уменьшения параметра в ядрах клеток II слоя неокортекса собственно теменной доли и поля СА1 гиппокампа, а также частичное нивелирование эффекта гипоксии в ядрах клеток V слоя неокортекса собственно теменной доли. По количеству ядрышек, была выявлена нормализация параметра в ядрах клеток поля СА1 гиппокампа. Интересно, что в ядрах клеток II слоя собственно теменной доли мы наблюдали «гиперкомпенсацию»: в группе «Антенатальная гипоксия + даларгин» имело место достоверное повышение параметра, в то время как антенатальная гипоксия индуцировала снижение названного показателя.