Антиоксидантный статус кроликов в половозрастной динамике и возможности его активации Аджиев Джамал Джамалутдинович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 16

1.1. Современное состояние кролиководческой отрасли в РФ 16

1.2. Функции антиоксидантной системы защиты организма 17

1.3. Антиоксидантные ферменты 26

1.4. Регулирующая роль свободнорадикального окисления 28

1.5. Универсальная роль перекисного окисления липидов в организме 29

1.6. Взаимодействие между витамином Е и селеном 31

1.7. Функции селенопротеинов и примеры синергизма между витамином Е и селеном 34

1.8. Молекулярные механизмы взаимодействия витамина Е и селена 36

ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 40

2.1. Материал и методы исследований первой серии экспериментов 40

2.2. Материал и методы исследований второй и третьей серии экспериментов 43

2.3. Материал и методы зоотехнических исследований при введении в рацион антиоксидантного препарата Агидола кормового (2-ая серия экспериментов) 48

2.4. Материал и методы зоотехнических исследований при введении в рацион антиоксидантного препарата «Евротиокс Plus Dry» (3-ая серия экспериментов) 50

2.5. Материал и методы исследований антиоксидантного статуса по антиоксидантному индексу (АОИ) 52

ГЛАВА 3. Собственные исследования и их обсуждение 57

3.1. Половозрастные особенности антиоксидантной системы крови кроликов 57

3.1.1. Активность супероксиддисмутазы и каталазы эритроцитов кроликов 57

3.1.2. Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы эритроцитов крови кроликов 60

3.1.3. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови кроликов 62

3.1.4. Содержание витаминов Е и А в плазме крови кроликов 64

3.1.5. Содержание холестерола и триглицеридов в плазме крови кроликов

3.2. Половозрастная динамика среднесуточного прироста и живой массы кроликов 69

3.3. Общий антиоксидантный индекс в оценке антиоксидантного статуса организма кроликов разного пола в различные периоды онтогенеза 72

3.4. Половозрастные особенности антиоксидантной системы крови кроликов при использовании алиментарных антиоксидантов (АОП №1 и АОП №2)

3.4.1. Половозрастная оценка состояния липидного обмена кроликов 78

3.4.2. Половозрастные изменения клеточного и биохимического состава крови кроликов 84

3.4.3 Основные ферменты антиоксидантной системы 114

3.4.4. Продукты перекисного окисления липидов 124

3.4.5. Содержание витаминов Е и А в плазме крови самцов и самок кроликов 130

3.5. Зоотехнические показатели молодняка кроликов разного пола и возраста при введении в рацион антиоксидантного препарата Агидола кормового (2-ая серия экспериментов) 136

3.5.1. Производственная апробация 144

3.6. Зоотехнические показатели молодняка кроликов разного пола и возраста при введении в

рацион антиоксидантного препарата «Евротиокс Plus Dry» (3-ая серия экспериментов) 150

3.6.1. Производственная апробация 158

Заключение 165

Выводы 183

Практические рекомендации 187

Список сокращений 188

Использованная литература 189

• Регулирующая роль свободнорадикального окисления
• Материал и методы зоотехнических исследований при введении в рацион антиоксидантного препарата Агидола кормового (2-ая серия экспериментов)
• Содержание витаминов Е и А в плазме крови кроликов
• Половозрастные изменения клеточного и биохимического состава крови кроликов

Введение к работе

Актуальность разрабатываемой проблемы определяется использованием в практике кролиководства полученных сведений о роли антиоксидантной системы и сопряженных с ней процессов перекисного окисления липидов в физиологии кроликов разного пола и возраста для контроля за состоянием их здоровья. Улучшения хозяйственно-полезных признаков животных путем корректного проведения профилактических и зоотехнических мероприятий с использованием антиоксидантов для стабилизации обменных процессов и показателей производства и воспроизводства.

Недостаточно изучены первичные и отдаленные механизмы биологического действия синтетических антиоксидантов, однако можно предположить, что среди результатов их воздействия будет изменение мембранного потенциала клеток и перекисного окисления липидов (Зинкович И.И., 2001; Зинчук В.В., Ходосов-ский М.Н., 2006; Гагаро М.А., 2007; Карташева Н.В., 2007; Баврина А.П., 2008; Радаева М.В., 2008; Татжикова К.А., 2008; Ярован Н.И., 2008; Арсланова Д.Р., 2009; Пасько Н.В., 2009). И одним из способов внешней компенсации

антиоксидантной недостаточности является введение экзогенных синтетических антиоксидантов.

В этой связи необходимость проведения комплекса научно-

исследовательских экспериментов для углубленного изучения метаболических процессов в организме кроликов обоих полов в различные периоды роста и развития и влияния на них различных антиоксидантных препаратов является актуальной и представляет, как научный, так и практический интерес.

Степень разработанности темы. Теоретической базой для исследования антиоксидантной системы и связанных с ней процессов перекисного окисления липидов послужили труды: Илюхи В.А. (2003-2008), Владимирова Ю.А. (1983-2000), Скулачева В.П. (1996-2001), Атауллаханова Ф.И. (1983-2015), Зенкова Н.А. (1993-2001), Пудовкина Н.А. (2009-2015), Тутельяна В.А. (1993-2015), Калугина Ю.А. (2009), Иванова А.А. (2010) и других отечественных и иностранных ученых.

Мультикомпонентная антиоксидантная смесь «Евротиокс Plus Dry» исследована на курах-несушках в работе Судьина Н.С. (2015) с точки зрения влияния на их продуктивность и состояние антиоксидантной системы; Арслано-ва Д.Р. (2009) исследовала систему "перекисное окисление липидов-антиоксиданты" у крыс в онтогенетическом аспекте; Тюркина О.В. (2009) исследовала влияние Агидола кормового на обмен веществ и продуктивность кур-несушек; Беляев Д.А. изучил особенности постнатального онтогенеза крыс; Расцветаев И.Е. (2011) изучил эффективность использования антиоксидантных препаратов Агидола кормового и «Евротиокс Plus Dry» в рационах норок.

Однако, многие ответные реакции организма животных на процессы
перекисного окисления липидов, и состояние антиоксидантной защиты организма,
при введении препаратов Агидола кормового и «Евротиокс Plus Dry» в рационы
животных изучены недостаточно. Не изученным остается влияние

антиоксидантных препаратов на половозрастную динамику становления антиоксидантной системы и их влияние на процессы перекисного окисления липидов в организме кроликов. В частности, изучение влияния пола и возраста на

активность ключевых ферментов антиоксидантного метаболизма и показателей
липидного обмена крови кроликов, оценка некоторых компонентов

антиоксидантного статуса плазмы крови и изменения ее антиоксидантной активности при введении антиоксидантных препаратов.

Цель исследований:

Изучить половозрастные особенности антиоксидантной системы кроликов и разработать способ ее активации с целью стимуляции обменных процессов в период роста и развития.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. изучить половозрастные особенности изменения ферментативной
(активность основных ферментов: супероксиддисмутаза, каталаза,
глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза) и неферментативной (витамины А и
Е) антиоксидантной систем крови и физиологическое состояние кроликов;

2. определить оптимальные дозы и рациональную схему применения
препаратов Агидола кормового и «Евротиокс Plus Dry» для кроликов мясной
породы советская шиншилла;

1. установить связь между накоплением продуктов перекисного окисления липидов и функциональной активностью антиоксидантной системы в процессе роста и развития кроликов разного пола при назначении им Агидола кормового и «Евротиокс Plus Dry»;

2. разработать АОИ-индекс с целью изучения и определения механизмов противоокислительной защиты с участием ферментативных систем эритроцитов;

5. изучить результаты введения в рацион кроликов препаратов Агидола кормового и «Евротиокс Plus Dry» на половозрастную динамику клеточного и биохимического состава крови;

6. определить влияние препаратов на ростовые качества, сохранность и продуктивность кроликов, экономическую эффективность.

Научная новизна работы.

В результате выполнения диссертационной работы проведено всестороннее исследование антиокислительной защиты, гематологических и биохимических

показателей организма кроликов в половозрастной динамике. Изучен обмен белков, витаминов, углеводов, уровень свободнорадикального окисления липидов, определена степень активности антиоксидантной системы; показано изменение статуса основных антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза), продуктов перекисного окисления (малоновый диальдегид и диеновые конъюгаты) в нормальных условиях онтогенеза и под влиянием экзогенных воздействий у различных половозрастных групп кроликов.

Впервые в динамике возраста исследована и определена норма коэффициента де Ритиса, соответствующая оптимальному уровню процессов трансаминирования, для молодняка самцов и самок породы советская шиншилла.

Впервые для определения противоокислительного статуса у кроликов нами использован комбинированный антиоксидантный индекс, позволяющий не только выявить изменения АОС крови, но и оценить влияние разных факторов антиоксидантной защиты в онтогенезе.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость работы состоит в том, что в половозрастной динамике изучена антиоксидантная система, морфологические и биохимические показатели крови, рост и развитие кроликов. Полученные результаты послужат предпосылкой для дальнейших исследований в изученном нами аспекте.

Практическая значимость работы заключается в использовании результатов проведенных нами исследований в оценке физиологического статуса кроликов в половозрастной динамике, в рациональном кормлении, стимулирующем функциональную активность антиоксидантных ферментов и вместе с тем антиокислительную защиту организма в целом.

Результаты проведенных исследований с использованием синтетических антиоксидантов в рационах животных апробированы в производственных условиях в питомнике «Белый мох» филиала «Электрогорский» ФГБУ «НЦБМТ» РАМН, внедрены и успешно применяются (акт внедрения в производственных условиях антиоксидантных препаратов в комбикорма для кроликов от 16.10.2015

г.). Разработанный АОИ-индекс применяется в медицинских учреждениях в клинико-диагностической практике.

Методология и методы исследования. Работа выполнена с использованием как современных, так и классических методов исследования (биохимические и гематологические анализы, зоотехнические параметры) с применением автоматических и полуавтоматических анализаторов нового поколения. Более подробное описание представлено в разделе «Материал и методы исследований».

Положения, выносимые на защиту:

1. Морфофизиологические и биохимические показатели определяют физиологический антиоксидантный статус организма кроликов в половозрастном аспекте.

2. Повышение эффективности выращивания кроликов путём активации антиоксидантной системы антиоксидантными препаратами.

3. Применение АОИ-индекса у кроликов разного пола позволяет выявить усиление механизмов противоокислительной защиты с участием ферментативных систем эритроцитов.

4. Применение антиоксидантных препаратов в половозрастной динамике повышает эффективность выращивания кроликов. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы

доложены, обсуждены и положительно оценены на следующих научных
конференциях: Междунар. научно-практ. конференции «Научные основы
повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (Краснодар, 2011);
Междунар. научно-практ. конференции «Научные основы повышения

продуктивности сельскохозяйственных животных» (Краснодар, 2012); Междунар. научно-практ. конференции «Проблемы интенсификации животноводства с учетом пространственной инфраструктуры и охраны окружающей среды» (Фаленты-Варшава, 2013).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ, в том числе 20 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных

журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 1 работа в зарубежном научном издании.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 221 страницах компьютерного текста, в которой 61 таблица и 17 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследований, собственные исследования и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, список сокращений, использованная литература, включающая 321 наименование, в том числе 120 иностранных авторов.

Регулирующая роль свободнорадикального окисления

Количество процессов, сопровождающихся образованием реактивных форм кислорода, непрерывно растёт и уже с трудом подается оценке. Известно, что деятельность многих ферментов, в особенности оксидаз, связана с образованием супероксид анион-радикала и перекиси водорода. Фагоцитарная деятельность в период воспаления сопровождается респираторным взрывом с образованием реактивных форм кислорода. Актуальными являются также пути поступления радикалов с продуктами автоокисления пищи, термической обработки, а также загрязнителей, в частности пестицидов. Кроме того, озон, окислы азота и другие поллютанты воздуха являются потенциальными источниками реактивных форм кислорода. К числу безусловных лидеров по радикалообразованию в связи с промышленными особенностями следует отнести действие ультрафиолетовой и ионизирующей радиации, по существу сводящееся к массированной генерации реактивных форм кислорода и продуктов их взаимодействия с органическими молекулами (Frei B. et al., 1988; Krinsky N.I., 1988; Stocker R., Frei B., 1991; Retsky K.L. et al., 1993; Frei B., Gaziano J.M., 1993; Frei B., 1993; 1994).

При всём вышесказанном следует констатировать, что первичные микроциркуляторные нарушения, сопровождающиеся неравномерным снабжением кислорода тканей, также, как и часто используемые гипероксические процедуры способствуют эндогенному образованию радикалов. В литературе уделяется мало внимания тому факту, что радикальные продукты выводят из строя серию витаминов в особенности аскорбиновую кислоту, токоферол, ретинол и другие. Возникающая вторичная поливитаминная недостаточность сама по себе вызывает утяжеление патогенетического действия радикалов и требует специальной витаминной корректировки (Shilotri P.G., 1977; Anderson R., 1981; Beisel W.R., 1982; Evans R.M. et al., 1982; Moser R., Weber F., 1983; Panush R.S. et al., 1982; Panush R.S., Delafuente J.C., 1985; Theron A., Anderson R., 1985; Anderson R. et al., 1987). Ситуация, когда накопление гидроперекисей, диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) превышает скорость их элиминации с помощью ферментативных и неферментативных процессов некоторыми авторами характеризуется, как состояние «окислительного стресса» (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1993; Sies H., 1991). Соответственно обратная ситуация может рассматриваться, как состояние «долгосрочной компенсации» (Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П., 1993). Наличие окислительного стресса в организме черезвычайно важно в связи с проблемой апоптоза, поскольку именно апоптозу уделяется большое внимание в связи с регенерацией и преждевременной гибелью биоструктур (Скулачев В.П., 2001). Согласно мнению Скулачева (Скулачев В.П., 1996; 1999; 2001), образование активных форм кислорода является тонко регулируемым процессом, выполняющим важные биологические функции, в частности противоопухолевого процесса, а не только неизбежным злом, разрушающим ДНК и ускоряющим гибель клеток (Beckman K.B., Ames B.N., 1998). Имеются основания считать, что за счёт тонкой регулировки антиокислительной защиты, в особенности, тиол-дисульфидного статуса, возможно существенное корректирование окислительных, антиокислительных и апоптотических процессов. Было показано, что значительную роль в атеросклеротических нарушениях сосудов играют окисленные формы LDL. Механизмом окисления ЛП очевидно является избыточная генерация супероксид-анион-радикала клетками эндотелия. С использованием культуры эндотелиальных клеток было показано (Sohn H.Y. et al., 2000), что деполяризация эндотелиальных мембран приводит к нарушению транслокации небольшого G-белка Rac, который запускает протеинкиназу С, активирующую внутриклеточную НАДФ-оксидазу, способную генерировать супероксид-анион радикал. Gardner P.R. et al. (1998) показали, что пероксильные радикалы (ROO.) в свою очередь также способны повреждать апо-А1 и апо-А11 HDL за счёт окисления специфических остатков Met. Окисление HDL приводит к редукции их способности принимать холестерин из клеточных

мембран- решающего этапа транспорта холестерина, что в сочетании с действием окисленных LDL способно ускорять перерождение васкулярного эпителия. В целом, оборот кислорода в аэробных организмах связан с образованием активных форм кислорода. Кроме того, АФК образуются клетками специально в качестве сигнальных молекул при дифференциации клеток, в клеточных циклах и в ответ на экстраклеточные стимулы, включая факторы роста, митогены и др. Чтобы избежать окислительного инсульта, клетки развивают защитную стратегию, включающую систему репарации окислительных повреждений и систему механизмов перехвата АФК. Репарационные механизмы включают различные дисульфидредуктазные ферменты, систему репарирования ДНК, так и тиол-восстанавливающие ферменты, типа тиоредоксин редуктаза/тиоредоксин и Ref-1. Антиоксидантные механизмы обычно включают редокс-активные низкомолекулярные соединения типа глутатиона (GSH) и ловушки радикалов типа витаминов Е и С (Retsky K.L., Freeman M.W., Frei B., 1993), а также АФК-метаболизирующие системы, включая супероксиддисмутазу (СОД), каталазу и глутатионпероксидазу. Термин «окислительный стресс» обычно используется для обозначения ситуации, в которой клеточный редокс-гомеостаз, то есть баланс между про-оксидантами и антиоксидантами изменяется в сторону избытка АФК и/ или недостаточности антиоксидантных механизмов.

Исследования последних лет показывают, что важную роль в клетке помимо окислительного стресса (ROS) играет и нитроксидный стресс (RNS) (Stamler J.S. et al., 2001), основным признаком которого является нарушение образования активных форм азота (АФА) – NO. и NO-производных. Основным источником свободнорадикального NO. в клетках млекопитающих является энзиматическое окисление L-аргинина NO-синтазой (Stuehr D.J., 1999). Первоначально было установлено, что NO. генерируется этим ферментом в качестве сигнальной молекулы в регуляции ключевых функций в следующих системах: иммунной, кардиоваскулярной и нервной. Тем не менее, оказывается, что функции NO гораздо сложнее, и не совсем ясно их взаимодействие с молекулярным кислородом, АФК, металлами с переходной валентностью и тиолами. Такие реакции, приводят к различным видам RNS, включая нитрозил-металл с переходной валентностью, S-нитрозотиолы, N2O3, и пероксинитрит (ОNОО). Более того, высокоактивные NO-производные, такие как нитрилхлорид, или NO2 могут образовываться при окислении нитратов миелопреоксидазой. Важно то, что различные АФА проявляют различное действие путём участия в NO-сигнализации, в отличие от их потенциальной возможности учавствовать в нитроксидном или окислительном стрессе, то есть, по-существу, являясь двуликими. С одной стороны, NO может ограничивать повреждения, действуя как ингибитор разветвления цепи (Luperchio S. et al., 1996; Bast А. et al., 1991; Mieyal J.J., Chock P.B., 2012). А с другой, могут повреждать и убивать клетки механизмом инактивации комплексов дыхательной цепи и ферментов метаболизма, ингибированием синтеза ДНК и белка, подавлением синтеза антиоксидантных ферментов, снижением GSH и АТФ, инактивацией генов, включая метилирование ДНК, мутагенез, необратимая окислительная модификация и деградация ДНК, белков, мембранных липидов, и свободных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). В подтверждение клеточного антиокидантного и прооксидантного действия NO in vivo показано, что низкие дозы NO защищают клетки от пероксид-индуцированной смерти, в то время как высокие усиливают гибель, вероятно реакцией NO c кислородом и образованием оксиданта, такого, как N2O3. Таким образом, многие вредные эффекты NO могут быть обьяснены их окислительными свойствами, но в отличие от этого, на клеточной модели NO- индуцируемого апоптоза предполагается, что NO убивает клетки редокс-независимым и АФК-независимым механизмом, включая S-нитрозирование ещё не идентифицированных белков.

Материал и методы зоотехнических исследований при введении в рацион антиоксидантного препарата Агидола кормового (2-ая серия экспериментов)

Схема опыта 1. Для изучения зоотехнических параметров было отобрано 80 кроликов породы крупных кроликов мясошкуркового направления советская шиншилла. Формирование групп животных проводилось по принципу аналогов с учетом возраста, пола и живой массы. Из подобранных (Аджиев Д.Д., 2008. С. 54) по полу (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (самцы/самки – по 40 кроликов) животных было сформировано 4 группы по 10 голов в каждой (Аджиев Д.Д., 2010. Там же). Подопытные животные находились в одинаковых условиях содержания и были клинически здоровы (Аджиев Д.Д., 2008. Там же).

В I (Аджиев Д.Д., 2008. Там же) (контрольную) группу вошло 10 кроликов, которые (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) получали основной рацион (ОР) в виде гранулированного комбикорма К-122. Животные II, III и IV опытных групп дополнительно к основному рациону получали препарат Агидол кормовой в дозах 250, 350 и 450 мг/кг комбикорма (Аджиев Д.Д., 2010. Там же). Основной рацион животных во всех группах соответствовал нормам кормления кроликов (Аджиев Д.Д., 2010. Там же), разработанными сотрудниками ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева (Балакирев Н.А. и др., 2001; 2006). Общая питательность рационов животных подопытных групп была одинаковой (Аджиев Д.Д., 2010. Там же).

Опыт, в который были отобраны крольчата в 60-дневном возрасте со средней живой массой 1,5 кг, продолжался 120 дней и был разбит на 3 этапа: начало – возраст 60 дней (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (забор крови, зоотехнические измерения), середина – 120 дней (забор крови, зоотехнические измерения) и конец – 180 дней (забор крови, зоотехнические измерения) (Аджиев Д.Д. Изменение показателей продуктивности у молодняка кроликов в период выращивания при введении в их рацион антиоксидантного препарата Агидола кормового // Кролиководство и звероводство. 2011. № 4. С. 20-21).

Схема опыта 2 (производственная проверка). Для проверки результатов исследований по влиянию синтетических антиоксидантов на зоотехнические параметры было отобрано 180 голов породы крупных кроликов мясошкуркового направления советская шиншилла. Формирование групп животных проводили по принципу аналогов с учётом возраста, пола и живой массы. Из подобранных (Аджиев Д.Д., 2008. С. 54) по полу (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (самцы) животных было сформировано 3 группы по 60 голов в каждой (Аджиев Д.Д., 2010. Там же). Подопытные животные находились в одинаковых условиях содержания и были клинически здоровы (Аджиев Д.Д., 2010. Там же).

В I (контрольную) группу вошло 60 кроликов, которые (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) получали основной рацион (ОР) в виде гранулированного комбикорма К-122 (Аджиев Д.Д., 2008. Там же). Животные II и III опытных групп дополнительно к основному рациону (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) получали препарат Агидол кормовой в дозах 200, 300 мг/кг комбикорма (Аджиев Д.Д., 2010. Там же). Основной рацион животных во всех группах соответствовал нормам кормления кроликов (Аджиев Д.Д., 2010. Там же), разработанными сотрудниками ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева (Балакирев Н.А. и др., 2001; 2006). Общая питательность рационов животных подопытных групп была одинаковой (Аджиев Д.Д., 2010. Там же). Опыт, в который были отобраны крольчата в 60-дневном возрасте со средней живой массой 1,5 кг, продолжался 120 дней и был разбит на 3 этапа: начало – возраст 60 дней (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (зоотехнические измерения), середина – 120 дней (зоотехнические измерения) и конец – 180 дней (зоотехнические измерения) (Аджиев Д.Д., Драганов И.Ф., Гальянова И.А. Влияние экзогенных антиоксидантов на физиологические показатели самцов кроликов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. М., 2013. № 3. С. 43-44).

Материал и методы зоотехнических исследований при введении в рацион антиоксидантного препарата «Евротиокс Plus Dry» (3-ая серия экспериментов) Схема опыта 1. Для изучения зоотехнических параметров было отобрано 80 голов породы крупных кроликов мясошкуркового направления советская шиншилла. Формирование групп животных проводили по принципу аналогов с учётом возраста, пола и живой массы. Из подобранных (Аджиев Д.Д., 2008. С. 54) по полу (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (самцы/самки – по 40 кроликов) животных было сформировано 4 группы по 10 голов в каждой (Аджиев Д.Д., 2010. Там же). Подопытные животные находились в одинаковых условиях содержания и были клинически здоровы (Аджиев Д.Д., 2008. Там же).

В I (Аджиев Д.Д., 2008. Там же) (контрольную) группу вошло 10 кроликов, которые (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) получали основной рацион (ОР) в виде гранулированного комбикорма К-122. Животные II, III и IV опытных групп дополнительно к основному рациону получали препарат «Евротиокс Plus Dry» в дозах 300, 400 и 500 мг/кг комбикорма соответственно. Основной рацион животных во всех группах соответствовал нормам кормления кроликов, разработанными сотрудниками ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева (Балакирев Н.А. и др., 2001; 2006). Общая питательность рационов животных подопытных групп была одинаковой. Опыт, в который были отобраны крольчата в 60-дневном возрасте со средней живой массой 1,5 кг, продолжался 120 дней и был разбит на 3 этапа: начало – возраст 60 дней (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (забор крови, зоотехнические измерения), середина – 120 дней (забор крови, зоотехнические измерения) и конец – 180 дней (забор крови, зоотехнические измерения) (Аджиев Д.Д. Зоотехнические показатели кроликов разного пола и возраста при введении в их рацион антиоксидантного препарата «Евротиокс Plus dry» // Кролиководство и звероводство. 2012. № 2. С. 11-13).

Схема опыта 2 (производственная проверка). Для проверки результатов исследований по влиянию синтетических антиоксидантов на зоотехнические параметры было отобрано 180 голов породы крупных кроликов мясошкуркового направления советская шиншилла. Формирование групп животных проводили по принципу аналогов с учётом возраста, пола и живой массы. Из подобранных (Аджиев Д.Д., 2008. С. 54) по полу (самки) животных было сформировано 3 группы по 60 голов в каждой. В (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) группе самок не было беременных и лактирующих (Аджиев Д.Д., 2015. Там же) животных. Подопытные животные находились в одинаковых условиях содержания и были клинически здоровы (Аджиев Д.Д., 2008. Там же).

Содержание витаминов Е и А в плазме крови кроликов

Аналогично на 28% (180 дн.) и на 42,5% (120 дн.) у самцов (АОП 2) и на 19,2% (180 дн.) и на 32,1% (120 дн.) у самок (АОП 1) по отношению к началу опыта (возраст 60 дн.). Это происходит на фоне 2-3-кратного роста количества моноцитов и эозинофилов у животных обоего пола в динамике роста (120-180 дн.). При этом доля гранулоцитов в составе крови в сумме сокращается с 2,3 до 1,8 тыс./мкл у самцов (АОП 1) и с 2,3 тыс./мкл до 1,7 тыс./мкл у самок (АОП 2). Аналогично с 2,3 до 1,6 тыс./мкл у самцов (АОП 2) и 2,2 до 1,6 тыс./мкл у самок (АОП 1) (табл. 10, 12, 14 и 16) (Там же. С. 26).

Отмеченные сдвиги отражают тот факт, что в течение первых месяцев жизни у кроликов происходит изменение состава иммунокомпетентных клеток крови, что отмечено и у других видов животных (Воронин Е.С. и др., 2002; Мейер Д., Харви Д., 2007). Снижается роль микрофагов (нейтрофилов) и возрастает роль макрофагов (моноцитов), а также клеточного и гуморального иммунитета за счет роста субпопуляций Т- и В-лимфоцитов.

С другой стороны, увеличение показателя гематокрита с возрастом определяется изменением размеров клеток. Как видно из таблиц 10, 12, 14 и 16, за 4-х месячный период объем одного эритроцита увеличился с 51-54 фл до 64-67 фл у самцов и с 51-53 фл до 59-61 фл у самок. То есть в среднем по всем группам на 24-25% (самцы АОП 1) и на 15-16% (самки АОП 2). Аналогично с 49-52 фл до 61-64 фл у самцов и 50-54 фл до 64-66 фл у самок – в среднем по всем группам на 23,1-24,5% (самцы АОП 2) и на 22,2-28,0% (самки АОП 1) (Там же).

Основными функциями эритроцитов крови являются перенос газов (главным образом кислорода) и поддержание кислотно-щелочного равновесия (Иванов А.А. и др., 2010). Необходимо отметить, что функциональные свойства эритроцитов у кроликов возрастают в этот период не только за счет увеличения его объема и содержания в нем гемоглобина. Эритроцит становится более плотно упакованной гемоглобином клеткой и более стойким к гемолизу. Содержание гемоглобина в одном эритроците кроликов в период 60-180 дней увеличивается в среднем на 2-4 пг при параллельном росте концентрации гемоглобина в эритроцитарной массе на 7-11 г/л (самцы АОП 1) и на 8-16 г/л (самки АОП 2). Соответственно на 8-10 г/л (самцы АОП 2) и на 3-13 г/л (самки АОП 1). Количество эритроцитов к концу опыта также увеличивается с возрастом по всем группам (при Р0,05 во II опытной группе самцов (АОП 1) и в IV – самок при введении АОП 2). Гемолитическую устойчивость эритроцитов подтверждают данные по реакции ОРЭ (табл. 11, 13, 15 и 17) и концентрации билирубина в крови (табл. 19, 21, 23 и 25). Как следует из таблиц 19, 21, 23 и 25, антиоксидантные препараты снизили концентрацию в крови билирубина, образование которого связано с гемолизом эритроцитов и катаболизмом гемоглобина (Там же).

Качественно-количественные изменения затрагивают и тромбоциты крови. Тромбокрит за период опыта увеличился в 1,5-2,0 раза при двукратном росте количества тромбоцитов в крови: в среднем 207 тыс./мкл в начале наблюдений, 412 тыс./мкл – в середине и 548 тыс./мкл в конце периода выращивания у самцов АОП I (табл. 11). И соответственно: 196 тыс./мкл, 275 тыс./мкл и 563 тыс./мкл – у самцов АОП 2 (табл. 15). Так, тромбокрит у самцов кроликов (АОП 1) достоверно повысился к концу опытного периода (180 дней) в I(контрольной) группе – на 140% (при Р0,001), во II – на 144% (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (при Р0,001), в III – на 100% (при Р0,001) и в IV – на 153% (при Р0,01) (в среднем по группам на 134%) (табл. 11). У самцов кроликов (АОП 2) повышение составило: в I(контрольной) группе – 106% (при Р0,01), во II – 153% (при Р0,01), в III – 127% (при Р0,01) и в IV – 94% (при Р0,01) (в среднем по группам на 120%) (табл. 15).

И соответственно у самок, получавших АОП 1, рост количества тромбоцитов составил: в начальном периоде опыта (60 дней) в среднем 192 тыс./мкл, в середине (120 дней) – 268 тыс./мкл и 552 тыс./мкл – в конце (возраст 180 дней) (табл. 17). Аналогичные изменения в динамике возраста наблюдаются у самок, получавших АОП 2: 201 тыс./мкл – в начале, 395 тыс./мкл – в середине и 547 тыс./мкл – в конце эксперимента (табл. 13).

У самок кроликов, получавших АОП 1 возрастная динамика изменений выглядит следующим образом: в I(контрольной) группе величина тромбокрита повысилось на 118% (при Р0,001), во II – на 179% (при Р0,001), в III – на 118% (при Р0,001) и в IV – на 150% (при Р0,001) (в среднем по группам на 141%) (табл. 17); у самок, получавших АОП 2 изучаемый показатель достоверно возрос к концу опытного периода (180 дней): в I(контрольной) группе – на 119% (при Р0,001), во II – на 95% (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (при Р0,001), в III – на 112% (при Р0,05) и в IV – на 144% (при Р0,001) (в среднем по группам на 117%) соответственно (табл. 13). Аналогичны изменения в содержании тромбоцитов в крови кроликов-самцов (АОП 1) в возрастной динамике по группам: в I (контрольной) количество тромбоцитов достоверно повысилось на 162% (при Р0,001), во II – на 168% (при Р0,001), в III – на 163% (при Р0,001) и в IV – на 167% (при Р0,001) (в среднем на 165%) (табл. 11); у самцов (АОП 2): в I (контрольной) группе – на 190% (при Р0,001), во II – на 184% (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (при Р0,001), в III – на 189% (при Р0,001) и в IV – на 187% (при Р0,001) (в среднем на 188% к концу опыта) (табл. 15).

Соответственно у самок (АОП 1) по группам: в I (контрольной) группе – на 188% (при Р0,001), во II – на 188% (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) (при Р0,001), в III – на 186% (при Р0,001) и в IV – на 190% (при Р0,001) (в среднем на 188%) (табл. 17). У самок (АОП 2) повышение количества тромбоцитов к концу эксперимента составило: в I (контрольной) группе – 167% (при Р0,001), во II – 175% (при Р0,001), в III – 173% (при Р0,001) и в IV – 174% (при Р0,001) (в среднем на 172%) (табл. 13) (Там же). Средний объем тромбоцита крови животных контрольной группы вырос с 7,7 фл до 7,9 фл у самцов (АОП 1) и с 7,8 фл до 8,1 фл, а во II (опытной) группе еще больше – с 6,7 фл до 8,1 фл (на 20,9%) – у самок (АОП 2). Соответственно в контрольных группах самцов, получавших АОП 2 и самок, получавших АОП 1, средний объем тромбоцита крови вырос с 6,9 фл до 8,6 фл (на 24,6%) и с 6,8 фл до 8,6 фл (на 26,5%) (табл. 11, 13, 15 и 17).

Наши исследования показали, что добавка в корм кроликов препаратов АК или EPD не оказали существенного влияния на большинство показателей клеточного состава крови, за исключением концентрации гемоглобина. Так, уровень гемоглобина в крови в возрасте 180 дней был существенно выше, чем в начале опыта в среднем по всем группам кроликов на 15,7% у самцов (концентрация гемоглобина во II и III опытной группе достоверно при Р0,05 увеличилась (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) на 23,2% и 19,7%) (АОП 1) (табл. 10) и на 9% у самцов (АОП 2) (табл. 14). И аналогично на 11% у самок (АОП 1) (табл. 16) и на 12% (во II группе достоверно при Р0,05 – на 16%) у (Аджиев Д.Д., 2010. Там же) самок (АОП 2) по отношению к возрасту 60 дней (табл. 12). При этом разность между контрольной группой и средним значением опытных групп составила 11% у самцов (АОП 1) и 8% у самок (АОП 2), и она объясняется, скорее всего, не количеством эритроцитов в крови, а более высоким содержанием гемоглобина в одном эритроците (Там же).

Хотя в нашем случае анализы гематологических и биохимических показателей плазмы крови проводились современными методами на автоматических и полуавтоматических анализаторах и на дифференцированных по полу животных и в двух возрастных диапазонах, некоторые из изученных нами параметров крови кроликов соответствуют данным полученными авторами, ранее занимавшихся аналогичными исследованиями. Так, по активности щелочной фосфатазы, АЛТ в сыворотке (Помытко В.Н., 1985). Данные по активности ЛДГ в сыворотке самок совпадают с данными, полученными при исследовании проводимых на кроликах породы советская шиншилла (Калугин Ю.А., 2009). Количество гематокрита полностью совпадает с данными, полученными в исследованиях Harkness J.E. and Wagner J.E. (1989), также как гемоглобина и альбуминов; креатинина в исследованиях Kozma C. et al. (1974) на разнополых кроликах породы новозеландский белый; гемоглобина и СОЭ (Уткин Л.Г., 1987).

Половозрастные изменения клеточного и биохимического состава крови кроликов

Высокая скорость окислительного и энергетического метаболизма, свойственная молодым животным, сопровождается побочным дополнительным образованием активных форм кислорода и (Ильина Т.Н., Илюха В.А., Калинина С.Н., Горлякова Н.А., Беличева Л.А., 2007. С. 146) азота (АФК, АФА). В (Аджиев Д.Д., 2010. С. 682) организме системы генерации свободных радикалов (в частности, свободных форм кислорода) и антиоксидантной (антирадикальной) защиты находятся в динамическом равновесии. К расстройствам гемостаза, активации процессов липопероксидации, дестабилизации биологических мембран и т.д. может привести нарушение этого равновесного взаимодействия (Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И. и др., 2004; Цебржинский О.И., 1992).

Исследование групп животных – самцов и самок кроликов – позволяет выявить некоторые особенности формирования антиоксидантного статуса организма, которое сопровождается снижением стационарных уровней продуктов свободнорадикального и перекисного окисления эндогенных органических соединений при одновременном увеличении активности неферментативной и ферментативной систем защиты. Оптимальная оценка антиоксидантного статуса организма может быть обеспечена оценкой баланса между отклонениями от контрольных значений в суммарном накоплении продуктов (Аджиев Д.Д., 2010. С. 683) перекисного окисления липидов и (Аджиев Д.Д., 2015. С. 208) активностью основных ферментативных и неферментативных антиоксидантных систем. К числу таких показателей можно отнести содержание продуктов перекисного окисления липидов – диеновых коньюгатов ПНЖК и малонового диальдегида в плазме крови и активность антиокислительных ферментов (Аджиев Д.Д., 2015. Там же) эритроцитов – глютатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, глютатионредуктазы и каталазы.

Так, по результатам наших исследований показатели активности основных ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов супероксиддисмутазы и каталазы кроликов в различные возрастные периоды к концу опытного периода достоверно снижаются на 10,5% (в 120 дней на 8,7%) у самцов и на 12,2% (в 120 дней на 6,2%) у самок. И соответственно каталазы – на 9,7% у самцов и на 11,3% – у самок. Аналогичные и достоверные изменения наблюдаются и в возрастной динамике глутатионпероксидазной и глутатионредуктазной активности ферментов: снижение активности глутатионпероксидазы у самцов и самок на 19,6% и глутатионредуктазы у самок на 19,1% и недостоверно у самцов на 7,3% в конце эксперимента (в возрасте 180 дней).

Малоновый диальдегид – конечный продукт перекисного окисления липидов – маркер окидант-прооксидантных процессов в организме млекопитающих. Каскад ферментов антиоксидантной защиты поддерживают активность ПОЛ на определенном уровне, что свидетельствует об окислительном гомеостазе. Свидетельство усиленного ПОЛ – увеличение концентрации МДА в тканях организма (Банкова В.В., 1990).

По результатам измерений содержания продуктов ПОЛ в различные периоды онтогенеза самцов и самок кроликов (Аджиев Д.Д., 2010. С. 678) удалось установить, что в интактных группах разнополых животных с возрастом отмечаются значительные (разность статистически существенна при высокой степени достоверности) изменения по содержанию диеновых конъюгатов в плазме крови. Так, содержание диеновых конъюгатов в плазме крови по отношению к началу опыта у (Аджиев Д.Д., 2010. С. 676-677) самцов уменьшилось до 31% и до 28% – в 120 и 180 дней и у самок кроликов – до 62,3% и до 59,9% соответственно. В отношении содержания малонового диальдегида наблюдается аналогичное по мере взросления (Аджиев Д.Д., 2010. С. 676), но менее значительное уменьшение его содержания на 26,6% и на 25% у самцов и на 43,2% и на 25,2% у самок в 120 и 180 дней (содержание малонового диальдегида по мере взросления у самцов осталось на том же уровне; у самок содержания продукта ПОЛ увеличилось по сравнению с серединой на 31,8% в конце опыта).

В наших исследованиях понижение диеновых коньюгатов в плазме крови самок кроликов превосходило примерно на 31,3% и на 31,9% аналогичный показатель самцов (возрастной период 120 и 180 дней). И примерно 16,6% составила разница в 120 дней по содержанию малонового диальдегида (амплитуда снижения уровня диеновых конъюгатов у самок в отличие от самцов по мере взросления шло почти в 2 раза интенсивнее).

Данное возрастание уровня продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови животных к (Аджиев Д.Д., 2010. С. 677) концу опыта по отношению к середине опыта (120 дней) предположительно свидетельствует о недостаточности эфферентных механизмов метаболизма продуктов липопероксидации.

Таким образом, в качестве маркеров определены концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме крови, как основных субстратов перекисного окисления липидов — важнейшего механизма окислительного гомеостаза. Выявлены накопление и распределение продуктов ПОЛ (малонового диальдегида и диеновых конъюгатов) в плазме (Аджиев Д.Д., 2015. С. 210) крови, совокупно позволяющие судить о глубине активации ПОЛ. Отмечена способность антиоксидантных препаратов в определенных дозах активизировать систему антиоксидантной защиты и восстанавливать процессы ПОЛ, предотвращая их избыточное накопление в плазме крови.

С возрастом, по мере вступления животных в репродуктивный период уровень витамина Е в плазме крови увеличивается по сравнению с более ранним периодом созревания, так как в период репродукции происходит активация обменных процессов (в интенсивно идущих процессах синтеза и распада происходит активная утилизация жиров и белка), (Ильина Т.Н., Илюха В.А., Калинина С.Н., Горлякова Н.А., Беличева Л.А., 2007. С. 151) которая приводит к мобилизации эндогенного токоферола в кровь и интенсивному его использованию (Ильина Т.Н., Илюха В.А., Калинина С.Н., Горлякова Н.А., Беличева Л.А., 2007. С. 146; 151).