Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 15
1.1 Значение прооксидантно-антиоксидантнои системы в поддержании гомеостазав организме 15
1.2. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на биологические объекты 19
1.2.1. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на скорость деления клеточных культур 24
1.3. Влияние нерадиоактивных изотопов на живые системы и количественные методы их регистрации 27
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 32
2.1 Моделирование окислительного стресса и оценка динамики активности прооксидантно-антиоксидантнои системы и функциональной системы детоксикации организма 32
2.1.1. Исследование влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на изотопный состав и показатели прооксидантно-антиоксидантнои системы у крыс в физиологических условиях 33
2.1.2. Исследование влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на изотопный состав и показатели прооксидантно-антиоксидантнои системы у крыс при эндотоксикозе различного генеза 35
2.1.2.1. Моделирование экспериментального сахарного диабета 37
2.1.2.2. Моделирование экспериментального хронического абсцесса 37
2.1.2.3. Моделирование печеночно-почечной недостаточности 38
2.1.3. Определение изотопного состава (D/H) крови и тканей органов систем детоксикации у лабораторных животных 38
2.2 Лабораторные методы исследования 40
2.2.1 Определение содержания тиоловых групп в гемолизате 40
2.2.2. Методика определения количества базальных и индуцированных ТБК- реактивных продуктов в эритроцитах 41
2.2.3. Определение продуктов окислительной модификации в плазме крови 42
2.2.4. Методика определения количества молекул средней и низкой массы в эритроцитах и плазме крови 42
2.2.5. Методика определения интенсивности свободнорадикального окисления с помощью хемилюминесценции 42
2.2.6. Методика определения общей антиоксидантной активности плазмы крови с помощью амперометрического метода 43
2.2.7. Определение интегрального показателя выраженности эндотоксикоза 44
2.2.8. Интегральная оценка состояния низкомолекулярного звена прооксидантно-антиоксидантной системы 45
2.2.9. Исследование биохимических показателей в крови лабораторных животных 46
2.3 Определение количества однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов у лабораторных животных в норме и при патологии 46
2.4 Определение количества однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов у детей с врожденными пороками развития 48
2.5 Статистическая обработка полученных данных 51
ГЛАВА III. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на изотопный состав тканей и состояние прооксидантно-антиоксидантной системы крови у крыс в физиологических условиях 52
3.1. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на изотопный состав плазмы крови и тканей органов функциональной системы детоксикации 52
3.2. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса и состояние функциональной системы детоксикации у крыс в физиологических условиях 58
ГЛАВА IV. Динамика изотопного состава тканей, показателей прооксидантно-антиоксидантного баланса и состояния функциональной системы детоксикации при использовании воды с пониженным содержанием дейтерия у крыс с эндотоксикозом различного генеза 63
4.1. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на биохимические показатели крови и органов функциональной детоксикации при экспериментальном сахарном диабете 65
4.2. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на биохимические показатели крови и органов функциональной детоксикации при резорбционном первичном эндотоксикозе 71
4.3. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на биохимические показатели крови и органов функциональной детоксикации при эндотоксикозе гепаторенального генеза 76
ГЛАВА V. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на процессы репарации днк лимфоцитов in vitro 85
5.1 Влияние воды с модифицированным изотопным составом с пониженным содержанием дейтерия на количество однонитевых разрывов в ДНК лимфоцитов лабораторных животных с эндогенной интоксикацией резорбционного генеза 85
5.2 Определение количества однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов, выделенных из крови детей с врожденными пороками развития 90
ГЛАВА VI. Обсуждение результатов 94
Выводы 115
Список литературы
- Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на скорость деления клеточных культур
- Определение изотопного состава (D/H) крови и тканей органов систем детоксикации у лабораторных животных
- Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса и состояние функциональной системы детоксикации у крыс в физиологических условиях
- Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на биохимические показатели крови и органов функциональной детоксикации при резорбционном первичном эндотоксикозе
Введение к работе
Актуальность исследования. Значительный вклад в развитие и прогрессирование многих патологических состояний вносит повышение интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) в клетках. Это может быть обусловлено действием на организм различных экологически неблагоприятных факторов, в том числе поступлением и накоплением ионов тяжелых металлов, содержание которых нередко повышено в промышленных регионах с развитой транспортной инфраструктурой. Усиленное образование свободных радикалов и реактивных молекул приводит к повреждению всех клеточных структур, а также структуры нуклеиновых кислот. Это вызывает деформацию мембранных липопротеиновых комплексов клеточных мембран, изменение физико-химических свойств и активности мембраносвязанных ферментов, нарушая работу ионных каналов и приводя к необратимым изменениям в тканях и органах [Г.Н. Крыжановский, 2002; Н.К. Зенков, 2004; Ю.А. Владимиров, 2004; T.R. Dean et al, 2007].
Одной из главных составляющих неспецифической защиты организма является антиоксидантная система (АОС), представленная ферментным и низкомолекулярным звеньями и участвующая в поддержании физиологического баланса прооксидантных и антиоксидантных факторов в организме [И.А. Збровская, 1995; В.К. Казимирко и соавт., 2004; Е.Б. Меньшикова и соавт., 2008].
Усиление свободнорадикальных процессов в условиях патологии приводит к нарушению существующего в физиологических условиях баланса между активностью прооксидантной и антиоксидантной систем с преобладанием первой. Это становится причиной возникновения повреждения на молекулярном и клеточном уровне и сопровождается комплексом типовых патологических процессов в органах и тканях, обозначаемым как "окислительный стресс" (ОС) [О.А. Гомазков, 2003]. Развитие окислительного стресса всегда сопровождается накоплением в биологических жидкостях продуктов окислительной модификации, представляющих собой пул эндотоксических субстанций, что ведет к формированию синдрома эндогенной интоксикации (СЭИ) и существенно ухудшает течение большинства заболеваний.
Моделирование на животных СЭИ, позволяет выявить реакцию основных систем организма на накопление эндотоксических субстанций в биологических жидкостях и определить ведущие патобиохимические изменения в организме. Такой подход обеспечивает эффективность разрабатываемых и применяемых в дальнейшем способов коррекции нарушений метаболизма при СЭИ, в том числе позволяет индивидуализировать лечебные и профилактические мероприятия в зависимости от первичного механизма развития СЭИ. Одним из перспективных способов коррекции деятельности антиоксидантного потенциала организма является потребление воды с модифицированным изотопным D/H составом (ВМИС) со сниженным содержанием дейтерия
(ССД). ВМИС ССД в условиях развития в организме ОС и СЭИ способна уменьшить интоксикацию и повысить антиоксидантный потенциал органов и тканей [L. Olariu et al., 2010]. Введение в пищевой рацион больных с эндогенной интоксикацией ВМИС ССД может ускорять реакции изотопного обмена, стимулируя тем самым органы функциональной системы детоксикации (печень, почки) за счет влияния на термодинамические и термокинетические показатели макромолекул (прежде всего, белков, нуклеиновых кислот), изменения скорости биохимических процессов в клетке.
Таким образом, изучение динамики функциональной активности прооксидантно-антиоксидантной системы при формировании в организме синдрома эндогенной интоксикации с различным первичным механизмом развития (продукционным, резорбционным и ретенционным) позволит расширить представления о роли нарушений окислительного метаболизма в патогенезе СЭИ, а также позволит изучить эффективность корригирующих мероприятий, осуществляемых с помощью реакций изотопного D/H обмена, при моделируемых патологических процессах.
Цель исследования - оценить влияние воды с модифицированным изотопным D/H составом с пониженным содержанием дейтерия на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы и определить оптимальные концентрации дейтерия для повышения антиоксидантного потенциала организма у лабораторных животных.
В соответствии с целью были определены задачи исследования:
-
Определить интенсивность изотопного обмена дейтерия и протия в тканях внутренних органов функциональной системы детоксикации при приеме воды с модифицированным изотопным D/H составом со сниженным содержанием дейтерия.
-
Установить сравнительную динамику биохимических показателей при окислительном стрессе, сопровождающем эндогенную интоксикацию с разным первичным механизмом развития: продукционным, резорбционным, ретенционным.
-
Изучить влияние воды с модифицированным изотопным D/H составом со сниженным содержанием дейтерия на показатели прооксидантно-антиоксидантной системы у животных в физиологических условиях.
-
Изучить характер влияния воды с модифицированным изотопным D/H составом со сниженным содержанием дейтерия на показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса организма лабораторных животных при моделировании эндогенной интоксикации с продукционным, резорбционным и ретенционным первичным механизмом развития.
-
Установить оптимальное содержание воды с модифицированным изотопным D/H составом с пониженным содержанием дейтерия в питьевом рационе животных, необходимое для повышения антиоксидантного
потенциала организма при эндогенной интоксикации с продукционным, резорбционным и ретенционным первичным механизмом развития.
6. Выявить возможное влияние воды с модифицированным изотопным D/H составом со сниженным содержанием дейтерия на антимутагенный потенциал лимфоцитов.
Научная новизна исследования.
Впервые показано, что в физиологических условиях содержание дейтерия в крови превосходит его концентрацию (максимальное значение 3,9 ррт) в тканях внутренних органов (печени, почке, сердце). При введении в питьевой рацион крыс ВМИС ССД (40 и 100 ррт) происходит изменение направления изотопного D/H градиента «плазма крови - ткани». Его максимальное значение при использовании воды 40 ррт составило 42,6 ррт, а при использовании воды 100 ррт - 26,0 ррт с достижением устойчивого равновесия на 30 день эксперимента.
Впервые продемонстрированы различия в эффективности питьевого рациона, включающего воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ррт), для коррекции нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной и детоксицирующей систем при моделировании у животных эндогенной интоксикации с разным первичным механизмом развития эндотоксикоза. Продемонстрировано более существенное влияние реакций изотопного обмена на состояние функциональной системы детоксикации при резорбционном первичном механизме развития эндотоксикоза (индекс эндогенной интоксикации (ИЭИ) снижался на 36,8%). Наиболее значимая коррекция нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной системы, с помощью воды с пониженным содержанием дейтерия, отмечена при эндотоксикозе гепато-ренального генеза (коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов (КОМБэр) уменьшался на 26,6%).
Впервые показано, что при использовании ВМИС с пониженным содержанием дейтерия происходит уменьшение количества однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов человека и животных при индукции апоптоза (in vitro).
Практическая значимость:
В эксперименте продемонстрирована перспективность нутриционной коррекции показателей прооксидантно-антиоксидантной системы и функциональной системы детоксикации организма при использовании воды с пониженным содержанием дейтерия в условиях эндогенной интоксикации с разным первичным механизмом развития эндотоксикоза.
Положения выносимые на защиту:
- при использовании в питьевом рационе воды с пониженным содержанием дейтерия устанавливается изотопное D/H равновесие между тканями и кровью («плазма крови - ткани»), которое при употреблении воды с концентрацией дейтерия 40 ррт составляет от 33,0 ррт («плазма крови -ткань почки») до 42,6 ррт («плазма крови - ткань печени»).
- имеются различия в эффективности питьевого рациона, включающего
воду с модифицированным изотопным D/H составом с концентрацией
дейтерия 40 ррт, для коррекции нарушений в работе прооксидантно-
антиоксидантной и детоксицирующей систем в зависимости от первичного
механизма развития эндотоксикоза.
продемонстрировано более выраженное влияние воды с модифицированным изотопным D/H составом с концентрацией дейтерия 40 ррт на состояние функциональной системы детоксикации при резорбционном первичном механизме развития эндотоксикоза (ИЭИ снижался на 36,8%) и эндотоксикозе гепаторенального генеза (ИЭИ снижался на 32,8%). Наиболее значимая коррекция нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной системы при использовании в питьевом рационе воды с пониженным содержанием дейтерия отмечена при эндотоксикозе гепато-ренального генеза (КОМБэр уменьшался на 26,6%).
- показано уменьшение количества однонитевых разрывов ДНК
лимфоцитов человека и животных при индукции апоптоза (in vitro) в
условиях инкубации лимфоцитов в среде с водой с модифицированным
изотопным составом со сниженным содержанием дейтерия.
Апробация работы: Основные положения диссертационной работы представлены на конференциях: «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, октябрь 2011; XXIV Всероссийской научно-технической конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Биотехнические, медицинские и экологические системы и комплексы» Рязань 2012; XXI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» 5-15 июня 2013 г., Украина, Крым, Ялта-Гурзуф; XI научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» г. Краснодар, 24-26 апреля 2013 г; XXIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» 2-12 июня 2015 г., Крым, Ялта-Гурзуф.
Внедрение результатов. Результаты диссертационной работы внедрены на кафедре общей и клинической патофизиологии, кафедре фундаментальной и клинической биохимии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России и кафедре технологии продуктов питания животного происхождения Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный технологический университет» (г. Краснодар).
Публикации результатов исследования. По материалам диссертационного исследования опубликовано 13 работ, из них 5 в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации.
Личный вклад автора
Автором сформулирована основная идея и разработан алгоритм
получения и обработки результатов экспериментального исследования.
Автор самостоятельно провел анализ современной литературы о роли
свободнорадикального окисления в формировании синдрома эндогенной
интоксикации. Им проведено моделирование эндогенной интоксикации с
продукционным, резорбционным и ретенционным первичными механизмами
развития. Автор самостоятельно курировал условия содержания животных в
виварии, производил забор биологического материала и участвовал в
проведении морфологических, биохимических, биофизических
исследований. Автором разработаны протоколы исследования для сбора и статистической обработки данных. На основании проведенных исследований им сделаны достоверные, обоснованные выводы и разработаны практические рекомендации. Авторский вклад в выполнении работы 90% и написание научных работ по теме диссертации 70%.
Структура и объем диссертации
Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на скорость деления клеточных культур
Крайней степенью нарушения окислительного метаболизма является ОС. Он характеризуется усиленным образованием первичных радикалов (супероксидный анион-радикал, оксид азота [S.S. Haque, 2012]), реактивных молекул (синглетный кислород, пероксид водорода, гидропероксиды, пероксинитриты), вторичных радикалов (гидроксильный радикал, алкилы, алкоксилы, пероксилы) на фоне угнетения ферментных (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза [S. Szymonik-Lesiuk et al., 2003]) и неферментных (витамины [М. Naziroglu, P.J. Butterworth, 2005], тиолсодержащие соединения, полифенолы) звеньев антиоксидантной системы (АОС) [R. Rahimi et al., 2005]. Это приводит к возникновению повреждения на молекулярном и клеточном уровне, играющего важную роль в патогенезе различных заболеваний [Е.Е. Дубинина, 2001; Duzguner V., Кауа S., 2007].
Действие на организм некоторых экологически неблагоприятных факторов, например ионов тяжелых металлов [G. J. Quinlan et al., 2002], содержание которых нередко повышено в промышленных регионах с развитой транспортной инфраструктурой, способствует усилению процессов перекисного окисления биомолекул, играющих существенную роль в развитии и прогрессировании ряда заболеваний. Свободные радикалы (СР) и реактивные молекулы вызывают повреждение клеточных структур, структуры нуклеиновых кислот, деформацию мембранных липопротеиновых комплексов клеточных мембран, изменение физико-химических свойств и активности мембраносвязанных ферментов (в частности ионных каналов), вызывая необратимые изменения в тканях и органах [А. Н. Осипов и соавт., 2001; В. А. Стежка и соавт., 2001; A. Grosicki, В. Kowalski, 2002;].
Реакции СРО, при разных патологических процессах, вносят существенный вклад в их развитие и прогрессирование. Однако при развитии ОС повреждение субстратов одной и той же природы (например, липидов) носит универсальный характер и вовлекает в процессы окислительной модификации не отдельные клеточные компоненты, а всю совокупность белков, липидов, углеводов или нуклеиновых кислот [G. Kali et al., 2008].
В естественных условиях в организме только незначительная часть кислорода (до 5%) превращается в активные формы, которые участвуют в регуляции ряда процессов жизнедеятельности [L. Karagenc et al., 2004; P.F. Rinaudo et al, 2006; P.L. Wale, D.K. Gardner, 2012; P. L. Wale, D.K. Gardner, 2013]. Избыточное же образование активных форм кислорода (АФК) и азота, является проблемой, требующей разрешения не только в теоретической медицинской науке, но и практическом здравоохранении. К настоящему времени многие исследователи показали, что в развитии большого количества заболеваний и их поздних осложнений существенную роль играет нарушение соотношения генерации и утилизации СР [S.A. Gaertner et al., 2002; S. M. Day et al, 2003; Ю.А. Владимиров, 2004; M. Turgay et al, 2012].
Представителями АФК в организме являются: супероксидный анион-радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал, а также синглетный кислород [М. Shvartsman et al, 2007; X. Gao et al, 2010]. Генерация супероксидного аниона-радикала в клетке происходит за счет поступления электронов в ходе шунтирования дыхательной цепи митохондрий молекулярным кислородом [Ю.А. Владимиров, 2000; X. Gao et al, 2009]. Кроме того, он образуется в процессе аутоокисления, при котором кислород взаимодействует с различными окисляемыми субстратами, такими как катехоламинамы, ферродоксины, гемоглобин. В системе микросомального окисления это происходит при участии цитохромных белков [С. Mancuso et al., 2007], прежде всего гепатоцитов, в результате обезвреживания эндогенных токсических субстанций и ксенобиотиков.
Пероксид водорода образуется в основном при дисмутации двух супероксидных анионов-радикалов, а также в ходе аэробного окисления восстановленных флавопротеинов. Кроме того, ксантиноксидаза, принимающая участие в катаболизме пуриновых нуклеотидов, способствует генерации пероксид водорода в качестве побочного продукта этой реакции. Пероксид водорода сам по себе является достаточно стабильным соединением, но в присутствие доноров электронов вызывает цитотоксический эффект за счет образования гидроксильного радикала. Кроме того пероксид водорода играет важную роль в инактивации цитохрома Р450 [А.И. Арчаков и соавт., 1998; L. Pari et al., 2008], являясь основным агентом разрушающим этот металлопротеин. В условиях развития эндотоксикоза это можно рассматривать как неблагоприятный фактор [W.E. Stehbens, 2003].
Гидроксильный радикал, образующийся в результате взаимодействия супероксидного аниона-радикала и пероксида водорода, отличается наибольшей химической активностью. Он, по своей реакционной способности, превосходит даже атомарный кислород [А.А. Болдырев, 2003; X. Gao et al., 2009]. Кроме того, в живых системах возможна генерация гидроксильного радикала, как элемента структурного переходного состояния, в процессе ферментативного катализа, например, в активном центре цитохромов Р-450 [А.И. Арчаков и соавт., 1998; Mancuso С. et al., 2007].
Помимо АФК в процессах перекисной модификации биомолекул активную роль играют СР органических субстратов, содержание которых может достигать существенной величины, превосходя уровень АФК на порядки. Уровень СР повышается при их рекомбинации с молекулярным кислородом. Последнее представляется одним из основных механизмов в развития цепных реакций перекисной модификации биомолекул, что особенно часто наблюдается при перекисном окислении липидных структур [Е. Gedik et al., 2008]. Активация процессов перекисной модификации наблюдается при гипоксии и при развитии гипероксии тканей. Это встречается при развитии многих патологических процессов [А. С. Maritim et al., 2003; J. L. Evans et al, 2003; T. Christova, D. M.Templeton, 2007; F.Yildiz et al., 2008; H. T. Lee et al, 2009]. АФК, а также иные СР, участвуя в процессах пероксидации различных биомолекул, способствуют формированию свободнорадикальной патологии [L.L. Ji et al, 2009; J. М. Hwang et al, 2010; M. Bicer et al, 2012]. Окислительная модификация биомолекул ведет к образованию пула токсичных производных альдегидной природы [Н. Н. Draper et al., 2000], которые способны в определенных условиях вступать в реакцию с тиобарбитуровой кислотой [F. Bezerra et al., 2004; С. F. Canakci et al, 2009]. Существенную роль в развитии патологии играет окислительная модификация протеинов. Она в ряде случаев может быть избирательной, приводя к специфическим повреждениям на клеточном уровне [R.A. DiSilvestro, 2000; D. К. Машуа, Т. P. Devasagayam, 2010]. Для окислительной модификации одними из наиболее уязвимых являются серосодержащие аминокислотные остатки. Это нередко ведет к нарушению функциональной активности протеинов [J. Renke et al., 2007], активные центры которых зачастую содержат тиоловые группы [М. Нага et al., 1990; L. F. Carbonell et al., 2000; Y. Iwanaga et al., 2000]. В условиях ОС, в ходе перекисной модификации протеинов, происходит нарушение их первичной, вторичной и третичной структуры, что сопровождается фрагментацией белковой молекулы и потерей ее нативных свойств [О. Erel, 2004; Н.П. Чеснокова с соавт. 2007].
Определение изотопного состава (D/H) крови и тканей органов систем детоксикации у лабораторных животных
Исследование проб крови проводили на полностью автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе Abacusjuniorvet 2.7 (DiatronMesstechnikGmbH, Австрия), используя наборы реактивов компании Diatron. Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BioChem SA (USA), используя наборы реактивов HighTechnology (USA). В качестве лабораторно-биохимических показателей, отражающих токсическое поражение печени и почек, в плазме крови крыс определяли креатинин, общий билирубин, аспартатаминотрансферазу (ACT), аланинаминотрансферазу (АЛТ), альбумин, мочевину, глюкозу.
Определение количества однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов у лабораторных животных в норме и при патологии
Для изучения влияния ВМИС ССД на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток in vitro лимфоциты, изолированные из крови контрольных и больных животных, инкубировали в 0,9% растворах NaCl, приготовленных на воде с природным содержанием дейтерия (150 ррт) и на воде с пониженной относительно природного концентрацией дейтерия (40 ррт).
Для выделения лимфоцитов из периферической крови лабораторных животных для определения количества однонитевых разрывов ДНК предварительно получали лейкоцитарную взвесь. Для этого гепаринизированную (10-15 ЕД/мл гепарина) периферическую венозную кровь в объеме 15 мл отстаивали с целью осаждения эритроцитов в стерильной пробирке в течение 40-60 минут при температуре +37С. Лимфоциты выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность нижнего слоя градиента составляла 1,093-1,095, а верхнего - 1,075-1,077. Объем каждого градиента равнялся 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появлялось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100% [И.И. Долгушин, 2001]. Кольцо лимфоцитов аккуратно собирали, переносили в стерильные эппендорфы, затем троекратно отмывали и инкубировали в физиологическом растворе, приготовленном на воде с пониженным содержанием дейтерия (40 ± 2 ррт, здесь и далее указано содержание по дейтерию) в течение 16 часов при комнатной температуре. После этого клетки лизировали 4,5 М раствором мочевины в течение 10 мин при комнатной температуре. В экспериментальных образцах лизаты клеток подвергали щелочной обработке в течение 30 мин при 0С, а затем подвергали интенсивному встряхиванию на Вортексе в течение 15 сек. Контрольные образцы щелочной обработке не подвергались и использовались для определения фоновой флюоресценции. После этого во все образцы добавлялся раствор бромистого этидия.
После щелочной обработки лизатов и добавления бромистого этидия измерялась интенсивность флюоресценции полученных образцов на флюоресцентном спектрометре Hitachi F-2700 при длине волны (Хп0ГЛ) 610 ± 5 нм. Полученные спектры флюоресценции приведены на рис. 2.3.
Количество однонитевых разрывов ДНК оценивалось по отношению величин флюоресценции контрольных и экспериментальных образцов. Результаты представлялись в виде процентного соотношения количества щелочнолабильных сайтов ДНК, содержащих однонитевые разрывы к общему количеству ДНК. s a
Интенсивность флюоресценции раствора бромистого этидия с лизатами лимфоцитов крови у крыс с гнойным воспалением мягких тканей.
Примечание. Инкубация лимфоцитов проведена в растворах, приготовленных на дистиллированной воде с содержанием дейтерия 150 ррт (А) и воде с модифицированным изотопным составом с содержанием дейтерия 40 ррт (В). Время инкубации 16 часов при температуре 24 С.
В ряде экспериментов для индукции апоптоза иммунокомпетентных клеток использовался рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли (ФНО-а), при этом в среде создавалась концентрация ФНО-а равная 10 нг/мл.
Определение количества однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов у детей с врожденными пороками развития
Сведения о детях с врожденными пороками развития (ВИР) челюстно-лицевой области получены на основании диспансерной компьютерной базы данных, созданной в ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России. Из собранных образцов крови у детей с ВПР челюстно-лицевой области (n = 15), верифицированных в соответствии с МКБ-10 (коды Q35-Q37), а также у детей контрольной группы, (п=12) с помощью наборов реактивов фирмы «Изоген» (РФ, г. Москва) выделены ДНК. Затем методом ПЦР-ПДРФ на амплификаторе роторного типа Rotor Gene (Австралия) проведен анализ распространения двух однонуклеодидных полиморфизмов - SNP (single nucleotide polymorphisms) С677Т и А1298С гена MTHFR с использованием рестриктаз Hinfl и MboII, соответственно. Рассматриваемые SNP ассоциируются, как установлено в ряде исследований, с формированием врожденных расщелин губы и неба [Е.Е. Текуцкая, Л.Р. Гусарук, 2013].
Аналогичные данные собраны для контрольной группы обследованных. Выделение чистой взвеси лимфоцитов из донорской крови проводили в градиенте плотности фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл), как описано в работе Е.Е. Текуцкой и соавт. [2014]. Лимфоциты троекратно отмывались и инкубировались в физиологическом растворе, приготовленном на воде с пониженным содержанием дейтерия (40 ± 2 ррт) при комнатной температуре в течение 16 часов. После этого клетки лизировали 4,5 М раствором мочевины в течение 10 минут при температуре 24 С. Лизаты клеток в экспериментальных образцах подвергали щелочной обработке в течение 30 мин при 0 С, а затем подвергали интенсивному встряхиванию на Вортексе в течение 15 сек. Контрольные образцы щелочной обработке не подвергали и использовали для определения фоновой флюоресценции. После этого во все образцы добавляли раствор бромистого этидия.
После щелочной обработки лизатов и добавления бромистого этидия измеряли интенсивность флюоресценции полученных образцов в кварцевой кювете на флюоресцентном спектрометре Hitachi F-2700 при Хштя 610 ± 5 нм под прямым углом к направлению возбуждающего света (рис. 2.4).
Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса и состояние функциональной системы детоксикации у крыс в физиологических условиях
При введении в пищевой рацион животных ВМИС ССД, начиная с 15 суток, происходило достоверное снижение концентрации дейтерия в плазме крови и тканях органов системы детоксикации, наболее выраженное при употреблении воды с остаточным содержанием дейтерия 40 ррт.
Наиболее низкий уровень дейтерия наблюдался в плазме крови и ткани почки (рис. 3.1, 3.2). При этом, если в физиологических условиях содержание дейтерия в плазме крови превышало его содержание в тканях органов (градиент D/H «плазма - ткань печени» составлял до 3,9 ppm) , то с введением в питьевой рацион крыс ВМИС ССД, происходило увеличение и изменение направленности изотопного градиента D/H, в сторону повышения его концентрации в тканях. Градиент D/H «плазма и ткань сердца» при использовании воды 100 ррт на 30 день эксперимента составил 26,0 ррт с достижением устойчивого равновесия на 30 день эксперимента. Градиент D/H «плазма и ткань печени», при использовании воды 40 ррт, составил 42,6 ррт с достижением устойчивого равновесия на 30 день эксперимента. Это связано с небольшой скоростью реакций обмена изотопов водорода в тканях, а также влиянием на него не только воды, но и потребляемой пищи, которая обеспечивает поступление питательных веществ с естественным изотопным D/H составом. В результате термодинамической неравноценности изотопных соединений, в тканях может происходить неравномерное распределение изотопов водорода, а также наблюдаться преимущественное накопление одной из его форм [В.И. Лобышев и соавт., 1982; Е.С. Северин, 2003; A.L. Buchachenko et al., 2012; А.А. Киркина с соавт., 2014].
При использовании в пищевом рационе крыс ВМИС ССД 100 и 40 ррт динамическое равновесие в проосидантно-антиоксидантной системе в интактных группах животных не нарушалось. Повышения уровня свободных радикалов не отмечено. Однако, наблюдалось достоверное (р 0,05) уменьшение амплитуды вспышки хемилюминесценции на 27,9%. Это свидетельствует об адаптивном снижении интенсивности СРО, без изменения АОА плазмы крови.
В результате исследования не выявлено повышения уровня эндотоксических субстанций и отрицательного влияния ВМИС ССД на состояние функциональной системы детоксикации. Это позволяет сделать вывод об отсутствии токсического эффекта при ее применении.
Кроме того, отмеченное у животных 26 подгруппы достоверное (р 0,05) снижение ИЭИ до -4,87% ГК указывает на увеличение функциональной активности детоксицирующей системы.
В целом влияние ВМИС ССД на прооксидантно-антиоксидантное и детоксицирующее звенья системы неспецифической защиты характеризуется преобладанием антирадикального эффекта (уменьшение амплитуды ВХЛмакс на 27,9%) при использовании воды с концентрацией дейтерия 100 ррт, тогда как большее стимулирующее влияние на органы функциональной системы детоксикации оказывает вода с концентрацией дейтерия 40 ррт (снижение ИЭИ до - 4,87% ГК).
Различия в эффективности пищевого рациона, включающего ВМИС ССД (40 ррт), при коррекции нарушений в работе прооксидантно-антиоксидантной и детоксицирующей систем у лабораторных животных зависят от первичного механизма развития эндотоксикоза. Поэтому для изучения влияния ВМИС ССД на показатели активности проосидантно-антиоксидантной системы и состояние органов функциональной системы детоксикации при эндогенной интоксикации были созданы экспериментальные модели эндотоксикоза с ретенционным, резорбционным и продукционным первичными механизмами развития.
При моделировании аллоксанового диабета у крыс группы 3 наблюдалось повышение уровня глюкозы в крови на 121,1%, тогда как у животных, употреблявших ВМИС ССД (группа 4) он был на 19,3% ниже. Кроме того, у животных группы 3 имело место возрастание активности ферментов, характеризующих цитолитические процессы (ACT - на 18,0%; АЛТ - на 137,4%). Росла концентрация креатинина (на 43,3%), билирубина (на 44,3%) и мочевины (на 31,8%). На фоне выраженных метаболических нарушений у крыс с аллоксановым диабетом наблюдалось повышение уровня СРО, более выраженное в плазме крови (ВХЛмакс выросла на 73,2%, ХЛпл - на 99,3%), чем в органах (печень - на 32,9%; почки - на 9,3%; сердце - на 58,4%). Это характерно для развития ОС в организме (рис.6.1).
Реакции СРО вносят различный вклад в развитие и прогрессирование разных патологических процессов [Т. Kuroki et al., 2003; А.М Vincent et al, 2004]. Однако при развитии ОС повреждение субстратов одной и той же природы (например, липидов) носит универсальный характер и вовлекает в процессы окислительной модификации не отдельные клеточные компоненты, а всю совокупность белков, липидов, углеводов или нуклеиновых кислот [G. Kali etal, 2008].
У животных с аллоксановым диабетом, не получавших ВМИС ССД, кроме того выявлен значительный дисбаланс в функционировании прооксидантно-антиоксидантной системы. Он характеризовался повышением: количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в плазме крови на 81,2%; базального количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в эритроцитах на 35,7%; количества продуктов окислительной модификации (Fe -индуцированных) в эритроцитах на 64,0%. В то же время отмечалось снижение САОА на 33,5 % и количества тиоловых групп на 32,1%, что указывает на уменьшение потенциала низкомолекулярного звена АОС и на существенный дисбаланс в соотношении прооксидантных и антиоксидантных факторов. Это сопровождалось резким увеличением интегрального показателя КОМБэр с 0,08 до 15,51 ОЕА (рис. 6.7).
Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на биохимические показатели крови и органов функциональной детоксикации при резорбционном первичном эндотоксикозе
Это может быть обусловлено более быстрой заменой легкодиссоциирующих атомов водорода в функциональных группах (-ОН, -SH и других) соединений с антиоксидантной напрвленностью [М.И.Равич-Щербо 1968; СИ. Лебедев 1988.]. Все это в дальнейшем ведет к уменьшению повреждающего действия процессов свободнорадикального окисления, интенсификация которых была отмечена в различной степени у всех экспериментальных группп. Последние в отсутствии коррекции окислительного стресса неизбежно ведут к повреждению биомолекул (белков, лидипидов, нуклеиновых кислот, углеводов и других), что сопровождается превалированием катаболических процессов над анаболическими.
В то же время у крыс с ретенционным механизмом эндотоксикоза, получавших воду с пониженным содержанием дейтерия, было достоверно (р 0,05) показано уменьшение содержания продуктов окислительной модификации в плазме крови на 19,65%, а также уменьшение количества продуктов окислительной модификации на клеточном уровне (ТБЧэр Fe2+-индуцированных) на 13,8%. Все вышеизложенное указывает на увеличение активности экстрацеллюлярных и интрацеллюлрных мембрано- и цитопротективных механизмов, которое было достигнуто на фоне уменьшения содержания дейтерия в тканях и биологических жидкостях.
Одним из дополнительных фактов, подтверждающих способность различных концентраций дейтерия влиять на процессы репарации биомолекул, является более выраженная способность иммунокомпетентных клеток, при инкубации в средах с пониженным содержанием дейтерия, восстанавливать поврежденные участки молекулы ДНК, что подтверждается достоверным (р 0,05) уменьшением количества однотитевых разрывов молекулы ДНК в лимфоцитах при эндотоксикозе с резорбционным первичным механизмом развития после их инкубации в ВМИС ССД (40 ррт).
При обработке лимфоцитов, полученных из крови здоровых животных, количество однонитевых разрывов ДНК было мало и не зависело от среды инкубирования, составляя 2,5 ± 0,2%. Это свидетельствует о том, что ДНК лимфоцитов здоровых животных мало подвержены повреждениям.
Однако обнаружено, что инкубация лимфоцитов, полученных от животных с гнойным воспалением мягких тканей, в физиологическом растворе, приготовленном на воде с содержанием дейтерия 40 ррт, в течение 16 часов достоверно (р 0,05) уменьшает количество однонитевых разрывов ДНК с 86,2% ± 6,9% при эндотоксикозе до 43,5 % ± 3,6%. Уменьшение количества однонитевых разрывов приводит к снижению готовности клетки к запуску апоптоза [А.О. Даниленко, 2012], тем самым сохраняется клеточная популяция иммунокомпетентных клеток и адекватный иммунный ответ, происходит разрыв порочного круга.
При инкубации клеток, выделенных из крови здоровых животных, в 0,9% растворе хлорида натрия, приготовленном на обычной дистиллированной воде и на воде с содержанием дейтерия 40 ррт, в присутствии ФНО-а при комнатной температуре выявлено прогрессивное накопление однонитевых разрывов ДНК в клетках. Оно составило 26,4 ± 2,8% и достоверно (р 0,05) снижалось до 3,1% ± 0,8% при инкубации в течение 16 часов на воде с содержанием дейтерия 40 ррт. Такое поведение клеток в воде с пониженным содержанием дейтерия связано с тем, что наряду с возникновением однонитевых разрывов в клетках активируются системы ее репарации, ликвидирующие эти разрывы [S.P. Jackson, I. Bartck, 2009; M.R. Lieber, 2010].
Таким образом, в ходе выполнения эксперимента показано, что реакции изотопного D/H обмена не только уменьшают повреждающее действие АФК на молекулу ДНК при формировании окислительного стресса [U. Nair et al., 2007], но и активируют ДНК-репарирующие системы иммунокомпетентных клеток, предотвращая их неконтролируемый массовый апоптоз.
В лимфоцитах, полученных из крови здоровых доноров, количество однонитевых разрывов ДНК было существенно меньше, мало зависело от среды инкубирования и составляло 2,5 ± 0,2% . Это свидетельствует, что ДНК лимфоцитов здоровых доноров менее подвержена повреждениям по сравнению с ДНК лимфоцитов больных с ВПР челюстно-лицевой области, в которых наблюдаются мутации SNP двух генов FOXE1 и MHFTR.
Инкубация лимфоцитов в течение 16 часов в присутствии ФНО-а приводила к прогрессивному накоплению однонитевых разрывов ДНК в клетках. Уже через 3 часа инкубации их количество возрастало до 21,3 ±3,1%. При использовании воды с содержанием дейтерия 40 ррт количество однонитевых разрывов в лимфоцитах достигало максимума 19,7± 2,9% через 2 часа инкубации, а затем снижалось до 2,9%±0,4%.
Необходимо отметить, что атом дейтерия создает дополнительное напряжение в спиральных конструкциях ДНК. За счет небольшого удлинения дейтериевой связи, вероятность разрыва нитей ДНК в этом месте увеличивается. То есть, внедрение атомов дейтерия в структуру ДНК может явиться причиной рекомбинаций [L.G. Pedersen, 2006]. При этом чем меньше дейтерия будет во внутриклеточной воде, тем длиннее могут быть конструкции ДНК. Дейтериевая связь также может оказывать влияние на процессы синтеза за счет дополнительных напряжений в молекуле ДНК. При изотопном обогащении водородная связь в сшивке различных участков ДНК может изменить порядок раскручивания спиралей, что в свою очередь приведет к изменению порядка посыла информации. Более крепкая дейтериевая связь может изменить скорость реакций отщепления и присоединения структурных и кодирующих групп [A.A. Kirkina, 2014]. Помимо самой молекулы ДНК, дейтерий может оказывать влияние и на ферменты, принимающие участие в процессе синтеза [А.Т. Natarajan, 2008].
Реакции изотопного D/H обмена, уменьшающие содержание дейтерия во внутри- и внеклеточной среде, способствуют увеличению функциональной активности систем клетки, в частности активации системы ДНК-репарации [M.R. Lieber, 2010; A.L. Buchachenko et al, 2013]. Нуклеиновые кислоты обладают высокой способностью к сольватации в результате чего происходит изотопный обмен между диссоциирующими группами в макромолекуле и ее гидратационной оболочке. Это приводит к уменьшению энергии активации и изменению скорости внутримолекулярных конформационных перестроек (фермент-субстрат, фермент-кофактор). В результате сокращается время отдельных этапов биокаталитических превращений или ускоряется восстановление фермента в активную форму при окончании отдельного каталитического цикла, что приводит к повышению активности биохимических процессов [М. Бендер и соавт., 1987; А.Л. Бучаченко, 2007]. Среда с пониженным содержанием дейтерия создает более благоприятные условия функционирования клеток иммунной системы [Д. В. Раков, 2007; М.Р. Сапин и соавт., 2010; Д.Е. Григоренко и соавт., 2010; G. С. Corneanu et al., 2010], о чем свидетельствует большая сохранность лимфоцитов при инкубации в подобной среде. Проведенные исследования подтверждают тот факт, что вода с пониженным содержанием дейтерия активирует репаративные системы клеток, тем самым, предотвращая их апоптоз.