Содержание к диссертации
Введение
Список сокращений введение
Обзор литературы
Этапы ангиогенеза и его регуляция
Методы изучения ангиогенеза
Сердечно-сосудистые заболевания и этиологическая роль факторов окружающей среды
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки как 23
перспективный инструмент в ангиогенной терапии
Материалы и методы исследований 33
Реактивы, материалы и оборудование 33
Химические реагенты и материалы 33
Антитела 34
Оборудование 35
Среды для культивирования клеток 35
Экспериментальные животные 36
Выделение и культивирование клеток 36
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из жировой 36
ткани человека
Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека 37
Криоконсервация мультипотентных мезенхимальных стромальных 38
клеток и эндотелиальных клеток
Структура исследования 39
Методы исследования 41
Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 41
Микроскопия и морфометрия 42
Определение жизнеспособности клеток 42
Построение кривых клеточного роста
Оценка способности клеток к остеогенной и адипогенной дифференцировке в индуктивных средах роста
Определение содержания растворимых медиаторов в среде культивирования
Оценка ангиогенной активности клеток на модели формирования сосудистой сети в хориоаллантоисной оболочке яйц японского перепела
Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и эндотелиальных клеток
Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Динамика развития сосудистой сети в хориоаллантоисной оболочке яиц перепела (Coturnix coturnix japonica)
3.2 . Влияние компонентов среды, факторов роста и гипоксии (5%О2) на формирование сосудов в хориоаллантоисной оболочке
3.3. Влияние условий культивирования (концентрация ростовых факторов фетальной телячьей сыворотки, фазы клеточного роста, длительность субкультивирования) на ангиогенную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, при стандартной лабораторной концентрации кислорода (20% О2)
3.4. Ангиогенный потенциал мезенхимальных стромальных клеток, постоянно культивируемых при концентрации О2, близкой к уровню в тканях организма концентрации кислорода (5% О2)
3.5 Влияние остеоиндукции на ангиогенную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при 20% и 5% О2
3.6. Изучение активности растворимых ангиогенных медиаторов в 79
кондиционированной среде после взаимодействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с другими клеточными типами (митоген-стимулированные лимфоциты и эндотелиальные клетки) при 20% и 5% О2
Заключение 86
Выводы 89
Список литературы
- Сердечно-сосудистые заболевания и этиологическая роль факторов окружающей среды
- Выделение и культивирование клеток
- . Влияние компонентов среды, факторов роста и гипоксии (5%О2) на формирование сосудов в хориоаллантоисной оболочке
- Влияние остеоиндукции на ангиогенную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при 20% и 5%
Сердечно-сосудистые заболевания и этиологическая роль факторов окружающей среды
Ведущая роль в индукции пролиферации эндотелиоцитов, как первичного звена ангиогенеза, отводится фактору роста эндотелия сосудов (VEGF). Именно он вместе с фактором роста фибробластов (FGF) запускает процессы ремоделирования существующих сосудов и истинного ангиогенеза – формирования новых сосудов (Distler et al., 2003; Carmeliet and Jain, 2011). В настоящее время известно, что семейство VEGF включает 5 ростовых факторов: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-С, VEGF-D, VEGF-E (Nagy et al., 2007; Chang et al., 2009). В физиологических условиях VEGF незначительном количестве продуцируется большинством клеток стромального дифферона. Экспрессию VEGF регулируют многие факторы. Например, тканевая гипоксия, которая наблюдается при ишемии, стимулирует аутокринную и паракринную экспрессию VEGF у мезенхимальных стромальных клеток (Sharkey et al., 2008). Кроме того, в качестве индукторов секреции данного ростового фактора могут выступать различные цитокины, ростовые факторы, гормоны, оксид азота (Liekens et al., 2001; Hausman and Richardson, 2004).
Главным физиологическим эффектом VEGF является митогенное действие на эндотелиальные клетки. При этом белок практически не оказывает влияния на пролиферацию других клеток (Pepper, 2001; Distler et al., 2003; Ferrara and Kerbel, 2005; Coultas et al., 2005; Carmeliet and Jain, 2011). Кроме влияния на пролиферацию эндотелиальных клеток VEGF может играть роль в поддержании их жизнедеятельности. В физиологических концентрациях VEGF действует как фактор выживания эндотелия, ингибируя апоптоз эндотелиоцитов (Ku et al., 1993). Кроме того в экспериментах in vitro показана способность VEGF стимулировать миграцию эндотелиальных клеток (Schlieve et al, 2016).
Другим ведущим регулятором ангиогенеза является фактор роста фибробластов (FGF). В первую очередь данная молекула влияет на функциональную активность эндотелиальных клеток, посредством реализации эффектов через специфические высокоаффиные тирозинкиназные рецепторы (Liekens et al., 2001). Как и VEGF, он способен стимулировать пролиферативную и миграционную активность эндотелиальных клеток, однако при этом не являясь специфическим митогеном для эндотелия. Этот фактор может принимать участие в дифференцировке адипоцитов, подавлять апоптоз нейронов и стимулировать выработку интерлейкина 6 (ИЛ-6). Наблюдается синергизм действия между VEGF и bFGF при индукции ангиогенеза (Ferrara, 2005; Carmeliet and Jain, 2011).
Еще одним ростовым фактором, влияющим на процесс сосудообразования, является тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Его ангиогенные свойства, в первую очередь, обусловлены способностью стимулировать синтез и секрецию VEGF (Carmeliet and Jain, 2011). Кроме того данный ростовой фактор незаменим в процессе пролиферации и созревания перицитов, что обеспечивает дальнейшую стабилизацию формирующейся сосудистой сети (Fischer et al., 2008).
Важную роль в регуляции процессов ангиогенеза играет семейство ангиопоэтинов (Ang) и их рецепторов - Tie. У человека семейство Ang состоит из трех лигандов (Ang-1, Ang-2 и Ang-4) и двух рецепторов (Tie-1 и Tie-2). Все ангиопоэтины связываются с Tie-2 рецептором. На начальном этапе ангиогенеза секреция Ang-2 «концевой» клеткой стимулирует открепление перицитов, что облегчает миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток (Carmeliet and Jain, 2011). Ang-1 необходим для ветвления, ремоделирования и стабилизации формирующихся сосудов (Distler et al., 2003). В последнее время расширились представления о биологической роли хемокинов. Они могут выступать как в качестве ингибиторов, так и стимуляторов ангиогенеза. ИЛ-8 – первый из открытых хемокинов с позитивной ангиогенной активностью. Большинство клеток продуцируют ИЛ-8 только в ответ на стимуляцию провоспалительными цитокинами (TNF, ИЛ-1), а также бактериальными продуктами и вирусами. Гипоксия так же является мощным стимулом для его продукции. ИЛ-8 обладает стимулирующим ангиогенным потенциалом за счет влияния на миграционную активность эндотелиальных клеток. Кроме этого, он может стимулировать пролиферацию эндотелиальных клеток, как прямым, так и опосредованным путем, за счет усиления продукции VEGF и bFGF (Li et al., 2003).
В исследованиях последних лет встречается много работ по изучению ангиогенных факторов роста кровеносных сосудов, таких как VEGF, ангиогенин, FGF, TGF. Показана их высокая избирательность. Так например FGF оказывает непосредственное влияние на развитие мелких, а TGF - крупных сосудов. VEGF оказывает дифференцированное воздействие: стимулирует образование мелких сосудов при низких концентрациях, а при высоких влияет на увеличение диаметра и проницаемости крупных сосудов. Таким образом FGF и TGF выступают в качестве мощного, но узконаправленного регулятора развития общей системы кровеносных сосудов. А VEGF, в зависимости от концентрации, осуществляет более тонкую регулировку в направленности развития ангиогенеза (Станков, 2005).
Помимо этого существует еще ряд факторов роста и цитокинов, обладающих проангиогенным действием. Так, HGF стимулирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных и гладкомышечных клеток, а также предупреждает их апоптотическую гибель (Distler, 2003). TGF (фактор роста опухоли) – многофункциональный цитокин, ингибирующий пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток на ранних этапах ангиогенеза, а также играющий незаменимую роль в дифференцировке эндотелия на поздних этапах сосудообразования (Jain, 2003; Carmeliet and Jain, 2011). TNFa в низких дозах стимулирует пролиферацию эндотелиальных и мезенхимальных клеток, а в более высоких (более 0,5нг/мл) – ингибирует (Papetti and Herman, 2002). Опосредованным путем за счет усиления продукции VEGF воздействуют ИЛ-6 и Моноцитарный хемотаксический протеин (MCP-1) (Hong et. al., 2005; Gopinathan et al., 2015).
Для регуляции процессов ангиогенеза необходим баланс проангиогенных и антиангиогенных факторов. Такие факторы, как концентрация О2, сдвигают этот баланс в сторону стимуляторов ангиогенеза. В физиологических условиях при формировании необходимого количества сосудов ангиогенез прекращается за счет индукции соответствующих ингибиторов. В норме в ответ на стимуляцию ангиогенеза факторами роста и ангиогенными хемокинами параллельно начинает продуцироваться определенный спектр антиангиогенных медиаторов (Balestrieri et al., 2008). Выделяют 2 основные группы ингибиторов ангиогенеза: прямые и непрямые. Прямые непосредственно воздействуют на эндотелиальные клетки, блокируя пролиферацию, миграцию, а также индуцируя апаптоз в активированных клетках (ангиостатин, авастин, эндостатин). Непрямые ингибиторы блокируют синтез ангиогенных стимуляторов, уменьшая способность клеток стимулировать ангиогенез, или связывают рецепторы на эндотелиальных клетках (интерфероны, ИЛ-12, 18).
Выделение и культивирование клеток
Часть экспериментов в работе была выполнена на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) эмбрионов японского перепела (Coturnix coturnix japonica). Полученные от одного поголовья птиц яйца в необходимом количестве собирали, отбирали по форме и весу, овоскопировали, и закладывали в лабораторный инкубатор с автономной системой поддержания оптимального режима инкубирования: температура 37,5±0,5С, влажность – 54-64%. Перед началом инкубации, грязь, перья и экскременты тщательно удалялись с яичной скорлупы бумажным полотенцем. Переворачивание яйц происходило ручным способом (один раз в сутки, наклон в одну и в другую сторону 45). Длительность инкубирования яйц в лабораторном инкубаторе составила 6 суток для экспериментов in ovo и 3 суток - для ex ovo. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в Институте, рекомендациям национального совета и национальным законам.
Материалом для выделения мезенхимальных стромальных клеток служила стромально васкулярная фракция жировой ткани здорового человека. Для получения первичной культуры использовали стандартную методику (Zuk et al. 2002) с модификациями (Буравкова и др., 2009). Образцы жировой ткани были предоставлены многопрофильной клиникой «Союз» в соответствии с договором о научном сотрудничестве с ГНЦ РФ – ИМБП РАН. В стерильных условиях ткань измельчали, помещали в 50 мл центрифужную пробирку с 20 мл фосфатного буфера и центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин. После убирали образовавшиеся излишки жира и эритроциты, добавляли в пробирку эквивалентный объем 0,15% раствора коллагеназы IV в -MEM среде и инкубировали в течение 40 минут на водяной бане при 37С, периодически встряхивая. Для ингибирования коллагеназы IV в центрифужную пробирку добавляли полную ростовую среду -MEM. Полученную суспензию фильтровали через 100-мкм фильтр и центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин. Супернатант сливали и полученный осадок клеток ресуспендировали в 10 мл полной ростовой среде -MEM. Выделенные клетки высевали на чашки Петри и помещали в СО2-инкубатор Sanyo (5% СО2, 95% воздуха, 100% влажность). Через 24 часа были отмечены прикрепившиеся отдельные клетки и их группы. Культуру отмывали раствором фосфатного буфера и заменяли среду культивирования на свежую. Дальнейшую смену среды проводили через 72 часа.
При достижении 75% - 80% монослоя мезенхимальные стромальные клетки пассировали. Для этого клетки отмывали от среды трижды раствором фосфатного буфера, после чего его удаляли и добавляли раствор трипсина в этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА). Клетки выдерживали в растворе фермента до полного отделения от пластика (около 2 минут). Процесс открепления клеток котнролировали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом Leica DM IL. Трипсин ингибировали полной ростовой средой -MEM. Клеточную суспензию помещали в 50 мл центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин. Супернатант сливали, полученный осадок ресуспендировали в полной ростой среде -MEM и подсчитывали количество клеток в гемацитометре. После чего полученную суспензию клеток высевали на чашки Петри с площадью 75 10 клеток/см и помещали в СО2-инкубатор в стандартные условия – 5% СО2, +37С, 100% влажности и атмосферной концентрации О2 (20%) или при пониженной концентрации кислорода - 5% О2 (мультигазовый инкубатор). Для проведения экспериментов использовали клетки 3-4-го пассажа. Для оценки ангиогенной активности мезенхимальных стромальных клеток кондиционированную среду (питательная среда, содержащая различные физиологически активные продукты жизнедеятельности предварительно культивируемых в ней клеток) собирали в соответствии со схемами экспериментов, приведенных далее. 2.4.2. Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека Материалом для выделения эндотелиальных клеток человека служили пупочные канатики. Для получения первичных культур эндотелиальных клеток использовали метод Gimbrone et al., (1974) в модификации Антонова и соавт. (1981) – вместо коллагеназы использовали 0,15% раствор диспазы. Выделение проводили в стерильных условиях в ламинаре (стерилизция ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут), в стерильных перчатках. Шприцы, канюли и стеклянные трубочки автоклавировали не менее 60 минут. Перевязанную пуповину, помещали в лоток, очищали от крови стерильной салфеткой и отрезали не стерильную часть. После вену канюлировали с обеих сторон и промывали от остатков крови раствором фосфатного буфера. Затем пупочную вену заполняли 0,15% раствором диспазы, приготовленной на среде 199, с обеих сторон канюли зажимали и инкубировали в растворе фосфатного буфера в течение 45 минут на водяной бане. По завершении инкубирования, переносили в ламинар, снимали зажимы и сливали фермент в центрифужную пробирку. Затем вену промывали средой 199 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки 3-5 раз. Полученную суспензию клеток центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. После этого, супернатант сливали, осадок ресуспендировали пипетированием в подогретой до 37С полной ростовой среде 199 для эндотелия. Клетки высевали в предварительно покрытые 0,8% раствором желатина чашки Петри. Эндотелий помещали в СО2-инкубатор в стандартные условия (5% СО2, 100% влажность). Через 24 часа культуру отмывали средой 199 и добавляли свежую полную ростовую среду для культивирования эндотелиальных клеток. Дальнейшие смены среды проводили через 48 часов.
При достижении монослоя проводили пассирование эндотелия. Для этого клетки отмывали от среды 3 раза средой 199 с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, затем среду удаляли и добавляли раствор трипсин - ЭДТА. Клетки выдерживали в растворе фермента до полного отделения клеток от подложки (около 1 минуты). Процесс открепления клеток отслеживали с помощью фазово-контрастного микроскопа Leica DM IL. Фермент ингибировали средой культивирования, клеточную суспензию собирали пипеткой, помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин. Затем супернатант сливали, ресуспендировали клеточный осадок в 10 мл среды пипетированием для равномерного распределения клеток в объеме. Полученную суспензию клеток высевали 3 к 1 в покрытые 0,8% раствором желатина чашки Петри и помещали в СО2-инкубатор. Для проведения экспериментов использовали клетки 1-2-го пассажа. Для оценки ангиогенной активности эндотелиальных клеток кондиционированную среду собирали в соответствии со схемами экспериментов, приведенных ниже.
. Влияние компонентов среды, факторов роста и гипоксии (5%О2) на формирование сосудов в хориоаллантоисной оболочке
Для анализа ангиогенной активности используются различные in vitro и in vivo методики (Ucuzian et al., 2007, Sarkanen et al., 2011, Donovan et al., 2001). Однако гораздо более физиологичным и менее затратным представляется метод, основанный на использовании ХАО оболочки яиц птиц (Auerbach et al., 2003; Borges et al., 2003; Klueh et al., 2003). Данная методика зарекомендовала себя как надежная модель в изучении влияния различных агентов на сосудообразование. С помощью нее ранее было проанализировано большое количество проангиогенных факторов, в том числе VEGF121, bFGF, TGF , VEGF165 (Borges et al., 2003; Klueh et al., 2003). В том числе встречаются и работы, посвященные изучению влияния стромальных клеток и продукции их секреции на развитие сосудов в ХАО (Liu et al., 2011; Kim et al., 2012). В результате проведенных исследований были отработаны методические подходы для изучения ангиогенеза в моделях in ovo и ex ovo с использованием ХАО яйца перепела, экспериментальный протокол введения исследуемых субстанций, а также методика морфометрического анализа полученных результатов. Было показано, что динамика развития ХАО и характер изменений, вызванных тестируемыми субстанциями, в обеих моделях одинаковы, что позволяет адекватно оценивать ангиогенную активность различных субстанций. Обе методики имеют как свои недостатки, так и преимущества. Так, ex ovo методика позволяет в реальном времени визуально оценивать развитие ХАО под воздействием тестируемых субстанций. Однако, in ovo метод менее трудоемок. Поэтому конкретная модель может быть выбрана в зависимости от экспериментальной задачи. Согласно как полученным нами, так и литературным данным (Hsiao et al., 2013) полная культуральная среда, обычно используемая для выращивания МСК или ЭК, сама по себе может усиливать новообразование сосудов. Объясняется это тем, что в состав среды входит сыворотка содержащая в себе факторы роста, оказывающие непосредственное влияние на процесс ангиогенеза в ХАО. Однако, учесть этот фактор в качестве “+” контроля в эксперименте практически невозможно, так как нельзя проконтролировать расход сывороточных нутриентов культивируемыми клетками. Поэтому разумнее представляется сравнение эффектов с “-“ контролем – средой без сыворотки.
В литературе существует целый ряд работ, посвященных изучению влияния различных факторов роста на ангиогенез (Shibuya, 2013, Bai et al., 2014). Показана их высокая избирательность. В нашем исследовании с помощью ранее отработанной методики мы проанализировали вклад VEGF и ECGS в сосудообразование. Как было отмечено в литобзоре (раздел 1.1) эффекты VEGF зависят от его исходной концентрации. Ранее было показано, что при низких концентрациях он влияет на образование мелких сосудов, а при высоких – на увеличение диаметра и проницаемости крупных (Blebea et al., 2002). В наших экспериментах VEGF в концентрации 2000 пкг/мл непосредственно оказывал влияние на рост мелких сосудов, что хорошо соотносится с ранее полученными данными других исследователей. ECGS, напротив, оказывал влияние на рост основных сосудов. Известно, что данный митоген играет важную роль в поддержании жизнеспособности и пролиферации эндотелиальных клеток, что непосредственно оказывает влияние и на сосудообразование (Santhosh Kumar and Krishnan, 2001).
Выработке тех или иных индукторов, способствующих активному формированию сосудов, могут способствовать различные факторы макроокружения. Одним из таких является снижение концентрации кислорода в среде. Как было упомянуто ранее в литобзоре (раздел 1.4) важнейшую роль при тканевой гипоксии играет кислород чувствительный транскрипционный фактор — гипоксия-индуцибельный фактор (HIF). Одной из его функций является экспрессия генов, улучшающих доставку кислорода и способствующих активному ангиогенезу (эритропоетин, VEGF, трансферрин и другие белки) (Ahluwalia and Tarnawski, 2012). Гипоксия во время эмбриогенеза может вызывать изменения в развитии некоторых физиологических регуляторных систем, тем самым вызывая постоянные фенотипические изменения в зародыше. Нами было показано, что пребывание эмбрионов в гипоксической среде в течении 24 часов не приводило к их гибели. Напротив, через 6 часов отмечалось увеличение количества ветвей по сравнению с контролем, что возможно связано с активацией экспрессии генов, ответственных за сосудообразование. И действительно ранее Druyan et al. (2012) показали, что спустя 12 часов экспозиции в гипоксической среде увеличивалась экспрессия генов, ответственных за ангиогенез: HIF1, MMP 2, VEGF и VEGFR2 (Druyan and Levi, 2012). Однако спустя 24 часа показатели выравнивались, что возможно связано с адаптацией к гипоксии. Известно, что при действии даже умеренной гипоксии быстро начинают развиваться компенсаторные реакции для обеспечения доставки кислорода и субстратов метаболизма в ткани (Nanka et al., 2006). По-видимому, ускорение развития сосудов при короткой гипоксической экспозиции развивается как феномен попытки увеличения потребления кислорода извне за счет увеличения площади покрываемой сосудами.
Концентрация ростовых факторов фетальной телячьей сыворотки Для определения влияния концентрации ростовых факторов фетальной телячьей сыворотки на ангиогенную активность мезенхимальных стромальных клеток, сразу после пассирования, клетки помещали в а-МЕМ с различной концентрацией фетальной телячьей сыворотки (1-10%). Кондиционированную среду (питательная среда, содержащая различные физиологически активные продукты жизнедеятельности предварительно культивируемых в ней клеток) собирали через 72 часа. Контролем служила среда а-МЕМ без фетальной телячьей сыворотки (Рисунок 3.13).
Схема эксперимента по оценке влияния концентрации ростовых факторов фетальной телячьей сыворотки (ФТС) на ангиогенную активность мезенхимальных стромальных клеток (МСК).
Морфология мезенхимальных стромальных клеток спустя 72 часа культивирования при разной концентрации фетальной телячьей сыворотки в среде не отличалась. Однако, доля живых клеток при культивировании с 10%, нежели чем с 1% фетальной телячьей сыворотки была выше почти в 2 раза (Рисунок 3.14 А). Пролиферативная активность мезенхимальных стромальных клеток понижалась при культивировании в условиях 1% по сравнению со стандартными условиями (10% фетальной телячьей сыворотки) (Рисунок 3.14 Б).
Влияние остеоиндукции на ангиогенную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при 20% и 5%
Паракринная регуляция - один из важнейших механизмов, определяющих исход клеточных взаимодействий. Происходящие при этом изменения профиля медиаторов являются следствием активности всех контактирующих клеток. В настоящем разделе приведены результаты определения ангиогенной активности в сокультурах мезенхимальных стромальных клеток с лимфоцитами и эндотелиальными клетками.
Митоген-стимулированные лимфоциты
Одним из наиболее привлекательных для клеточной терапии свойств мезенхимальных стромальных клеток является их способность к подавлению активации аллогенных лимфоцитов (Кругляков, 2006; Fibbe et al., 2007). Известно, что при этом происходит противоспалительный сдвиг в профиле паракринных медиаторов (Горностаева и др., 2013; Andreeva et al., 2015). Мы оценили эффекты кондиционированной среды после сокультивирования мезенхимальных стромальных клеток с митоген-активированными аллогенными лимфоцитами на формирование сосудов в ХАО. Исследуемая среда была предоставлена сотрудниками лаборатории клеточной физиологии ГНЦ РФ - ИМБП РАН после проведения экспериментов по следующей схеме:
После взаимодействия мезенхимальных стромальных клеток с ФГА-активированными лимфоцитами, ангиогеннная активность кондиционированной среды возрастала, как в 20%, так и в 5% О2. Однако при тканевой концентрации О2 этот эффект был более выражен (Рисунок 3.38А). Стоит отметить, что характер новообразования сосудов в ХАО после добавления кондиционированной среды от сокультуры в 20% О2 не изменялся, рост сопровождался в большей степени за счет увеличения ветвления, как и от монокультуры (Рисунок 3.38 Б). Что нельзя сказать про 5% О2, где после взаимодействия с лимфоцитами, активно происходило повышение концентрации проангиогенных медиаторов, ответственных за рост количества ветвей (Рисунок 3.38 В).
Ангиогенные эффекты кондиционированной среды от монокультур мезенхимальных стромальных клеток (МСК), ФГА-лимфоцитов и их сокультуры при различной концентрации кислорода. Лимф – ФГА-лимфоциты, Л+М – сокультура мезенхимальных стромальных клеток+ФГА-лимфоциты. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n=8. - достоверное отличие при р 0,05
При анализе продукции медиаторов ангиогенеза у ФГА-лимфоцитов оказалось, что после их активации были выявлены ИЛ-6, ИФН-, ИЛ-8. Причем продукция ИЛ-6, ИЛ-8 не зависела от концентрации кислорода. Концентрация ИФН- уменьшалась при снижении О2. После сокультивирования с мезенхимальными стромальными клетками концентрация цитокинов в среде существенно отличалась от показателей в монокультуре ФГА-лимфоцитов. В сокультуре происходила активная выработка VEGF-A, причем в 5% О2 это происходило интенсивнее, кроме этого возрастал ИЛ-8 (5% О2), что хорошо соотносится с полученными данными по сосудообразованию в ХАО (Рисунок 3.39). Концентрация противосполительных медиаторов наоборот снижалась (ИЛ-6 и ИЛ-8) при 20% О2. Рисунок 3.39. Концентрация ангиогенных медиаторов в кондиционированной среде, n=2.
Феномен взаимодействия мезенхимальных стромальных клеток и аллогенных Т-клеток в настоящее время активно изучается. Показано, что в присутствии аллогенных мезенхимальных стромальных клеток снижается уровень пролиферации активированных лимфоцитов (Krampera et al., 2003; Plumas et al., 2005; Fibbe et al., 2007). Модулирующий эффект мезенхимальных стромальных клеток на активацию и пролиферацию лимфоцитов наблюдается не только в смешанных культурах клеток, но и при использовании полупроницаемой мембраны. В связи с этим внимание исследователей было направлено на продукты секреции мезенхимальных стромальных клеток. Ранее было показано, что совместное культивирование лимфоцитов с мезенхимальными стромальными клетками приводит к большей продукции ангиогенных цитокинов и факторов (ИЛ-8, TNF), что хорошо согласуется с полученными нами данными in ovo (Aggarwal and Pittenger, 2005). В большинстве проанализированых данных, секреция провоспалительных факторов при сокультивировании с мезенхимальными стромальными клетками существенно снижается. Было выявлено уменьшение продукции ИФН- лимфоцитами, активированными ФГА при взаимодействии с мезенхимальными стромальными клетками костного мозга из жировой ткани (Sato et al., 2007; Prasanna et al., 2010; Kronsteiner et al., 2011). Кондиционированная среда от ФГА активированных лимфоцитов не оказывала достоверного влияния на сосудообразование, что скорее всего связано с выработкой последними IFN-, являющегося известным ингибитором ангиогенеза (Hayakawa, 2002). Таким образом после сокультивирования мезенхимальных стромальных клеток с ФГА активированными лимфоцитами отмечалось увеличение общего количества сосудов, как в 20% О2, так и в 5% О2. Более выраженный эффект наблюдался после добавления кондиционированной среды от сокультивирования при 5% О2, что связано, по-видимому, с более интенсивной выработкой паракринных медиаторов. Эндотелиальные клетки
Как уже было сказано ранее функциональная активность мезенхимальных стромальных клеток регулируется различными биологически активными веществами, в том числе ростовыми факторами и цитокинами, продуцируемыми микроокружением. Известно, что эндотелиальные клетки продуцируют ряд медиаторов, способных оказывать влияние на окружающие их ткани и клетки (Кругляков и др., 2006). В настоящие время в литературе имеются работы, посвященные исследованию межклеточного взаимодействия, в котором основная роль отводится именно паракринной составляющей, продуцируемой данными клетками (Aguirre, 2010; Kolbe et al., 2011).
Для определения влияния кондиционированной среды, полученной после бесконтактного взаимодействия мезенхимальных стромальных и эндотелиальных клеток на сосудообразование, клетки сокультивировали 24 часа по следующей схеме (Рисунок 3.40):
При 20% О2 добавление кондиционированной среды как от сокультуры мезенхимальных стромальных и эндотелиальных клеток, так и от монокультуры мезенхимальных стромальных клеток, вызывало увеличение как количества ветвей, так и основных сосудов, по сравнению с контролем (Рисунок 3.42 Б).
В 5% О2 наблюдалась обратная картина: после сокультивирования ангиогенная активность была выше, чем в контроле, но ниже, чем в монокультуре мезенхимальных стромальных клеток (Рисунок 3.42 В). Эндотелиальные клетки в монокультуре не оказывали воздействия на новообразование сосудов в ХАО (Рисунок 3.42 А). Как уже было сказано ранее, основным ангиогенным фактором, играющим центральную роль в стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, является VEGF-A. Было показано, что мезенхимальные стромальные клетки в монокультуре секретируют значительное количество VEGF-A. Мы проанализировали вклад VEGF-A в ангиогенную активность кондиционированной среды после взаимодействия мезенхимальных стромальных и эндотелиальных клеток. Оказалось, что в сокультуре выработка VEGF-A, а так же ИЛ-6 и МCP-1 снижается (Рисунок 3.43 Г,Д ) при 5% О2. При 20% наоборот отмечается увеличение концентрации провоспалительных цитокинов: ИЛ-6 и 8, а также МСР-1. JL