Введение к работе
Актуальность теш. Применение метода кскуссгьенного осеменения в животноводстве предоставило большие возможности для селекционно-племенной работы. Особенно широкие герспективы появились в свяли с открытием З.К. Миловановым, И.И.Соколовской, И.В.Смирновым (1932 с приоритетом 1947 года) метода длительного сохранения спермн сельскохозяйственных животных в глубоко^вмороженном состоянии. Использование данного метода в практике животноводства позвоіяет проводить племенную работу а целом со всей породой животных вне зависимости от ареала ее распространения , с использованием быков-производителей, проверенных по качеству потомства,
Фундаментальные исследования S.H. Ыилованова (1952),Ф.И. Остатке (1968, 1996), Б.М.Платова (19751, В.П.Кононова (1963), В.А. Наука (1991), легли в основу разработки практически прием-гомых технология криоконсервации сперма производителей if вос-прои?водетва раэнхэс видов сельскохозяйственных животных.Согласно им, поддержание гомеостаэа спермиев в процессе криохснсерва-ции реализуется путем применения различных синтетических сред, которые безвредны для cj№f.vti33( предохраняют их от холодового удара и агглютинации, имеют достаточную буферную емкость,опре-деленн!:е тоничность и рН, обладают бактерицидными свойствами. Основными компонентами синтетических сред язляютсл неэлектролиты, буферные соединения, протекторы липидноЕ природы, антиоксиданте и антибактериальные вещества.
В скотоводстве -»ту проблему можно считать решенной, одна-ко около половины спермиев не восстанавливают свои фунщни после замораживания и оттаивания.
Эффективность метода искусственного осеменения зависит ;акжв от качества получаемой от буков-производителей спермопро-дукнии,способа кркоконсервации и использования оттаянной спермы в практике искусстгенного осеменения животных.Иэоестно много способов оценки функциональной полноценности гамет но ни од-чн ил них не имеет непосредственной связи с предполагаемой стельность». Это снижает эффективность воспроизводства, поскольку зти мероприятия во многих случаях не имеют логического эавер-кенкя, так как не заканчиваются отбором быков-улучшателей, оцененных по оплодотворяющей способности их спермы,, ввиду отсутствия объективных критериев і а ^ЗДРЯ^Н^'И*-"^3 ник» ислоль-
-Моск.еел. «*. , »'яде**« I
им. К. ААТиЯ0»й*7її
кование которых может улучшить качество потомства.Это усугубляется еще и тем, «то в связи с несовершенотвом системы выращивания, отсутствием достаточно объективного критерия оценки эффективности технологии выращивания, прогнозирования продолжительности их хозяйственного использования и качественных показателей сперкопродукции быки-производители к моменту завершения их оденки в большинстве случаев теряет воспроизводительнув способность*
Метод искусственного осеменения животных был создан как средство реализации генотипкческой селекции. Однако следует заметить, что больше возможности его не реализованы э направлении повышения сроков использования быков-производителей, качества спермопродукции,эффективности способов криоконсервации и использования спермы в сети искусственного осеьйненкя. Боль-лих перспектив можно ожидать от разработки экспресс-метода отбора производителей по плодотворлицей способности спермы и способов повышения ее качества путем целенаправленного влияния на сперматогенез а на процесс криоконсервации.
Цель л задачи.исследований.Цельв настоявши работы являлась разработка методов увеличения результативности воспроизводства стада сельскохозяйственных животных путем изучения фундаментальных механизмов и разработки технологических приемов повышения эффективности использования быков-производителей.
Для достижения цели намечалось решение следующих задач:
-
Изучить адаптивный потенциал спермиев и влияние его на оплодотворяющую способность деконсервированных спермиев,
-
Выяснить механизмы развития адаптивных реакций под влиянием факторов эндогенной и экзогенной природы.
-
Изучить влияние факторов различной природы на функциональный гемеостаз спермиев в процессе криококсервацта.
-
-Выявить взаимосвязь между адаптивным потенциалом быков-производителей к качеством их спермопродукции.
-
Разработать и испытать в производственных условиях способ отбора, прогнозирования и повышения качества спермопродук-ции быков-производятелей.
Научная новизна работы. Впервые изучена взаимосвязь между адаптивным потенциалом быков-производителей и качеством их спер-мопродукции. Получены новые данныз, свидетельствующие о том,что
высокому адаптивному потенциалу спермиев соответствует и высокие адаптивный потенциал бнко»-пронз80дителе!!.Докаэано, что путей псвш»нкя адаптивных возможностей сперла (усиление чнер-геткси, буферной и антиоксидантний систем:» нормализации ионного баланса) можно повысить ее биологическую полноценность,
Установлено, что по адаптивным возможностям спермы можно судить об адаптивных возможностях производителя. Выявлены индивидуальные особ«нности адаптивных возможностей производителей, связанные с адаптивными возможностями к оплодотворяющей способностью их спермы. Предложены пути повышения эффективности искусственного осеменения коров. Выявлен препарат биофат, обеспечивающий коррекцию гормональной динамики, снижение уровня пере-кисного окисления липидов в крови и улучшение количества и качества сг.ермч у быков-производителей с ни? мин адаптивный потенциалом, а также сокращение непроизводительного периода у корсв.
Разработаны способ прогнозирования оплоцотворягщей способ-кости спер'.м по адаптивному потенциалу, сре.ш MFMHi (а,с. > 53Є823) для криоконсервацяи спермы быков-производителей в соло-уикиах, БИ02АЛ - для криоконсервапии спермы быков-производителей в форме гранул и способ зл'/^паживания спермы быков.
Практическая значимость. Расширены представления о механиках сперматогенеза, криогенных повреадения и протекции гамет бнков-проиэводителеЯ и влиянии факторов внедней и внутренне?! среды на ;ги процессы. Результаты 'жеперхмеатальных исследована? дсполкяот современные акания о роли переписного екисления липидов и 5елксво-холестериновых комплексов в биологических объектах, о влиянии факторов различной природи на репродуктивные функции самок и самцов, механигыах регуляции процессов воспроизводства, о роли собственных антиоксидантов спермиев в процессе криоконсервации, о механизмах действия антиоксидантов.
Материалы работы использованы при разработке следующих рекомендация: " Система ведения сельского хозяйства в Молдавской ССР" (Кишинев: Тимпул, 1961, IS66J; "Рекомендации по технологии замораживания семени быков-производителей в форме гранул" (Ки-тінев: Картя Молдовеняскч, 1976); "Рекомендации'по технологии производства продукции еввдводства" (Ккеинев, ІЇ6І); Республикански;1 стандарт Молдавской ССР" Среда синтетическая лактозо-ф^кгозо-^инозо-кагкиевс-глицерино-желточная для разбавления
и замораживания спермы быков-лроизводителей в соломинках" (Кишинев, T96I); "Рекомендации по технологии производств молока в Молдавской ССР (Кишинев, 1961); "Научно-практические рекомендации по ведения молочного животноводства в Унгенском районе на промышленной основе* (Унгены, І9&5Ї; "Рекомендации по технологии производства продукции овцзводства" (Кишинев: Тим-пул, I9S6); "Способ повышения жизнеспособности гамет при крио-коксервацик спермы быков-прокзводителей" (Кишинев: Штиинца, 1966); "Программа - 4000" (Кишинев: Картя Молдовеняска, 19Ь7); "Научно-практические рекомендации по ведению молочного животноводства в Теленеитском районе" (Теленешты, 1967); "Система воспроизводства крупного рогатого скота* (Кишинев: Молдагроинфорчреклама, I9S9); "Методические рекомендации по отбору, оценке и прогнозированию оплодотворяющей способности спермы быксв-проидводителей" (Кишинев, 1993). Среды ЛФШГЙ и БУ.ОФАЛ для криоконссрвации спер-кы быка, способ замораживания спермы быков и способ отбора, оценки и прогнозирования оплодотаоряющей способности сперму быков-производителей внедрены в производство и успешно используются в практике (акты внедрения 1974, 1976, 993).
Апробация работы. Осксвняе положения диссертации доложены и обсуждены на Ветеринарном фармакологическом Совете СССР (Москва, 1974), Республиканской научно-производственной конференции (Кишинев, 1978), И съезде физиологов МССР (Кишинев, I960), Всесоюзной конференции "Механизмы криоповрс-ждекия и крноэащиты биологических объектов" (Харьхсв, 1983); Всесоюзном семинаре по организации воспроизводства сельскохозяйственных кивотных №ва-ко-Франксэск, 1983), научно-производственной конференции "Перспектива развития производства молока на лромьплленнсЯ основе" (Киавдев, 194), У съезде генетиков и селекционеров Молдавии (Кишинев, І9Б7), научно-производственной конференция "использование голштинской породы для интенсификации селекции молочного скота" (Киев, 1%7), Республиканской конференции "Проблемы научного обеспечения животноводства.Молдавии" (Кишинев, 1990), УІТ Всесоюзной конференции по экологической физиологии (Алма-Ата, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Физиология продуктивных кивотньк решению продовольственной программы СССР" (Талин, 1990), Всесоюзных конференциях "Современные достижения науки я практики в области селекции озец к коз, технологии производства шерсти, бя-
рянины, пуха и их применение в новых тконокических условиях хозяйствования" (Ставрополь, І99П, ,->аседаннях Ученого совета Молдавского научно-исследовательского института животноводства и ветеринарии 1991-1993), НТС ЫСЭСиП RI <Ь%-1990>, комиссии "Медикамент" (1992).
Работа удостоена Государственной премия Молдавской ССР а опасти науки и техники 1983 года.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 63 научные работа.
На гашигу выносятся следусаие основные положения:
I. Вганмосвязь адаптивного потенциала спермиев быхов-про-изводителей с их оплодотворикхцей способностью.
Z. Механизмы развития адаптивных реакций при криохонсерва-ции спермы Снков-производителей.
3- Криозакатные среды и способ замораживания сперм". Сыков-произволителей.
4. Препарат бисфат, повышающий качественные показатели спермы быков-производителей.
Структура и объем zv.v- таиик.Диссертация изложена на 344 страницах машинописного текста, иллюстрирована 71 таблицей и 8 рисунками; состоит ил введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследованийto6-суяцения полученных результатов, выводов, практических предло- , жений и списка литература, вклшахщего 28 источников, в том числе 265 на иностранных я-уках. Кроме того, в диссертацию входят приложения на 16 странице*.
Объектом коследований служил крупный рогатый скот, а также кровь и споря -*того вида жизотньпе. Отбор животных для проведения опытов осмеетвляля со принципу аналогов. При ітом учитывали породность, происхождение, возраст, массу тела, продуктивность, половую активность, качество сиермопродукция и функпио-
наЛЬНОе СОСТОЯНКЄ ЖИВОТНЫХ.
При проведении лабораторных исследований н сценке их ро-гулматов руководствовались рекомендациями В.К.:.;кловакова(1962,' 1077), й.Д.Клине кого (І975-К69), В.П.Кононова (I9G3), Е.К.Пда-
Длл Kp,iOL:iJHc;iipL.ai(iw и проведения научно-производственных < ,-.1,1-1 ^ъ использовали епйрму биков-проиэводктелей черно-пестрой ^ /oAdiTSirtCsoi1 пород, цоолв получения сперл;н оценивали ее подеиж-иСй'гь и hon«aHTt3«ti;-i-B л о общепринятым методикам. В исследованиях лсалль^оаажл сперлу с концентрацией не ниже 0,8 млрд/мл к под-о-а*ноотэм 6 оаллов. Непосредственно после взятия спермы прово-лілл ее риас^ьланйе л технологическую обработку в зависимости от ц^лл л№вогчтлк исследований.
Угтййч-л-іОйїь сг.ермиав it холодовому удару определяли следую-u-:ii. оор*.'ом: no 0,1 мл спермы помещали в I мл изотонического рас-?!>«;,! иитрзл-з натрия при 0С в при температуре 20 С. Оценивали ілчїіі.'тйо сп^ркы ь обоих образцах и рассчитывали к^ффициент, гак j-d.ot.C'Hiii показаїел.ї подвижности спермиев, в образцах при СС к !-.iftuu;-a«jaTit сперліез s образцах при 20С я выражали в процентах.
При ул'рабогда синтетических сред для разбавления и замора-і-.-..,;^.i-:vrt ^їійрлі ft'.invJi. в солошнках нами ^ыла изучена л^ивучесть сперміев после заморажизашя и оттаивания, используя для раэбавле нил изотонические раствор* неэлектролитов (лактозы, сахароза, фруктозы, рафинозы) в различных сочетаниях и соотношениях на основа метода треугольных систем по В.К.Милованову (1962) при величине интервалов в №&.
Разработанная синтетическая среда ЛФШГК (а,с. V536823) ^aJib комиссионно проверена БГНКИ ветпреларатов в лабораторных усчйілях с целью определения ее эффективности при замораживании ;.іі.;єніі быков-производителей в соломинках в сравнении с применя-ii-vjirif кля іб\ же целей другими средствами: ЛГК (H.aagsze, 196ч) *лії,:фйп |р.с».ззби. 1964,1968).*ЛХіге. (ВГНКИ ветпрепаратов ), H'ki't (Р.Ган, К.Ёйол, 1909) по методике, разработанной нами и .-.бзртдеиной ВГИКИ взтпрепаратов,
В целях усовершенствования синтетическоіі среды ГК для за-„.-рЁкивэния спериы быков-производителей в форне гранул был изучен прйларат бкофат из класса бензкмидазолов, эффективность которого оценивали по морфофункциональныи показателям спермы пес-. і замораживания и оттаивания а также уровню переписного окисле-
а'/пидоз и содержанию малонового . диальдегида в сперуиях на
. ь этапах технологической обработки.
>-. у4%г-і--.-)'-!«енствовзіікя процесса обработки сперкы до непсс-
редствекно его замораживания было изучено влияние исключения периода охлаждения спермы в среде с глкиеряном, сокрллгения данного ПерйОДа И ВВЄЛ?ИИЯ ИЭОТСНИЧССКСЯ И ГН::"РТОКИЧЙСХОЙ СрїД
(ІО0ДС5, ПО, 115. 12(# от изотонии) на ь^ивазиость, усто?чи-воеть связи мсг.!у ^елкауи н липидами и сохранение сульфгидрядь-кух групп в слермиях 8 процессе технологической обработки спзр-ка.
Устойчивость белково-холестеркноэых комплексов сгермигв ^нка определяли по методике П.Полунина U966JV а количество хо-лестеринз-по методике Илька (1959).
Исследования устойчивости связи белок-липид сяершмв в запк-симости от не-'лектсолитнаго (фруктоза, глюкоза,лахто?а,сахароза, рафиноэа) и электролитного состава (кагионы -К* - 15мМ, *» гОкМ, нн4*-ПгК, cV*- Ir-ii, Kg*±I2bM и анионы - сі" - 2Qtu, sc^~- ас«и, zoy~ гОеи с6н5о7-5н?о-гОгі!) сред для разбавления и замораживания спермм быков-проиэ'бодителеЯ проводили в свели--разбавленном, охлажденном состоянии при -4С( а также после -амораживания и оттаивания.
Содержание свободных гл^гилркльных групп в сперме СНКОВ-производителей определяли по методике И.П.Левченко к 8 ,И .Городкс-кого (1964) на чехословацком полярографе ЬР - 7 в полярографической ячеР.ке (по Я.Гейровсхиї», Й.Куга, 1965), сконструирсваноЯ нами.
Концентрацию продуктов пврекисноро окисления липйдов в сперме и крови определяли методами, списанными Е.А.Владимировым и А^И.Арчаковым (1972).Степень окисления липидов определяли по отношению оптической плотности ДезЗ^ДїїО и ^Z7(/^10 Шведова и соавт. 1967). Антиокислктельну» активность липидов определяли по их способности тормозить окисление метилолеата (Бурлакова к соавт. 1975),
Содержание прогестерона, четрадиола, тестостерона,тироксина и трийоятиронина в сыворотке крови.определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов реактивов прояззодст-ва Института биоорганичэской химии АН Беларуси. Концентрацию прогестерона и четрадиола определяли путем применения антисыво-роток,полученнмх при иммунизации кроликов с использованием стандартов,приготовленных на сыворотке быка. Подсчет радиоактивности
проводили на гамич-сг.ектрометре типа РИА-300 фирмы "Трактор Европа" .
Определение АТФ + АДФ проводили по методу И.Ф. Сейтца и Н.ТЛлиіко в модификации ВГНКИ ветпрепаратов СІ974).
Содержание нитратного азота в кормах и крови определяли потениисиетрипеским методом ионеелективним электродом по В.К. Менькину и соавт. (1981). ,
Определение витаминов б крови проводили по методу Е.ТЬограоп *t *l. (1973) при длинне волны возбуждения 295 мм и флоореецен-ции 320мм на спектрофлгюрометре фирмы Хитачи.
Содержание П-оксихортикостероидов и кортизола в крови оп
ределяли радиоиммунологическнм методом по Ю.А.Панкову и соавт,
(!965> к К.М.Ь^в" et *1. (1963). о
Уровень катехоламинов (адреналин, норадреналин) изучали
флгорометрическим методом по л".Ш.МаталинУ и В.В.Меньшикову
(1969). Содержание натрия и калкя определяли с помощью атомно
го абсорбционного спектрофотометра (AiS-lv , ГДР) по P.l.Quino
et О.. (1966).
Научно-производственныо опиты по замораживанию спермы быков-производителей проводили на Молдавской центральной и Сынже-реРсхой станциях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных и на элевере НПО "Тевит". Производственные опыты по осеменение коров проводили в хозяйствах зоны обслуживания эти станций. Контроль результатов осеменения вели по результатам ректального исследования через 60-90 дней после последнего осеменения. Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики (Н.А. Плохинский, 1970).