Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Эритрон и ацетилхолинэстераза. Строение, функция и биологическая роль фермента 17
1.2. Эритроциты крови и их АХЭ-активность у различных видов животных 29
1.3. Основные положения теории адаптации 31
1.4. Биологическая эволюция. Эволюция холинэстераз 41
1.5. Изменение эритрона и каталитических свойств АХЭ эритроцитов при воздействии на животных стрессогенных факторов 43
2. Собственные исследования 71
2.1. Материалы и методы исследования 71
2.1.1. Характеристика фермента АХЭ и условия их облучения in vitro78
2.1.2. Методы определения активности АХЭ 81
2 .2 Результаты исследования АХЭ эритроцитов 87
2.2.1. Значение величин индивидуальной активности АХЭ целого эритроцита некоторых видов животных 87
2.2.2. Результаты исследования морфологических и биохимических показателей крови, в особенности каталитических свойств АХЭ целых эритроцитов, при воздействии на животных стрессогенных факторов 92
2.2.2.1. Морфологические и биохимические показатели крови при операционной травме у крупного рогатого скота в условиях различных видов анальгезии 93
2.2.2.1.1. Результаты исследования при электроанальгезии бычков...93
2.2.2.1.2. Результаты исследования при лапаротомии в условиях электроакупунктурной анальгезии телят 95
2.2.2.1.3. Активность АХЭ эритроцитов при руменотомии у телок в условиях проводниковой анестезии 98
2.2.2.2. Изменение некоторых клеточных параметров целых эритроцитов крови и каталитических свойств их фермента АХЭ после искусственной геморрагии у телят 103
2.2.2.3. Изменение клинических, морфологических и биохимических показателей крови овец и каталитических свойств АХЭ эритроцитов при гемолитической анемии 110
2.2.2.4. Морфологические изменения клеток крови животных и ее биохимических параметров, в том числе свойств АХЭ эритроцитов, при адаптации к измененному рациону 113
2.2.2.5. Результаты лабораторных исследований после введения норкам дийодтирозина 115
2.2.2.6. Результаты лабораторных исследований после воздействия на кроликов рентгеновских лучей 115
2.2.2.7. Изменение каталитических свойств АХЭ эритроцитов при радиационном воздействии в условиях in vitro 121
Обсуждение результатов собственных исследований. 134
Выводы 257
Практические предложения 260
Список литературы 262
- Эритрон и ацетилхолинэстераза. Строение, функция и биологическая роль фермента
- Изменение эритрона и каталитических свойств АХЭ эритроцитов при воздействии на животных стрессогенных факторов
- Значение величин индивидуальной активности АХЭ целого эритроцита некоторых видов животных
- Активность АХЭ эритроцитов при руменотомии у телок в условиях проводниковой анестезии
Введение к работе
на период до 2010 года, в которой определены перспективные и
приоритетные направления ее развития, включено и решение
теоретических вопросов в области цитологии, молекулярной биологии и
др. (Смирнов A.M., Авилов В.М., 1999). В числе этих направлений
находится изучение биохимии адаптационных процессов у с.-х. животных.
После открытия явления стресса (Селье Г., 1960) и при его
последующем разностороннем изучении (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983;
Судаков К.В., 1997) установлено, что стресс не является только
медицинской проблемой (Меерсон Ф.З., 1993), но и проблемой
ветеринарной медицины (Голиков А.Н, 1985, 1999; Давыдов В.У., 1986;
Никитченко И.Н. и др., 1988; Ипполитова Т.В., 1989, 1999; Байматов В.Н.,
Волкова Е.С., 2001 и др.). Считается, что воздействие стресс-факторов
является патогенетической основой для 90% случаев незаразных
заболеваний сельскохозяйственных животных (Фурдуй Ф.И., ред., 1986).
Стресс возникает при содержании, эксплуатации животных и птиц
(Ковальчикова М.,Ковальчик С, 1978; Надводнюк А.И. и соавт., 1987;
Волчков А.И., 2000), а также при их транспортировке (Кузнецов А.Ф.,
Пастухова Л.А., 1985; Буянов А.А. и др., 1994), вакцинации и
формировании иммунитета (Болотников И.А., Коноиатов Ю.В., 1987), при
воздействии УФ-облучения (Стекольников А.А., 1985; Лебедев А.В. и др.,
1988; Рудаков В.В. и др.. 1988), постоянного электрического поля
(Андреева Н.Л., 1987). Особое значение стресс-факторы имеют в
промышленном животноводстве. В практике ветеринарной медицины
значительное место занимают травматический и операционный стрессы
(Семенов Б.С, 1978; Видении В.Н., Макеева Е.Е., 1995; Шахмарданов З.А.,
1999), в том числе при кастрации животных (Соколов В.И., 1974).
Воздействие различных видов энергии на животных характеризуется как воздействие стрессогенных факторов (Злооин B.C., 1981; Горизонтов П.Д. и соавт., 1983; Докшина Г.А., 1984; Киршин В.А. и др., 1986; Фролов В.П., 1993; Дешевой Ю.Б. и соавт., 1996; Барабой В.А., Олейник С.А., 1999; Идрисов Г.З., Ситдиков Р.И., 2000; Лысенко Н.П., 2000). Определенные проблемы в животноводстве могут вызывать гомеостатические стрессы, обусловленные голоданием или изменением компонентов рациона (Панин Л.Е., 1983; Жаров А.В., 1995) и стрессиндуцированная гипотрофия (Лютинский СИ. и др., 1989). Злободневны стрессы инфекционной и паразитарной этиологии (Бочкарев В.Н., 1990). Стресс у животных возникает не только в вышеперечисленных условиях, но и в условиях повышения стрессогенности экологических факторов (Zlobin V., Neniskiene V., 1989; Маслов СП., 1994; Ильязов Р.Г. и др., 1996) и природных катаклизмов, воздействии техногенных факторов, катастроф и других факторов, генерирующих экстремальные состояния (Куценко С.А., 1994; Иванов К.П., 1994; Плющиков В.Г., 2001).
Необходимость изучения стрессов, вызываемых острой кровопотерей и часто встречающихся как в медицинской практике (Брюсов П.Г., 1997), так и в практике ветеринарной медицины, диктуется их частотой и не подвергается сомнению.
Усиливающаяся стрессогенность условий животноводства (Плященко СИ. и соавт., 1987; Жученко А.А., 1994; Белов А.Д., Лысенко А.П., 1997; Баранников В.Д. и др., 1997) требует адекватного решения - оценки стрессоустойчивости с.-х. животных (Кокорина Э.П., 1986) и создания эколого-адаптационной стратегии ветеринарной защиты их здоровья и обеспечения высокой продуктивности (Селиверстов В.В:, Шахов А.Г., 2000). В связи с этим встает проблема не только ведения адаптивного животноводства (Надводнюк А.И. и соавт., 1987; Хайдарлиу С.Х., 1991; Монастырев A.M., Фенченко Н.Г., 2001), но и, в первую очередь, изучения
биохимических и физиологических механизмов адаптации (Панин Л.Е., 1983; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Фурдуй Ф.И., 1986: 1990; Голиков А.Н., 1999; Ипполитова Т.В., 1999), регуляции гомеостаза (Жаров А.В. и соавт., 1989, 1995). На этой основе возможны разработки диагностических методов оценки стрессовых состояний (Гуськова A.M. и др., 1999; Ланкин B.C., 2000) и создание стрессофармакологии с целью лекарственной коррекции стрессовых состояний у животных (Соколов В.Д., Андреева Н.Л., 1990). Для фармакологической коррекции стрессовых состояний животных необходимо знать физиологические и биохимические механизмы стресса (Панин Л.Е., 1983). Адаптация может возникнуть только с изменением регулирующих систем, например, ферментных, и без изучения последних невозможно проникнуть в механизмы приспособления целых организмов (Ковальский В.В., 1974). Особенно это касается изучения нейромедиаторных механизмов стресса и адаптации и, в частности, холинергических (Тонкоглас В.П., 1980; Кассиль Г.Н., 1983; Скопичев В.Г., Пруцков В.И., 1988; Попов СМ., 1989; Хайдарлиу С.Х., 1989; Максимова О.П. и др., 2000), которые относятся к нейроэндокринным стресслимитирующим системам (Новиков B.C. и соавт., 1998).
Одним из важнейших компонентов холинергической системы и
маркером холинергических элементов является фермент
ацетилхолинестераза (АХЭ) (Батоева Т.Ц., 1985; Рощина В.В., 2000; Parent A. et al., 1976). Как известно, АХЭ занимает особое положение среди множества ферментов. Это объясняется тем, что она играет центральную роль не только в таком биологически важном для организма процессе как передача нервного импульса, но и в регуляции обмена веществ (Фурдуй Ф.И., 1986). Изучению роли холинергических систем в регуляторных механизмах биохимических процессов в организме вообще (Денисенко П.П., 1980; Турпаев Т.М. и соавт., 1981; Кассиль Г.Н. , 1983; Голиков Н. и
соавт., 1985; Беллер Н.Н. и соавт., 1986) и при острых действиях стресс-факторов, в частности (Денисенко П.П., 1978; Демин Н.Н., 1979; Тонкоглас В.Л. и соавт., 1980; Горизонтов П.Д., 1983; Фурдуй Ф.И., 1986; Тайц М.Ю. и соавт., 1988; Липшиц Р.У. и соавт., 1989; Хайдарлиу С.Х., 1989; Судаков К.В., 1992; Konecka А., 1992), придается большое значение. Считается, что АХЭ, как важный компонент холинергической системы, занимает ключевую позицию в неирогуморальнои регуляции (Марченко А.Ф. и соавт., 1980), а изменение ее активности по существу является одним из интегральных тестов не только холинергических, но и других медиаторных систем. Показано также (Суворова Н.В., Суворов В.В., 1975), что активность ХЭ по сравнению с содержанием АХ является более стабильным показателем и в большей степени отражает характер реагирования холинергических систем при изменении условий среды и способности к адаптации.
Следует отметить, что вышеизложенное относится к АХЭ мозга, нервных элементов и других органов. Что же касается АХЭ эритроцитов, то ее физиологическая роль полностью не установлена. До недавнего времени (Бородюк Н.Р., 1990, 2000; Брагинская Ф.И. и др., 1990; Маслова М.Н., 1994; Казенное A.M., Маслова М.Ы. и др., 1999; Somani S.M., 1995; Grisaru Dan et al., 1999) АХЭ, как фермент эритроцитов, практически не изучалась с точки зрения участия в обмене веществ при адаптации организма. Причиной этому могут служить обстоятельства, связанные с необходимостью определения активности АХЭ при стрессе в нативных эритроцитах. Выбор нами эритроцита, как объекта исследования, объясняется сравнительной простотой его морфологии и, в связи с этим, возможностью абстрагирования от влияний на активность АХЭ многих продуктов обмена веществ самой клетки. С другой стороны, плазматическая мембрана эритроцита, как важнейший элемент клетки, содержит центры специфического связывания биологически активных
веществ (инсулин, СТГ, АХ, р-адренергические центры и др.), что свидетельствует об ее участии в передаче сигналов гормональной и нервной систем (Казеннов A.M., Маслова М.Н., 1987) и может иметь значение для коррекции реакции на стрессовые воздействия. Систематическое изучение АХЭ нативных эритроцитов при воздействии на сельскохозяйственных животных условий, однозначно характеризующихся как стрессовые, дало нам возможность интерпретировать полученные результаты с позиции развития адаптационного синдрома.
Стресс проявляется на различных (морфологическом и физиологическом) уровнях организма животного: молекулярном, клеточном, органном и системном. Выполненные нами исследования по изучению действия ионизирующей радиации на АХЭ, полученной из эритроцитов, на АХЭ целых эритроцитов in vitro и на АХЭ целых эритроцитов in vivo могут помочь проследить за стрессогенным изменением изучаемого фермента на различных уровнях его функционирования.
Из анализа источников литературы следует, что такие воздействия на организм животных как хирургическая операция, острая кровопотеря, кровопаразитарная патология, алиментарный дискомфорт, воздействие дийодтирозина, ионизирующее излучение широко распространены в практике ветеринарной медицины и являются факторами стрессогенной природы. Изучение литературы по исследованию активности АХЭ при воздействии на сельскохозяйственных животных вышеперечисленных стрессоров свидетельствует о недостаточной изученности вопроса о сопряженном изменении эритрона и кинетических характеристик фермента АХЭ целых эритроцитов крови в процессе формирования стрессовой реакции, развития адаптационного синдрома.
Целью исследования являлось установление направления эволюционной трансформации АХЭ натнвных эритроцитов крови на основе изучения ее кинетических свойств у различных видов млекопитающих и человека и подтверждение его направленностью изменений фермента в условиях воздействия на животных адаптогенных факторов.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Определить активность АХЭ натнвных эритроцитов крови, среднюю активность АХЭ эритроцита, константу скорости взаимодействия фермента с ингибитором необратимого действия (Кп) у с-х. животных нескольких видов и оценить их как результат эволюционного процесса.
Изучить закономерность адаптационного изменения некоторых характеристик эритрона и активности АХЭ нативного эритроцита при воздействии на животных следующих факторов стрессогешюй природы: хирургической операции в условиях электроанальгезии, электроакупунктурной анальгезии, проводниковой анестезии, искусственной геморрагии, гемолитической анемии, изменения состава кормового рациона, воздействии рентгеновских лучей, введения дийодтирозина, ограничивающего в определенной степени стрессовую реакцию.
Исследовать в сравнительном аспекте изменение количественных и морфологических параметров эритроцитов и кинетических характеристик АХЭ этих клеток в динамике адаптационного синдрома.
Выявить гидролитические возможности АХЭ эритроцитов в условиях воздействия дистрессора на фермент in vitro и оценить их с позиции наличия потенциального резерва адаптационных свойств фермента.
5. Разработать рекомендации по применению в практике ветеринарной медицины результатов исследования активности АХЭ целых эритроцитов крови животных при адаптации к воздействию стрессогенных факторов.
Научная новизна. Установлен видовой ряд млекопитающих по возрастающему значению средней активности АХЭ нативного эритроцита мыши, собаки, норки, лошади, кролика, овцы, свиньи, крупного рогатого скота и человека, отражающий направление эволюционной трансформации фермента и ее зависимость от экологических и доместикационных факторов. Такое направление подтверждается направленностью изменений АХЭ в условиях воздействия на животных адаптогенных факторов, встречавшихся на эволюционном пути развития млекопитающих.
Проведено комплексное исследование АХЭ целых эритроцитов, сообразуясь с морфологическими параметрами клеток при стрессовом состоянии животных и в динамике адаптационного синдрома.
Впервые для анализа стрессового состояния и развития адаптационного синдрома использованы следующие величины: средняя активность АХЭ эритроцита, Кц (константа скорости ингибирования АХЭ) в сочетании с изменением его морфологического параметра - объема.
Впервые определены кинетические характеристики АХЭ на высокоочищенных препаратах фермента отечественного производства, АХЭ целых эритроцитов при облучении in vitro и in vivo и интерпретированы с позиции проявления стрессовой реакции на молекулярном, клеточном уровнях и на уровне организма.
Исследования по изучению АХЭ целых эритроцитов в динамике адаптационных процессов впервые выполнены на крупных сельскохозяйственных животных или животных, имеющих сельскохозяйственное значение.
Установлено, что эндогенный ингибитор АХЭ эритроцитов,
выделяющийся при стрессах, устойчиво фиксируется на эритроцитах, не
отмывается физиологическим раствором и способствует
парасимпатическим проявлениям в организме.
При стрессовых проявлениях умеренного (физиологического)
характера активность АХЭ целых эритроцитов увеличивается для
превалирования симпато-адреналового звена, имеющего
мобилизационный характер. При дистрессах уменьшение активности фермента трактуется с позиции необходимости усиления парасимпатического эффекта для снижения темпа чрезмерного расходования энергетических ресурсов, защиты сердца и других важнейших органов.
Установленное при дистрессах изменение активности АХЭ целых эритроцитов является тестом состояния холинергических процессов и их смещения в равновесной системе: симпатический - парасимпатический (холинергический) отделы вегетативной нервной системы.
Теоретическая и практическая ценность работы. Изучение кинетических свойств АХЭ нативных эритроцитов крови различных видов животных и человека позволило установить их возрастание от млекопитающих животных к человеку и зависимость эволюционирования системы АХЭ-эритроцит от экологических и доместикационных факторов. Однонаправленное изменение кинетических констант фермента АХЭ эритроцитов у животных в процессе формирования адаптационно-компенсационных механизмов в стадии резистентности общего адаптационного синдрома после воздействия на животных различных адаптогенных факторов совпадает с направлением эволюционного совершенствования фермента и его носителя — эритроцита. Установленные биохимические и морфологические изменения эритроцита являются адаптивным отражением стрессорных воздействий,
встречавшихся на эволюционном пути развития, следствием молекулярных механизмов эволюции и отражает адаптивность эволюционного процесса.
Теоретическая значимость работы состоит и в том, что она позволяет представить взаимодействие двух отделов вегетативной нервной системы при стрессах на основе химического равновесия концентрации веществ в крови, осуществляющих симпато-адреналовую и парасимпатическую функцию. АХЭ целых эритроцитов является триггером этого равновесия, с помощью которого оно может продолжаться или смещаться скачком по сигналу непосредственно от центральной нервной системы, или - через гормональную систему.
Практическая ценность работы заключается в том, что коррекция стрессовых состояний и адаптационного синдрома у животных в условиях промышленных технологий, стихийных бедствий, аварий, катастроф может быть основана на возможности сдвига равновесия между симпато-адреналовым и парасимпатическим звеньями вегетативной нервной системы путем воздействия лекарственных препаратов - ингибиторов и активаторов - на АХЭ целых эритроцитов. Для практической ветеринарной медицины могут иметь значение результаты по определению силы реакции организма при болевом стрессе в условиях различных видов обезболивания по степени изменения активности АХЭ целых эритроцитов крови животных при полостных операциях. Кроме того, использование величины средней активности АХЭ эритроцита, как методического приема, способствует более раннему выявлению начала адаптационного механизма повышения активности АХЭ при дистрессах, чем это следует из расчета активности фермента на 1 мл крови (эритроцитов). Эта величина может найти применение в лабораторной практике, отражать интенсивность адаптационных процессов в нервной
системе и костномозговом кроветворном процессе и, таким образом, иметь прогностическое значение.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Видовое значение кинетических свойств АХЭ эритроцита млекопитающих отражает филогенетическое совершенствование фермента и его носителя в направлении видов, занимающих верхние ступеньки эволюционной лестницы, а также зависимость этого процесса от воздействия экологических факторов и доместикации. Эволюционная направленность совершенствования фермента подтверждается улучшением его кинетических свойств у животных в стадии резистентности общего адаптационного синдрома после воздействия стрессогенных факторов.
Устойчивые изменения эритрона и кинетических свойств АХЭ эритроцита после воздействия на животных стрессогенных факторов отражают фенотипический процесс адаптации и характеризуют сдвиг адаптационных процессов на новый уровень.
Для анализа адаптационных процессов, состояния эритроцитарного равновесия и равновесия между симпато-адреналовым и холинергическим отделами нервной системы может быть использована величина активности АХЭ эритроцитов, средняя активность АХЭ эритроцита, активность АХЭ клеточного объема эритроцита (АКО).
Проявление стрессовой реакции при воздействии ионизирующей радиации на АХЭ эритроцитов на молекулярном, клеточном уровнях при облучении in vitro и на клеточном уровне при облучении in vivo характеризуется схожестью и различием.
Существует необходимость и возможность использования в клинической практике кинетических показателей АХЭ целых эритроцитов и АХЭ эритроцита при адаптационных процессах, изменяющих количество эритроцитов в единице объема крови.
Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации изложены и обсуждены на конференциях Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, 8-ой, 9-ой, 10-ой Межгосударственных межвузовских научно-практических конференциях «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (СПб., 1996, 1997, 1998), в материалах II Международной конференции (Белая Церковь, 4-5 июня 1998), на научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии (Казань, 2001), на Первом международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (СПб, 2001).
Внедрение. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах биохимии, радиологии и БЖ, патологической физиологии, фармакологии и токсикологии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины и других академий. При этом используются написанные по материалам диссертации методические указания «Стрессы у животных при стихийных бедствиях, авариях, катастрофах» (Состояние холинергического звена вегетативной нервной системы при дистрессах) (СПб., 1996).
Изданы «Рекомендации но применению в практике ветеринарной медицины результатов исследования активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов крови животных при адаптации к воздействию стрессогенных факторов (СПб., 1998).
Результаты исследований использованы в учебно-методическом пособии по оперативной хирургии для студентов СПбГАВМ: В.Н.Виденин «Послеоперационные гнойно-воспалительные осложнения. Профилактика и лечение».- СПб., Лань, 2000.- 98 с.
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 27 статей, в том числе в центральных журналах: «Радиобиология» (3), ВИНИТИ (1),
«Фармакология и токсикология» (1), «Лабораторное дело» (1); в материалах международной конференции (Белая Церковь) (1); в материалах 8,9,10 Межгосударственных межвузовских научно-практических конференциях (Санкт-Петербург) (3).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 328 машинописных листах и иллюстрирована 34 таблицами и 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, включающего 609 источников, из них 141 - иностранных авторов.
Диссертационная тема «Изменения ацетилхолинэстеразы целых
эритроцитов у животных при стрессах», утвержденная на Ученом совете
Академии 23 мая 1996 года, протокол № 9, является самостоятельным
разделом плана научно-исследовательской работы Санкт-Петербургской
государственной академии ветеринарной медицины «Влияние некоторых
стрессогенных факторов на активность ацетилхолинэстеразы». Номер
Государственной регистрации 01860125583, 1996. На Ученом совете
Санкт-петербургской Государственной академии ветеринарной медицины
от 6 февраля 2003 г., протокол № 6, изменено (уточнено) название темы
докторской диссертации «Адаптационные трансформации
ацетилхолинэстеразы эритроцитов у сельскохозяйственных животных».
Выражаю благодарность Злобину B.C., Самчуку В.И., Чучину В.Н., Стекольникову А.А., Конопатову Ю.В., Лютинскому СИ., Юшкевичу А.С., Курило А.И., Ильюткину Г.Н., Попову СМ: за оказание консультативной помощи в процессе работы над диссертацией и участие в ее обсуждении.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Эритрон и ацетилхолинэстераза. Строение, функция и биологическая роль фермента
Эритроцитам принадлежит важная роль в адаптации человека и животных к условиям внешней среды. Они доставляют в органы и ткани, связанные с АТФ-зависимыми процессами, немедиаторной АХ, катехоламины и инсулин. В результате реакции гидролиза немедиаторного АХ ацетилхолиэстеразой эритроцитов, которая сопровождается ритмическим выделением энергии, эритроциты задают околосуточный ритм и обеспечивают эргонтическую корреляцию АТФ-зависимых процессов со средой обитания. Повреждающее действие физических и химических факторов прежде всего отражается на биологической активности эритроцитов (Бородюк Н.Р., 1990, 2000).
Коммитированные в эритроидном направлении стволовые клетки являются первым, наименее зрелым классом клеток, который следует отнести к популяции эритрон. Созревание этих клеток до стадии эритробласта, начинающего синтез гемоглобина, сопровождается изменением их пролиферативной активности и чувствительности к эритропоэтину. Далее в клетках происходят морфологические и функциональные изменения (синтез специфических белков плазматических мембран и цитоплазмы), свойственные зрелым эритроцитам. В зависимости от стадии зрелости различают эритробласты, пронормобласты, базофильные, полихроматофильные и оксифильные нормоциты и ретикулоциты. Полностью созревание эритроцитов заканчивается в циркулирующей крови, куда клетки выходят из стадии ретикулоцитов. Таким образом, популяция эритрон состоит из трех функционально различных классов клеток - класса коммитированных, созревающих (морфологически определяемых) и зрелых эритроцитов периферической крови и является саморегулирующейся гомеостатической системой (Козлов В.А., 2001). В регуляции эритропоэза принимает участие эритропоэтин и ингибиторы эритропоэза, действие которых может реализоваться как на уровне созревающих эритроидных клеток, так и на более ранних стадиях дифференциации (Шашков А.В., Терсков И.А., 1986). Современные научные данные показывают, что на процессы эритропоэза и дифференциацию клеток красной крови влияет вегетативная нервная система. Так, катехоламины способны модулировать пролиферативный статус клеток кроветворной системы (Гольберг Е.Д.и соавт., 1997). В то же время АХ, принимая участие в регуляции кроветворения, увеличивает число клеток эритроидного ростка (Любовцева Л.А., 1993). Адреналин уменьшает подвижность жирных кислот липидов мембран эритроцитов (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981), в то время как АХ в повышенных концентрациях изменяет заряд их мембран и способствует разрушению этих клеток. В эритроцитах обнаружено значительное число мембранных ферментов, в том числе АХЭ . При взаимодействии структуры мембраны с гормонами и другими веществами происходят структурно-функциональные изменения состояния эритроцитарных хмембран. В этих случаях активность мембранных ферментов эритроцита может зависеть как от прямого воздействия на фермент гормона, так и от косвенного — в случае изменения конформации мембраны. В то же время активность фермента может зависеть и от влияния гормонов и других эффекторов на синтез фермента в клетках в процессе ранней дифференциации при эритропоэзе. Это относится и к АХЭ эритроцитов. По специфичности расщепляемого субстрата различают два основных типа холинэстеразы: истинную - ацетилхолинэстсраза (ацетилгидролаза ацетилхолина, КФ 3.1.1.7) и ложную - псевдохолинэстераза (холинэстераза - ацилгидролаза ацилхолинов, КФ 3.1.1.8). Ацетилхолинэстераза (АХЭ) содержится в мозгу, эритроцитах и нервных окончаниях (Augustinsson К.В., 1973; Диксон М., Уэбб Э., 1982), находится в двух формах: мембраносвязанной и растворимой (Маслова М.Н., Резник Л.В., 1984). Как показано в обзорной статье A.A.Lawson et al. (1987), АХЭ эритроцитов расположена на наружной их мембране, являясь интегральным белком клеточных мембран и составляет 0,2-0,3% от всего мембранного белка. Предполагается, что в образовании АХЭ принимает участие ХЭ плазмы крови (Kutty К.М., 1980), подтверждается мозаичная концепция строения мембраны эритроцитов и что активность ее связана с липопротеин-протеин взаимодействием . Было установлено (Keyhani Е et al., 1981), что биосинтез АХЭ в эритроцитах мышей происходит во время дифференциации и созревания клеток. АХЭ активно синтезируется в базофильных эритробластах, где она локализуется в ядерной хмембране, эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. В ортохроматофильных эритробластах АХЭ присутствует только в аппарате Гольджи, что свидетельствует о прекращении биосинтеза на этой стадии созревания. Биосинтез АХЭ регулируется ацетилхолином (Голиков С.Ы. и др., 1985) и антисенс-олигонуклеотитами (Soreq Н. а.а., 1994) путем их воздействия на мРНК гена фермента. Изучен аминокислотный состав АХЭ эритроцитов крупного рогатого скота (Rosenberry Т., 1975), ее синтез и свойства (Mendelsonl. etal., 1998).
Фермент АХЭ имеет два центра связывания: активный и аллостерический центр. Энзим имеет рН-оптимум 7,5- 8,5" (Никольская Е.Б., 1982), ингибируется избытком АХ и дисульфидных групп, а также при снижении концентрации ионов кальция и отклонения от оптимального значения рН.
В эритроците человека АХЭ, как наиболее изученная, находится на наружной стороне мембраны в кортикальной зоне (Falugi N., 1985) и тесно связана с гликопротеином зрелых эритроцитов. АХЭ прочно связана с мембранными белками эритроцитов, или она сама является белком, встроенным в мембрану так, что лишь ее активный центр находится на наружной поверхности клетки. Определена композиция (аминокислотный состав в процентном отношении) АХЭ эритроцитов человека. Установлена молекулярная гетерогенность холинэстераз (Долго-Сабуров В.Б., Панюков А.Н., 1970). Фермент существует в двух формах: с молекулярной массой 85000 и 160000. Основная молекулярная форма - димеры с молекулярной массой 160000, соединенные между собой дисульфидными связями (Rosenberry T.L., 1984). Каталитическая активность АХЭ присуща в основном димеру. На одном эритроците находится 700 - 800 димеров (Ott P. et al., 1982). Пять множественных молекулярных форм АХЭ находятся в диапазоне от 4S до 63S. Изоэлектрические точки молекулярных форм равняются 4,55; 4,68; 4,81; 4,98; 5,15. Различают два вида АХЭ: асимметричная и глобулярная (Briminjoin S. et al., 1986).
Изменение эритрона и каталитических свойств АХЭ эритроцитов при воздействии на животных стрессогенных факторов
Как свидетельствуют исследования многих ученых наиболее сильное стрессовое действие на организм оказывали операционная травма и наркоз (Волков В.Е., 1976). Еще Г. Селье показал (1960), что на любой стресс, в том числе на хирургический, кора надпочечников отвечает повышенным образованием и введением в кровь кортикостероидных гормонов. При операционной травме роль в передаче патологической импульсации, вызывающей и поддерживающей болезненный процесс, принадлежит симпатической нервной системе. Доказано, что даже в условиях современного наркоза возникает активизация симпато-адреналовой системы (Панин Л.Е., 1983) и функция коры надпочечников (Волков В.Е., 1976). В ответ на хирургическое вмешательство активизируется гипоталамо-гипафизарно-надпочечниковая система, в крови увеличивается выход глюкортикоидов, минералкортикоидов. Причем, отмечается наличие только двух фаз стресса: первичная фаза активации и вторичная фаза торможения (Мышкин К.И., 1983). При механической травме повышается концентрация в сыворотке АКТГ, кортизола и альдостерона. Активность гипофизарно-адреналовой системы находится в прямой зависимости от тяжести травмы и выраженности крово- и плазмопотери (Яковлев Г.М., 1990). Г.Селье (1960) в патогенезе стресса после гормонов надпочечников придавал значение гормонам щитовидной железы. Некоторые исследователи считают, что функциональное состояние щитовидной железы при операционном стрессе ответственно за интенсивность регенерационных процессов в тканях и регуляцию приспособительных реакций организма животных (Давыдов В.У., 1982). Имеется обширная литература о стимуляции выделения АКТГ, кортизола и Р-эндорфина при хирургических операциях. Хирургический стресс стимулирует секрецию катехоламинов и, прежде всего, адреналина, а сама операция - норадреналина (Фурдуй Ф.И., 1990). 0 сложных взаимоотношениях эндокринных комплексов при травматическом стрессе свидетельствует работа А.Д.Робу (1989). У людей предоперационный и операционный период характеризуется высоким индексом напряжения, который пропорционален активности симпатического отдела. В послеоперационный период активизируется парасимпатический отдел вегетативной нервной системы (Скалозубова СИ., 1995). В условиях стресса значительно усугубляется расстройство гомеостаза. При тяжелых формах хирургического стресса возникают нарушения различных видов обмена веществ, в том числе медиаторного обмена (Лихтенштейн А.О., 1976). У больных оперативное вмешательство способствует выходу системы гомеостаза на новый уровень интенсивности, что способствует быстрейшему достижению сроков нормализации параметров гомеостаза. (Пучиньян Д.М. и соавт., 1995). В системе нарушения гомеостаза важное значение имеет изменение кинетики ферментативного катализа и, в частности, фермента АХЭ. Как установил М.М.Ищенко (1967) (цит. по Розенгарту В.И., 1973) снижение активности АХЭ в крови наблюдалось при выраженном болевом синдроме. Изучая активность холинэстеразы цельной крови у кроликов после облучения и нанесения травмы костей, С.А.Борухов с соавт. (1972) установил, что через сутки после воздействия отмечалось снижение активности фермента. Б.В.Кулагин, В.К.Кулагин (1976), характеризуя сдвиги нейрогуморальных параметров при действии на организм шокогенных факторов среды, указывают, что при этом большое значение имеет угнетение активности АХЭ мозга, внутренних органов, плазмы и эритроцитов, т.к. экзогенное введение этого фермента нормализует нарушение различных функций. ГЛЯ.Базаревич (1976), изучая изменения медиаторных систем в условиях травматического повреждения организма, отмечал, что содержание АХ в крови в органах и тканях изменяется двояко. В одних случаях в начальных фазах концентрация АХ повышается, а в других снижается. В терминальный период уровень АХ крайне низок. Из опытов следует, что изменение функциональной активности систем АХ в экстремальных состояниях зависит от их исходного состояния. На основании результатов опытов о снижении активности ХЭ в крови крыс при травматическом шоке А.Г.Самойлов с соавт. (1976) делает вывод об усилении бронхоконстрикции в результате повышения концентрации АХ. После введения животным экзогенной АХЭ концентрация АХ в крови снижалась, а активность сывороточной и эритроцитарной АХЭ возрастала, что полностью подтвердило предположение автора о значении системы АХ-ХЭ в патогенезе легочных осложнений при травматическом шоке. При остром и хроническом проявлениях болезней животных, связанных с травмами (Семенов Б.С. и соавт., 1979) была установлена различная степень снижения активности ХЭ в крови. При исследовании различных показателей изменения гомеостаза при руменотомии у крупного рогатого скота было установлено и снижение активности АХЭ крови (Видении В.Н., Макеева Е.Е., 1995).
Активность АХЭ эритроцитов при электроанальгезии В настоящее время в медицине и ветеринарной медицине происходит интенсивный поиск новых методов обезболивания при хирургических операциях и патогенетической терапии. Они должны отличаться меньшей трудоемкостью, простотой, рентабельностью и в то же время отвечать основным условиям - обездвиживанию, обезболиванию и стимуляции защитных сил организма. Считается, что этим требованиям отвечают методы электроанальгезии (Начатов Н.Я., Сизинцев А.Г., 1989; Сундуков П.П, Начатов Н.Я, 1991; Сизинцев А.Г., 1991; Schwerg Н.Р., 1990).
Известно, что различные методы акупунктуры (Игнатов Ю.Д. и др., 1990; Teuscher R., 1990), электроанальгезии (Самчук В.И., 1986), электроакупунктурной анальгезии (Чучин В.Н., 1985) положительно влияют на обмен веществ, минеральный состав плазмы крови телят (Конопатов Ю.В. и соавт., 1987), клинические и гематологические показатели.
Положительный лечебный эффект воздействия на больных животных и людей акупунктуры и ее разновидности - электроакупунктуры до настоящего времени однозначно не объяснен. Считается, что в основе такого эффекта лежит действие физических агентов как стрессогенного и адаптационного фактора (Маркелова В.Ф. и соавт., 1989), их неспецифическое воздействие на нервно-рефлекторные и гуморальные процессы (Колесов О.Е. и соавт., 1987). Стрессогенную природу аналгетического эффекта, достигаемого иглоукалыванием, некоторые исследователи видят в сочетанном повышении концентрации АКТГ и 0-эндо-морфина - эндогенного обезболивающего вещества (Фурдуй Ф.И., 1990). Другие - связывают анальгетический эффект с главенствующей ролью адренергической системы и связанной с ней модуляцией нейрофизиологических и нейромедиаторных систем (Игнатов Ю.Д. и др., 1990).
Значение величин индивидуальной активности АХЭ целого эритроцита некоторых видов животных
Изучение действия различных стрес согенных факторов на ферменты эритроцитов предполагает измерение их активности в целых клетках (Маслова М.Н., 1994). Чтобы судить о мере этих изменений при каждом виде воздействия необходимо знать исходную активность на 1 мл эритроцитов.
Установив, что активность фермента в этих случаях может меняться и за счет количества эритроцитов, было решено использовать расчетный показатель активности (мкмоль/мин/эр). Этот критерий не зависит от количества эритроцитов в единице объема крови, которое может меняться и при физиологическом состоянии животных. При патологических состояниях животных, связанных с изменением количества эритроцитов в крови, судить об изменении АХЭ эритроцитов в расчете на 1 мл крови нельзя, т.к. при этом может измениться качество эритроцита в отношении его ферментативной активности. И возможно такое состояние организхма, при котором меньшее, (или большее) количество эритроцитов обеспечивает физиологическую активность фермента в крови. В этом случае наше представление об истинном состоянии эритроцита как отдельной клетки - носителя ферментативной активности — было бы ошибочным. Вот почему для верности суждения в подобных случаях необходимо рассчитывать ферментативную активность эритроцита различных видов животных и человека не только при патологических, но и при физиологических состояниях организма.
Результаты эксперимента по определению этого показателя у 8 коров и 11 лошадей представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы активность АХЭ коров в расчете на 1 мл целых эритроцитов по сравнению с таковой у лошадей оказалась в 2,92 раза выше. Далее из наших опытов следует, что при расчете активности фермента на 1 эритроцит коров средняя активность АХЭ эритроцита была в 3 раза выше, чем у лошадей.
Из полученных данных следует, что эритроцит как клетка одного вида животных в отношении ацетилхолинэстераэной активности является неравноценной по отношению к клетке другого вида животных.
Изучая видовое значение активности АХЭ целых эритроцитов, мы определили активность фермента в расчете на 1 эритроцит и в расчете на 1 мл эритроцитов человека и различных видов животных (табл.2). Так, активность крупного рогатого скота как в расчете на 1 эритроцит, так и в расчете на 1 мл крови (эритроцитов) в 1,5 раза выше, чем у свиней и приблизительно в 3 раза выше, чем у кроликов, лошадей, норок и овец. В то же время активность АХЭ человека в расчете на 1 эритроцит и на 1 мл крови примерно в 2,5 раза больше, чем у крупного рогатого скота.
У людей и крупного рогатого скота указанные выше параметры были рассчитаны с учетом пола оказалось, что у женщин активность АХЭ в расчете на 1 мл эритроцитов равнялась 5,79±0,38 мкмоль/мин/мл, а у мужчин соответственно 7,34±0,40 мкмоль/мин/мл. То есть активность АХЭ у мужчин в расчете на 1 мл эритроцитов оказалась в 1,27 раза выше, чем у женщин (р 0,02). Однако, в расчете на 1 эритроцит активности АХЭ у женщин и мужчин оказались весьма близкими и разница в их показателях недостоверна (р 0,5). Различие в активности АХЭ у коров и быков в расчете на 1 эритроцит также оказалась недостоверным (р 0,5), хотя показатели активности фермента у них в расчете на 1 мл достоверно различаются (р 0,02).
В следующей серии опытов была поставлена задача определить активность АХЭ эритроцитов в расчете на одну целую клетку и установить устойчивость данного фермента целых эритроцитов к ингибиторным свойствам армина у человека и животных в сравнительном аспекте. Специфические ингибиторы АХЭ, как и субстраты, в организме людей и животных действуют на целые клетки - эритроциты. Вот почему изучение каталитических и антиингибиторных свойств АХЭ эритроцитов в условиях целой клетки является актуальным. Определенную информацию о видовой устойчивости АХЭ эритроцитов людей и исследованных животных может дать анализ величины константы скорости взаимодействия ингибитора АХЭ необратимого действия армина с ферментом (Кп) (табл. 3).
Активность АХЭ эритроцитов при руменотомии у телок в условиях проводниковой анестезии
Изучение свойств фермента при облучении in vitro может обнаружить природные потенциальные каталитические возможности АХЭ к воздействию стрессогенного фактора и их изменение в условиях отсутствия опосредованного влияния гормональных и других биохимических структур обмена веществ в отличие от того, как это происходит при облучении in vivo.
Наши опыты по облучению высоко очищенных препаратов АХЭ из эритроцитов человека, АХЭ суспензии эритроцитов крупного рогатого скота и кроликов (табл. 29) с более широким диапазоном доз облучения подтвердили экспоненциальную зависимость снижения активности энзима от дозы (рис. 6,7), установленную нами и в предыдущих работах (Бондарь А.А., 1974), и в то же время дали возможность выбрать наиболее информативные точки на экспоненте. Ими оказались точки, отражающие дозы, вызывающих изменения активности фермента на 70, 50 и 30 процентов. Определение Кц при этих дозах облучения АХЭ могло дать необходимые сведения для суждения и о качественной стороне изменения активности энзима. Кроме того, широкий размах доз облучения (28 - 6000 Гр) помог выбрать критические дозы облучения, при которых активность фермента не меняется, а дополнительная нагрузка в виде действия специфического ингибитора помогает установить качественные изменения фермента.
Дальнейшее изучение облученного фермента предполагало комбинированное воздействие на него ионизирующей радиации и химического агента. Методический прием состоял в том, что армии как необратимый ингибитор АХЭ (Волкова Р.И., 1965; цит. по Бресткину А.П. и соавт., 1997) действует на облученный фермент в качестве дополнительной нагрузки, «проявляя» таким образом возможно скрытые повреждения фермента радиацией. После облучения in vitro АХЭ-препарата из эритроцитов человека и крупного рогатого скота у-лучами Cs в дозах соответственно 224 и 1200 Гр на них воздействовали армином, который угнетал активность необлученного фермента на 40% и определяли Кц .
При определении констант скорости взаимодействия ингибитора (Кц) с необлученным ферментом из эритроцитов человека и крупного рогатого скота при 37 С установлено, что они равнялись соответственно (7,68±0,17) х 106М" мин"1; (8,99±0,22) х 106 М-1 мин1 и (4,92±0,20) М"1 мин"1 (табл.28). Как видно из данной таблицы, константы скорости ингибирования армином необлученной АХЭ из эритроцитов человека больше скорости ингибирования необлученной АХЭ из эритроцитов крупного рогатого скота. Видимо, этот результат можно объяснить большей доступностью активных центров фермента из эритроцитов человека для атаки ингибитором ввиду большей степени очистки фермента или его видовой особенностью. После облучения растворов фермента из эритроцитов человека в дозе 224 Гр активность его снижалась на 30% по сравнению с активностью необлученного фермента. В то же время облучение АХЭ-препарата из эритроцитов крупного рогатого скота в дозах 750, 1200 и 3600 Гр приводит к снижению активности фермента соответственно на 8, 28 и 55 процентов.
Из приведенных результатов опытов следует, что константы взаимодействия ингибитора (Кц) с облученным ферментом из эритроцитов крови человека и крупного рогатого скота несколько изменялись и равнялись соответственно (8,01± 0,16) х 106 М"1 мин"1; (9,59±0,24) х 106 М" 1 мин"1 и (5,23±0,23) Х- 106 М"1 мин"1. При статистической обработке результатов разница величин Кц облученного и необлученного фермента оказалась недостоверной, хотя и имела тенденцию к незначительному увеличению с возрастанием дозы облучения. Таким образом, на основе полученных данных можно сделать следующий вывод. После облучения растворов препаратов АХЭ из эритроцитов крови человека в дозе 224 Гр и из эритроцитов крови крупного рогатого скота в дозах 750, 1200 и 3600 Гр константа скорости взаимодействия армина с облученным ферментом (Кц ) практически не изменяется по сравнению с константой скорости взаимодействия армина с необлученным ферментом, т.е. скорость ингибирующего влияния армина на облученный фермент остается такой же, как и на необлученный фермент.
Продолжая использовать необратимый ингибитор АХЭ армии как инструмент исследования облученного фермента в различных дозах, мы предполагали получить дополнительную информацию о механизме радиационной инактивации фермента. Растворы препарата АХЭ отечественного производства, полученного из эритроцитов крови человека, подвергали облучению у-лучами Cs в дозах 224, 370 и 700 Гр. Затем, воздействуя армином на облученный фермент, определяли бимолекулярную константу скорости взаимодействия армина с необлученным и облученным ферментом Кц. После облучения растворов в дозах 224, 370 и 700 Гр активность фермента снижалась соответственно на 30, 50 и 70% (табл. 29).