Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Общие представления о «взаимоотношениях» макрофагов и микобактерий в патогенезе туберкулезного гранулематозного воспаления 12
1.1.1. Блокирование элементов фагоцитоза микобактериями 14
1.1.2. МАО(Р)Н-оксидазная продукция АКМ и микобактерия 16
1.1.. Антигенпрезентация в инфицированных Mtb макрофагах 17
1.1.4. Апоптоз и презентация Mtb антигенов 18
1.1.5. Вклад аутофагии в уничтожение микобактерий и антигенпрезентацию 18
1.. Редокс-чувствительная сигнальная система Keapl/Nrf2/ARE 19
1..1. Компоненты сигнального пути Keapl/Nrf2/ARE 20
1... Механизмы регуляции сигнального пути Keapl/Nrf2/ARE 22
1.. Фармакологические индукторы Nrf2 32
1.4. Сигнальная система Keapl/Nrf2/ARE как терапевтическая мишень 36
1.5. Nrf и инфекционные агенты 38
1.6. Влияние Nrf на поляризацию макрофагов 42
ГЛАВА . Материалы и методы
ГЛАВА . Собственные результаты и их обсуждение 52
.1. Результаты исследования влияния индукции редокс-чувствиетльной сигнальной системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на развитие гранулематозного туберкулезного воспаления in vivo 52
.1.1. Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на процесс туберкулезного гранулемогенеза in vivo 52
.1.. Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на активность свободнорадикальных процессов in vivo 54
.1.. Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 in vivo на экспрессию генов, подконтрольных Nrf и участвующих в патогенезе туберкулезного гранулематозного воспаления 56
.. Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на активацию макрофагов in vitro 66
3.3. Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 на формирование гранулем in vitro 74
Заключение 81
Выводы 84
Список литературы 85
- Блокирование элементов фагоцитоза микобактериями
- Редокс-чувствительная сигнальная система Keapl/Nrf2/ARE
- Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на процесс туберкулезного гранулемогенеза in vivo
- Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на активацию макрофагов in vitro
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез является одним из наиболее
смертельных инфекционных заболеваний человека. По данным ВОЗ, в 2014 году 9,6 миллиона человек заболели туберкулезом, 1,5 миллиона человек умерли от него и около одной трети человечества имеет латентную туберкулезную инфекцию [WHO Tuberculosis; Fact sheet N 104, 2015].
Появление лекарственно устойчивых форм туберкулеза, вызванных резистентными к антибактериальным препаратам штаммами микобактерий, заставило фтизиатров начать поиск новых «организм-ориентированных» ("host-targeted") адъювантных стратегий лечения [Ejim L. et al., 2011; Kuijl C. et al., 2007; Schwegmann A. et al., 2008; Singhal A. et al., 2014; Zumla A. et al., 2013] и вспомнить о патогенетических средствах, влияющих на иммунный статус (левамизол, этимизол и др.), на формирование соединительной ткани (преднизолон, пирогенал, лидаза) и обладающих антиоксидантным и защитным действием (-токоферол, тиосульфат натрия).
Особого внимания заслуживает новое направление репрограммирования макрофагов, в том числе в области туберкулезной гранулемы, с помощью цитокинов и иммуномодуляторов, а также воздействий на определенные сигнальные системы и ключевые факторы транскрипции: NF-B, АР-1, STAT, PPAR и Nrf2 [Galvan-Pena S., 2014; Lyamina S.V. et al., 2012; Stefanson A.L. et al., 2014; Tugal D. et al., 2013].
Редокс-чувствительная сигнальная система антиоксидант-респонсивного
элемента (система Keap1/Nrf2/ARE) играет существенную роль в эндогенной
защите, способствуя нейтрализиции повреждающего воздействия
прооксидантов и электрофильных молекул и контролируя выраженность
окислительного стресса [Dinkova-Kostova A.T. et al., 2008] – важнейшего
патогенетического звена многих заболеваний, в том числе воспалительной
природы [Rajendran P. et al., 2014]. Известна роль этой системы в модуляции
резистентности организма к различным инфекциям: ее активация
препятствует проникновению и репликации вируса гриппа А [Kesic M.J. et al., 2011; Kosmider B. et al., 2012], иммунодефицита человека [Furuya A.K.M. et al., 2016], способствует повышению резистентности к различным бактериальным агентам (Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa) [Harvey C.J. et al., 2011; Nairz M. et al., 2013].
Фенольные антиоксиданты занимают важное место в биологических
системах среди ингибиторов радикалов, некоторые из них (трет-
бутилгидрохинон, кверцетин, куркумин и др.) способны усиливать
антиоксидантную защиту не только прямо, но и опосредованно, через
индукцию системы Keap1/Nrf2/ARE. В природе существуют тысячи
фенольных антиоксидантов (только флавоноидов насчитывается более 5000),
характерным недостатком которых является слабая растворимость в водных
растворах, что отрицательно влияет на биодоступность, поэтому
продолжаются попытки создать новые соединения с заданными свойствами, что даст те или иные преимущества в зависимости от стоящих задач
[Меньщикова Е.Б. и др., 2012].
Ранее синтезирован ряд схожих по структуре водорастворимых
монофенолов, изучена их антиоксидантная активность [Просенко А.Е. и др.,
2001; Zenkov N.K. et al., 2007]. Исследованные фенольные антиоксиданты
оказывали противовоспалительное действие в отношении острого воспаления
(отек лапы), острого системного асептического воспаления и
эндотоксинового шока, а также хронического асептического воспаления («воздушный мешок»). Защитное действие в отношении воспалительных процессов связано со способностью соединений индуцировать систему антиоксидант-респонсивного элемента [Меньщикова Е.Б. и др., 2013; Menshchikova E.B. et al., 2014], наибольшую активность проявлял оригинальный синтетический водорастворимый монофенол 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил) пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) [Лемза А.Е., 2014]
Степень разработанности темы исследования. У больных
туберкулезом наблюдают высокий уровень маркеров окислительного стресса
и снижение концентрации антиоксидантов [Vijayamalini M. et al., 2004].
Однако работ, направленных на изучение роли редокс-чувствительной
сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в патогенезе туберкулезного
гранулематозного воспаления, крайне мало [Saha G.K. et al., 2014]: так, отклик на поисковый запрос в базе данных PubMed «(Nrf2 OR Keap1) AND tuberculosis» составляет 7 публикаций.
Анализ приведенных литературных данных [Mizuno S. et al., 2010; Palanisamy G.S. et al., 2011] позволяет предположить, что редокс-чувствительная сигнальная система Keap1/Nrf2/ARE может принимать участие в патогенезе туберкулезного гранулематозного воспаления, а ее активация с помощью различных веществ и последующее снижение продукции активированных кислородных метаболитов (АКМ) за счет увеличения экспрессии эндогенных антиоксидантов может снижать деструктивные изменения в органах. Однако взаимосвязь и механизм этих изменений при туберкулезном гранулематозном воспалении остаются мало изученными.
В соответствии с вышеизложенным были сформулированы цель и задачи настоящей работы.
Цель настоящего исследования – изучить влияние индукции редокс-
чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента
Keap1/Nrf2/ARE оригинальным синтетическим водорастворимым
монофенолом ТС-13 на развитие туберкулезного гранулематозного
воспаления.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенола ТС-13 на выраженность гранулематозного воспаления в эксперименте in vivo.
-
Исследовать влияние индукции сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 на продукцию активированных кислородных
метаболитов в печени и перитонеальными макрофагами в модели туберкулезного гранулематозного воспаления у мышей in vivo.
-
Изучить воздействие индукции сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 на экспрессию ARE-зависимых генов и генов транскрипционных факторов, принимающих участие в развитии туберкулезного гранулематозного воспаления.
-
Исследовать влияние индукции сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 на активацию макрофагов in vitro.
-
Оценить влияние индукции сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 на формирование туберкулезных микобактериальных гранулем in vitro.
Научная новизна работы
Впервые показано, что редокс-чувствительная сигнальная система антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE принимает участие в патогенезе туберкулезного гранулематозного воспаления. Исследование оригинального синтетического водорастворимого монофенола ТС-13 в качестве индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE впервые позволило установить, что ее активация обладает протективным эффектом в отношении туберкулезного гранулематозного воспаления, способствуя уменьшению размеров и численной плотности гранулем в печени инфицированных БЦЖ мышей. Обнаружено, что ТС-13 препятствует формированию рефрактерного фенотипа макрофагов, уменьшает стационарную концентрацию АКМ в тканях и количество нейтрофилов на ранних этапах формирования гранулем, тем самым снижая риск развития деструктивных изменений.
На мононуклеарных фагоцитирующих клетках перитонеального экссудата мышей показана способность индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенола ТС-13 влиять на активацию макрофагов in vitro: воздействие ТС-13 в присутствии праймирующих агентов (IFNy+LPS или БЦЖ) приводило к повышению продукции микробицидного фактора макрофагов (оксида азота) и экспрессии костимулирующей молекулы (CD86).
Впервые на модели гранулематозного туберкулезного воспаления in vitro показана способность индуктора сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенола ТС-13 стимулировать процесс "диссоциации" гранулем, выражающейся в уменьшении их размеров и изменении клеточного представительства.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты, полученные в экспериментах in vivo на модели туберкулезного гранулематозного воспаления, свидетельствуют о наличии реципрокной зависимости между активностью редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE с одной строны и процессами формирования гранулем и локальной продукцией активированных кислородных метаболитов - с другой. Полученные данные существенно дополняют представления о механизмах
патогенеза гранулематозного туберкулезного воспаления и о характере участия в нем сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE – мастер-регулятора редокс-гомеостаза клеток и тканей.
Полученные в ходе исследования данные позволяют рекомендовать 3-(3'-
трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия (ТС-13) для
дальнейшего изучения в качестве перспективного средства вспомогательной
терапии туберкулезного гранулематоза в связи с выявленной способностью
соединения не только уменьшать количество, размеры гранулем и
представленность в них нейтрофилов, но и стимулировать неспецифический
иммунный ответ и микробицидный потенциал макрофагов. При этом
действие ТС-13 не связано с ингибированием самого процесса образования
туберкулезных гранулем, но способствует их "диссоциации" и,
следовательно, уменьшению рисков деструктивных процессов.
Положения, выносимые на защиту
-
Развитие туберкулезного гранулематозного воспаления сопровождается снижением уровня транскрипции Nrf2, локализацией Nrf2 преимущественно в цитоплазме, снижением экспрессии Nrf2-зависимых генов, что свидетельствует о низкой функциональной активности редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE. Это сопровождается формированием рефрактерного фенотипа макрофагов.
-
Активность редокс-чувствительной сигнальной системы антиоксидант-респонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE необходима для активации макрофагов и продукции ими микробицидных факторов.
3. Снижение масштаба туберкулезного гранулематозного воспаления
(уменьшение размеров и количества гранулем без их некроза) при индукции
сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE монофенолом ТС-13 связано с
увеличением микробицидных свойств макрофагов (увеличение
выраженности «дыхательного взрыва», продукции оксида азота, экспрессии
костимулирующей молекулы CD86), что способствует «диссоциации»
гранулем, но не ингибированию гранулемогенеза.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены
на Десятой юбилейной международной конференции "Окислительный стресс
и свободнорадикальные патологии" (Пицунда, 2014), Седьмой
Всероссийской научно-практической конференции "Фундаментальные
аспекты компенсаторно-приспособительных процессов" (Новосибирск,
2015), Молодежном симпозиуме «Молекулярно-клеточные и медико-экологические проблемы компенсации и приспособления» (Новосибирск, 2015), IX Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2015), Biochemical Society Focused Meeting "The Keap1/Nrf2 Pathway in Health and Disease" (Cambridge, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации материалов диссертационных исследований.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав,
включающих обзор литературы, описание материала и методов
Блокирование элементов фагоцитоза микобактериями
Окислительно-восстановительные реакции являются жизненно важным компонентом нормальных физиологических процессов, в результате чего организм подвергается воздействию большого количества прооксидантов и электрофильных веществ. Нарушение равновесия между биохимическими процессами, ведущими к образованию прооксидантов и электрофилов и веществ, их связывающих (обезвреживающих), называют окислительным стрессом [53]. Окислительный стресс может быть вызван избытком АКМ, к которым относят активные формы кислорода (АФК) и азота (АФА), образованных эндогенным или экзогенным путем. К экзогенным источникам АКМ относят различные химические вещества, радиацию и др., к эндогенным - вещества, участвующие во внутриклеточных процессах, таких как внутриклеточный сигналинг, метаболические процессы, которые происходят с окислительно-восстановительными реакциями [53, 339]. АФК включают в себя супероксидный анион-радикал (Ог), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (ОН) и синглетный кислород ( Ог). К АФА относят пероксинитрит (ONO2) и оксид азота (N0 ) [53, 339]. АКМ образуются в организме в результате как физиологических процессов, таких как аэробное дыхание в митохондриях, так и в патофизиологических условиях (например, во время воспалительного ответа для защиты от патогенов), кроме того они являются важными сигнальными молекулами. Устойчивое повышение генерации АКМ наблюдали при воспалении, процессах старения и ряде заболеваний, таких как рак, диабет, атеросклероз, артериальная гипертензия, болезнь Альцгеймера [220, 339]. Возрастание стационарной концентрации АКМ может вызывать повреждение ДНК и различных клеточных структур, для защиты от которого служат внутри- и внеклеточные антиоксидантные и цитопротективные механизмы [98].
Антиоксидантная защитная система клеток является важнейшим протективным механизмом для нейтрализиции повреждающего воздействия прооксидантов и электрофильных молекул [98]. Низкомолекуоярные антиоксиданти представлены широким спектром эндо- и экзогенных соединеий, таких как глутатион, витамины С и А, липоевая кислота, токоферолы, убихинол, флавоноиды и другие полифенольные соединения [98]. Кроме того, существуют различные энзимы, которые обеспечивают более эффективную каталитическую детоксификацию АКМ (непосредственно антиоксидантные ферменты: супероксиддисмутазы (SOD), глутатионпероксидазы (GPx), глутатион-Б-трансферазы (GST), каталаза, тиоредоксин (TRX)), устраняют потенциальные источники возникновения АКМ (NAD(P)H хинон оксидоредуктаза 1 (NQ01), гемоксигеназа-1 (НО-1)), синтезируют или восстанавливают глутатион (глутаматцистеинлигаза (GCL), глутатионредуктаза) [98, 236]. Эти ферменты имеют относительно высокую продолжительность жизни, могут катализировать широкий круг реакций детоксикации и участвуют в пополнении антиоксидантных молекул с малой молекулярной массой [98]. Экспрессия большинства антиоксидантных цитопротективных ферментов контролируется транскрипционным путем, ключевыми компонентами которого являются антиоксидант-респонсивный элемент (ARE), транскрипционный фактор Nrf2 и его ингибитор Keapl [98, 241].
ARE, также известный как электрофил-респонсивный элемент (EpRE), является cis-регуляторным элементом или энхансерной нуклеотидной последовательностью, которые находятся в промоторном регионе большого количества генов, кодирующих ферменты детоксикации и цитопротективные белки [215]. Под воздействием АКМ стабилизированный Nrf2 транслоцируется из цитоплазмы в ядро, формирует гетеродимер с Maf, связывается с сайтами ARE и активирует транскрипцию таргетных генов [188, 215, 253]. Регуляция связывания с сайтами ARE осуществляется с помощью транскрипционного репрессора Bachl. В обычных условиях Bachl образует димеры с белком Maf, препятствуя связыванию Nrf2 с ДНК. В ответ на индукторы ARE Bachl экспортируется из ядра и подвергается протеасомной деградации. роль в поддержании клеточного гомеостаза [227], относится к семейству CNC (cap n collar) и имеет мотив bZip (basic leucine zipper) для связывания с ДНК [271]. Nrf2 содержит 7 функциональных доменов Nehl-7 (Nrf2-ECH homology domains) [166]. Домен Nehl содержит мотив bZip и необходим для димеризации с Maf и связывания с ДНК [165]. Кроме того, ДНК-связывающий домен внутри Nehl содержит последовательность, необходимую для ядерной локализации Nrf2 (nuclear localization sequence, NLS) [172]. Домен Neh2 (основной регуляторный домен) находится в N-концевом регионе белка и служит для негативной регуляции активности Nrf2. Он содержит мотивы DLG и ETGE, необходимые для образования комплекса Nrf2 с двумя молекулами Keapl [179, 186]. Присутствие семи лизиновых остатков внутри Neh2 делает возможной отрицательную регуляцию активности Nrf2 за счет прот протеасомной деградации [441]. Домен Neh2 содержит сериновые остатки (Ser40), фосфорилирование которых приводит к диссоциации связей в комплексе Nrf2/Keapl и препятствует, таким образом, Keapl-зависимому убиквитинированию Nrf2, не влияя при этом на стабилизацию Nrf2 или его аккумуляцию в ядре [227]. Домен Neh3 находится на С-концевом регионе белка, он взаимодействует с транскрипционным коактиватором CHD6, необходимым для трансактивации ARE-зависимых генов [285]. Домены Neh4 и Neh5 служат для связывания с белком СВР (сАМР response element binding (CREB) protein), который является коактиватором для многих транскрипционных факторов [187]. Кроме того, домены Neh4 и Neh5 взаимодействуют с ядерным кофактором RAC3/AIB1/SRC-3 и усиливают экспрессию Nrf2/ARE-3aBHCHMbix генов [195]. В Neh5 находится редокс-чувствительный мотив, который регулирует внутриклеточную локализацию Nrf2 [225]. Серин-богатый домен Neh6 содержит два мотива (DSGIS и DSAPGS), которые взаимодействуют с Р-ТгСР, являющимся субстрат-рецептором (адаптером) для убиквитинлигазного комплекса Skpl-Cull-Rbxl/Rocl. Мотивы DSGIS и DSAPGS домена Neh6 необходимы для контроля стабильности Nrf2: GSK-3 фосфорилирует Nrf2 по этим доменам, после чего они распознаются адаптерным белком Р-ТгСР, что ведет к Кеар-1-независимой убиквитин-протеасомной деградации Nrf2 [85, 187, 254]. Домен Neh7 взаимодействует с ядерным рецептором RXRa. Прямое взаимодействие между Nrf2 и RXRa в промоторе ингибирует экспрессию ARE-зависимых генов [410].
Редокс-чувствительная сигнальная система Keapl/Nrf2/ARE
Исследование проводили на мышах-самцах линии BALB/c двухмесячного возраста массой тела 18-22 г, полученных из вивария Института иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск). Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Генерализованный туберкулезный гранулематоз моделировали однократным введением в хвостовую вену 0,5 мг вакцины БЦЖ в 0,2 мл изотонического водного раствора NaCl [14, 15, 59]. Животные были разделены на три группы, по 6-Ю особей в каждой: "контроль" (интактные мыши, которым внутривенно вводили 0,2 мл изотонического водного раствора NaCl), группа сравнения ("БЦЖ" -мыши, инфицированные вакциной БЦЖ) и подопытная группа ("БЦЖ + ТС-13" - мыши, в течение 30 дней после инъекции вакцины БЦЖ получавшие с питьевой водой ТС-13 из расчета 100 мг/кг массы тела в сутки).
Мышей выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе через 30 суток после инфицирования, когда в печени уже формировались типичные гранулемы. Получали перитонеальный экссудат промыванием брюшной полости холодной культуральной средой RPMI-1640, затем вскрывали брюшную полость и проводили эвисцерацию печени. Печень взвешивали, забирали образцы тканей для гистологического и иммуногистохимического исследований и приготовления гомогенатов.
Для светооптического исследования полученный материал после фиксации в 10%-м водном растворе нейтрального формалина обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации и ксилолов с последующим заключением в парафин. Из этих образцов печени изготавливали срезы толщиной 4-5 мкм и окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином, наличие Mycobacterium bovis подтверждали с помощью специфического гистохимического метода окраски по Цилю - Нильсену. Методом морфометрии с помощью закрытой тестовой системы площадью 3,64 х 105 мкм2 на 100 точек и инструментов программы AxioVision (rel. 4.12) на микроскопе Axiolmager Al ("Carl Zeiss", Германия) определяли численную плотность (Nai), диаметр и клеточный состав гранулем.
Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования полученный материал после фиксации в 10%-м водном растворе нейтрального формалина обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации и ксилолах, затем помещали в парафиновую среду («HISTOMIX», Россия). Срезы толщиной 3,5 мкм готовили на ротационном микротоме («Microm», Германия). Для проведения ИГХ-исследования [206] срезы подвергали депарафинизации, регидратации, демаскировке антигенов в микроволновой печи мощностью 700 Вт. Время экспозиции с первичными антителами к Nrf2 составляло 30 мин при температуре 37С. Затем срезы инкубировали с пероксидазным комплексом, DAB-субстратом и дополнительно докрашивали гематоксилином Майера. Срезы изучали с помощью микроскопа Axiolmager А1 с фотокамерой AxioCamMRc5 (Carl Zeiss, Германия).
Описанную методику применяли при выполнении Задачи №1, №2. Для исследования продукции АКМ в гомогенатах печени в условиях термостатирования при 37С регистрировали спонтанную хемилюминесценцию (ХЛ) гомогенатов печени (200 мг/мл бесцветной среды Хенкса), усиленную люминолом (5 нМ) и НгОг-индуцированную (39,5 мМ) люминол-зависимую [21]. Интенсивность ХЛ выражали в условных единицах, каждую величину усредняли и нормировали на контроль.
Спонтанную и индуцированную РМА продукцию АКМ клетками перитонеального экссудата определяли по флуоресценции DCF [37]. Для исследования индуцированной продукции АКМ клетки перитонеального экссудата предварительно инкубировали 60 мин в культуральной среде RPMI-1640 при 37С с добавлением 100 нМ РМА. Для исследования спонтанной и индуцированной продукции АКМ клетки центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин, ресуспендировали в 1 мл бесцветной среды Хенкса с добавлением 10 мкМ H2-DCF-DA и инкубировали 45 мин. Клетки отмывали раствором PBS, клеточную суспензию помещали в пробирки для цитометрии и измеряли интенсивность DCF-зависимой флуоресценции (ХЕш = 488 нм, ХЕх = 520 нм) на проточном цитофлуориметре FACSCalibur («Becton-Dickinson», США) с использованием програмного обеспечения CellQuest. Результаты выражали в виде относительных единиц - отношений величин интенсивности флуоресценции клеток к принятой за 1 усредненной величине спонтанной DCF-зависимой флуоресценции в контроле.
РНК выделяли с использованием TRIzol Reagent согласно инструкции. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию с использованием набора реагентов iScript cDNA Syntesis Kit согласно инструкции. Изменения экспрессии мРНК генов (Таблица 1) исследовали методом TaqMan ПЦР [142] в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Реакцию амплификации проводили в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP4s, 1,25 е.а. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили согласно следующей программе: 3 мин при 95С начальной денатурации, далее 40 циклов: 10 с при 95 С для денатурации, 20 с при 60 С для гибридизации праймеров, съем флуоресцентного сигнала, 20 с при 72 С для элонгации. Уровень экспрессии мРНК генов нормировали относительно референсного гена Gapdh. Уровень экспрессии рассчитывали согласно методу Pfaffl [304]. Подобранные пары праймеров (forward и reverse) и TaqMan-зондов приведены в таблице 1.
Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на процесс туберкулезного гранулемогенеза in vivo
Спустя 30 дней после индукции инфекционного процесса наблюдали обратную корреляционную связь между выраженностью гранулематозного процесса (диаметр гранулем), продукцией АКМ и экспрессией Becnl (таблица 2). Это согласуется с наблюдением, что хроническое воспаление сопровождается снижением экспрессии Becnl, в частности у пациентов с хроническим воспалением и легочным фиброзом или у мышей при длительном воздействии LPS [113, 321]. Becnl кодирует белок беклин-1, регулирующий процессы аутофагии. Кроме того, этот белок является компонентом РІЗК-комплекса класса III, участвующего в везикулярном транспорте (внутриклеточном транспорте везикул от одного компартмента к другому). Наблюдаемая тенденция к снижению экспрессии Becnl может являться отражением формируемого микобактерией нарушения созревания эндосом и слияния их с лизосомами [228]. Изменения в экспрессии Becnl сопровождаются изменениями в экспрессии ЬСЗЬ, кодирующего белок-маркер аутофагосом LC3b. При этом экспрессия Becnl положительно коррелировала с экспрессией Nrf2 и №г2-подконтрольных генов, а также субъединицы р65 (RelA\ отражающей классическую активацию NF-кВ (таблица 2). Следует отметить, что экспрессия генов, участвующих в процессах аутофагии, не полностью отражает активность самой аутофагии [198], так как изменения в их экспрессии имеют ограниченный характер [249]. Полученные данные позволяют предположить, что снижение выраженности туберкулезного гранулематозного воспаления при индукции системы Keapl/Nrf2/ARE может быть опосредовано эрадикацией микобактерий за счет усиления процессов фагосомно-лизосомального слияния и последующей деградации микобактерий.
Экспрессия генов лизосомального биогенеза (Tfeb, Tfe3) положительно коррелировала с экспрессией субъединицы plOO (NFKB2) и c-jun. Субъединица рЮО, как уже было сказано выше, может действовать подобно ингибиторному кВ-протеину (1кВ) и блокировать NF-KB-зависимый сигнальный путь [36]. Ортолог транскрипционного фактора TFEB является ключевым регулятором иммунных процессов у Caenorhabditis elegans, координируя экспрессию генов, которые у млекопитающих регулирует NF-кВ (отсутствует у С. elegans) [406]. Возможно, TFEB представляет собой один из древних регуляторов высокого уровня неспецифического иммунного ответа, который потерял свою лидирующую функцию с появлением более универсального NF-кВ. Наряду с этим, TFEB, возможно, продолжает играть роль в осуществлении иммунного ответа у млекопитающих, так как его нокаут значительно снижает экспрессию IL-ip, IL-6, CCL5, CCL16 в макрофагах RAW264.7, инфицированных Staphilococcus aureus [406]. Кроме того, активацию TFEB наблюдали в эпителии роговицы под воздействием внутривенного введения LPS [389]. Последний факт интересен тем, что роговица является иммунопривилегированным органом и классический воспалительный процесс при контакте с патогенами в ней не развивается. В связи с этим активация TFEB в клетках роговицы может отражать своеобразное (неординарное) проявление автономного иммунного ответа.
Повышение продукции АКМ перитонеальными макрофагами в группе «БЦЖ + ТС-13» при стимуляции РМА, как изложено ранее, может быть связано с повышением экспрессии N0X4 в результате активации Nrf2 под воздействием ТС-13 [302] или в результате увеличения активности ферментов пентозофосфатного пути и продукции NADPH, необходимого для генерации «дыхательного взрыва» фагоцитами при активации NAD(P)H-OKCHfla3 [266, 278, 335]. Этот феномен также можно объяснить снижением экспрессии субъединицы рЮО, принимающей участие в модуляции (альтернативная активация или блокирование) NF-KB-зависимого сигнального пути. Известно, что активация рЮО принимает участие в формировании рефрактерного фенотипа макрофагов (устойчивого к повторной стимуляции), например, при сепсисе [86]. В настоящем исследовании выявлены обратные корреляционные зависимости между стимулированной РМА продукцией АКМ перитонеальными макрофагами и выраженностью гранулематозного воспаления (численной плотностью и диаметром гранулем, таблица 2). В то же время повышение стимулированного РМА дыхательного «взрыва» сопровождалось увеличением экспрессии №г2-подконтрольных генов Nqol и Gstpl (таблица 2). Стимулированная продукция АКМ макрофагами отражает их потенциальную микробицидность, что и подтверждается характером взаимодействий с проявлениями гранулематозного воспаления. Прямая корреляционная связь с экспрессией генов ферментов антиоксидантной защиты и повышением стимулированной продукции АКМ при индукции системы Keapl/Nrf2/ARE может свидетельствовать о существовании системы положительной обратной связи между этими процессами, как проявление системы самозащиты макрофагов от повреждения большим количеством продуцированных ими АКМ. Данный факт подчеркивает необходимость активности системы Keapl/Nrf2/ARE для полноценной реализации макрофагами своих функций.
Для анализа структуры взаимосвязей между величинами исследованных показателей был проведен факторный анализ (рис. 11), который позволил выделить 3 фактора. Обнаружены прямые взаимосвязи между фактором F1 и численной плотностью гранулем, диаметром (размерами) гранулем, ЛЗ ХЛ, ЛЗ ХЛ + Н202 и обратные взаимосвязи с экспрессией Nrf2, Nqol, RelA, Becnl, LC3b. Фактор F2 положительно коррелировал с экспрессией NFKB2, c-jun, Tfeb, Tfe3 и отрицательно с экспрессией Gstpl. Фактор F3 имел прямую взаимосвязь с РМА ФЛ и экспрессией НО-1 (рис. 11).
Факторная модель величин исследованных показателей. Примечание: Стрелками указаны прямые корреляционные связи показателей с факторами, прерывистыми стрелками - обратные корреляционные связи. Nai - Численная плотность БЦЖ-гранулем (Nai), в 3,64 х 105 мкм2; D - диаметр БЦЖ-гранулем; ЛЗ ХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция; РМА ФЛ - стимулированная РМА продукция АКМ перитонеальными макрофагами; Nrf2 - экспрессия гена Nrf2; NQ01 -экспрессия гена Nqol; GSTP1 - экспрессия гена Gstpl; НО-1 - экспрессия гена НО-1; р65 -экспрессия гена RelA; plOO - экспрессия гена NFKB2; АР-1 - экспрессия гена c-jun; Beclinl -экспрессия гена Becnl; LC3B - экспрессия гена LC3b; TFEB - экспрессия гена Tfeb; TFE3 -экспрессия гена Tfe3.
Выявленные взаимосвязи позволяют рассматривать фактор F1 как «гранулемогенный», способствующий развитию и поддержанию гранулемогенеза. В структуре фактора F2 следует отметить прямую корреляцию с экспрессией субъединицы plOO альтернативного пути активации NF-кВ, которая может действовать как ингибиторный кВ-протеин, связываясь с другими NF-кВ белками и, тем самым, блокируя NF-кВ-сигнальный путь. Наблюдаемая же прямая корреляция фактора F2 с экспрессией генов лизосомального биогенеза Tfeb и Tfe3 указывает на активацию эволюционно консервативных механизмов врожденного иммунного ответа в результате фагоцитоза бактерий. Показано, что TFEB необходим для экспрессии провоспалительных медиаторов [406]. Он активирует процессы аутофагии - один из механизмов эрадикаци внутриклеточных патогенов. Кроме того, аутофагия играет цитопротективную роль в условиях длительного присутствия повреждающего фактора, устраняя поврежденные белки и органеллы, позволяя осуществлять антибактериальный ответ. Механизмы защиты, которые направлены на снижение прямого повреждения инфекционными факторами или избыточного проявления воспаления (как при инфекции Mtb), но при этом напрямую не влияющие на сам патоген, предложено называть механизмами «толерантности к инфекции» [27]. Поэтому фактор F2 может отражать процессы «толерантности» или приспособления к инфекции, направленные на поддержание жизнеспособности клеток в очаге воспаления.
Влияние индукции системы Keapl/Nrf2/ARE монофенолом ТС-1 на активацию макрофагов in vitro
Исследование влияния индуктора редокс-чувствительной сигнальной системы Keapl/Nrf2/ARE ТС-13 на активность свободнорадикальных окислительных процессов при БЦЖ-индуцированном гранулемогенезе выявило, что потребление инфицированными мышами раствора ТС-13 с питьевой водой в течение 30 дней сопровождается повышением экспрессии №і2-подконтрольньіх генов, снижением стационарной концентрации АКМ, уменьшением численной плотности и размеров гранулем в печени, а также усилением стимулированной генерации АКМ фагоцитами перитонеального экссудата. При этом интенсивность «дыхательного взрыва» фагоцитов перитонеального экссудата находилась в обратной зависимости от количества и размеров гранулем, интенсивности свободнорадикальных процессов в печени и в прямой зависимости от экспрессии гена Nrf2 и №г2-подконтрольных генов Nqol и Gstpl. Вероятно, усиление микробицидной активности макрофагов за счет активации системы Keapl/Nrf2/ARE и приводило к наблюдаемому снижению выраженности гранулематозного воспаления. При этом локальное уменьшение стационарной концентрации АКМ в печени связано скорее со снижением выраженности гранулематозного процесса, нежели с антиоксидантным эффектом ТС-13.
Высокая концентрация АКМ в печени в условиях спонтанно развивающегося БЦЖ-гранулематоза обусловлена не столько их продукцией, сколько снижением утилизации в результате недостаточной активности редокс-чувствительной системы антиоксидант-респонсивного элемента. Уменьшение количества мРНК Nrf2, его преимущественно цитоплазматическая локализация в гепатоцитах и отсутствие экспрессии в гранулемах приводит к недостаточной экспрессии ARE-зависимых генов, продукты которых осуществляют нейтрализацию АКМ, что и приводит к наблюдаемому изменению редокс-баланса (увеличение концентрации АКМ в печени).
Наблюдаемое на ранних стадиях БЦЖ-гранулематоза повышение экспрессии субъединицы рЮО NF-кВ указывает на альтернативный путь активации транскрипционного фактора, однако субъединица рЮО может также и блокировать NF-кВ-зависимый сигнальный путь, будучи четвертым ингибиторным белком наравне с классическими ІкВ (ІкВа, ІкВр, ІкВє) [36]. Известно, что высокая экспрессия рЮО связана с формированием рефрактерного фенотипа макрофагов [86], что согласуется с невысокой амплитудой «дыхательного взрыва» у перитонеальных макрофагов на 30 днень после инфицирования БЦЖ. При воздействии индуктора сигнальной системы Keapl/Nrf2/ARE монофенола ТС-13 экспрессия рЮО снижалась, наблюдалось восстановление функциональных свойств макрофагов, что выражалось в увеличении амплитуды «дыхательного взрыва». Усиление микробицидных свойств макрофагов (продекция оксида азота, экспрессия костимулирующей молекулы CD86) при активации системы Keapl/Nrf2/ARE нашло подтверждение в проведенных in vitro экспериментах (глава 3.2). Полученные результаты свидетельствуют о неоднозначном эффекте индуктора редокс-чувствительной системы синтетического фенола ТС-13 на активацию макрофагов по классическому пути: при его изолированном применении одни маркеры Ml-поляризации увеличиваются (продукция N0 ), другие снижаются (экспрессия CD86), в то время как при совместном применении с прототипическими индукторами классической активации (IFN-y+LPS) соединение оказывало синергичный эффект. Сходную динамику наблюдалу и в случае воздействия бактериального агента (БЦЖ).
Наблюдаемая нами связь активности системы Keapl/Nrf2/ARE и функционального статуса макрофагов может включать несколько механизмов. С одной стороны, ее активация необходима для выживания макрофагов [83], так как в ходе борьбы с патогенами макрофаги формируют токсическое окружение, во многом неспецифическое (в особенности это касается АКМ), и наличие механизмов самозащиты способствует повышению их жизнеспособности. С другой стороны, активность системы Keapl/Nrf2/ARE обуславливает объем продукции микробицидных факторов: 1) усиливает экспрессию ферментов пентозофосфатного пути (РРР) и увеличивает продукцию NADPH, необходимого для генерации «дыхательного взрыва» фагоцитами при активации NADPH-оксидаз [266, 278, 335]; 2) увеличивает экспрессию N0X4 [205], активность которого может возрастать при стимуляции [210]; 3) активирует eNOS, что приводит к последующей продукции оксида азота индуцибельной NO-синтазой [80]. Кроме того, воздействие индукторов редокс-чувствительной сигнальной системы активирует PI3K-путь, дополнительная стимуляция которого усиливает IFNy-зависимое фосфорилирование STAT1 [73] и способствует поляризации макрофагов по классическому пути.
Следует отметить, что наблюдаемое in vivo снижение численной плотности и диаметра гранулем при активации системы Keapl/Nrf2/ARE не связано с ингибированием гранулемогенеза под воздействием фенольного антиоксиданта ТС-13, а является, по-видимому, результатом «диссоциации» гранулем. Так, проведенные эксперименты на модели формирования микобактериальных гранулем in vitro показали, что при активации редокс-чувствительной системы процесс гранулемообразования происходит быстрее с образованием большего количества более крупных гранулем (может быть связано с увеличением фагоцитарной активности [138] и экспрессии костимулирующих молекул), но затем сменяется их диссоциацией.
Выявленные факты позволяют утверждать, что редокс-чувствительная сигнальная система Keapl/Nrf2/ARE может служить эффективной фармакологической мишенью при терапии туберкулеза (усеныпение количества и размеров гранулем, снижение рисков деструктивных изменений), так как результатом ее активации является увеличение функциональной активности макрофагов (увеличение выраженности «дыхательного взрыва», продукции оксида азота, экспрессии костимулирующей молекулы CD86) с последующей деградацией возбудителя, а не ингибирование гранулемогенеза, поскольку формирование гранулемы, хотя и представляет деструктивные риски, тем не менее является важнейшим фактором сдерживания инфекции.