Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Полифункциональность и структурные особенности молекулы тромбина 11
1. Полифункциональность тромбина 11
2. Структурные особенности тромбина 12
Глава 2. Рецепторы тромбина 14
1. Открытие тромбиновых рецепторов 14
2. Рецепторы, активируемые протеиназами (PAR): особенности структуры и функции 15
3. Активация рецепторов PAR неспецифичными протеазами широкого спектра действия 18
Глава 3. Участие рецепторов, активируемых протеиназами, в процессах воспаления 22
Глава 4. Рецепторы, активируемые протеиназами, в мозге 33
1, Локализация PARs в мозге 33
2. Ингибиторы тромбина в мозге 33
3. Сериновые протеиназы в тканях мозга 35
4. Эффекты сериновых протеаз на нейроны и глиальные клетки 37
5. Ишемическое и токсическое повреждение мозга 40
6. Толерантность мозга, вызванная тромбином 41
Глава 5. Материалы и методы исследования 45
Глава 6. Исследование роли тромбина и рецепторов, активируемых протеиназами, в процессах воспаления 55
1. Исследование влияния тромбина на секрецию медиаторов перитонеальными тучными клетками 55
2. Исследование влияния пептида-агониста PARI на секрецию преформированных медиаторов перитонеальными тучными клетками 60
3. Исследование влияния пептида-агониста PAR2 на секрецию преформированных медиаторов перитонеальными тучными клетками 61
4. Исследование экспрессии рецепторов PAR на линии тучных клеток RBL-2H3 62
5. Исследование влияния десенситизации тромбиновых рецепторов на секреторную активность тучных клеток 62
6. Фармакологический анализ процесса активации перитонеальных тучных клеток крысы тромбином 65
7. Исследование PAR-зависимой активации перитонеальных тучных клеток крысе перитонитом 67
Глава 7. Исследование экспрессии мРНК PAR и влияния тромбина и агонистов его рецепторов на изменение [Са ]j в перитонеальных макрофагах крысы 73
Глава 8. Исследование влияния агониста рецептора PARI на процесс репарации ткани в модели заживления резаной раны у мышей 75
Глава 9. Исследование нейротропных эффектов тромбина и других протеиназ системы гемостаза 82
1. Исследование влияния тромбина на уровень [Са ]І В гиппокампальных нейронах 82
2. Влияние тромбина на Са -сигнал, вызванный активацией глутаматных рецепторов NMDA типа 86
3. Влияние тромбина на выживаемость гиппокампальных нейронов 88
4. Влияние тромбина на выживаемость гиппокампальных нейронов в условиях цитотоксичности, вызванной гемоглобином 89
5. Исследование роли тромбина, фактора Ха свертывания крови и активированного протеина С на выживаемость нейронов в условиях цитотоксичности, вызванной глутаматом ..90
Обсуждение результатов 97
Заключение 113
Выводы 114
Список цитируемой литературы 116
- Рецепторы, активируемые протеиназами (PAR): особенности структуры и функции
- Эффекты сериновых протеаз на нейроны и глиальные клетки
- Исследование влияния тромбина на секрецию медиаторов перитонеальными тучными клетками
- Исследование влияния агониста рецептора PARI на процесс репарации ткани в модели заживления резаной раны у мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы В последние годы XX столетия наблюдается неуклонный рост заболеваемости туберкулезом легких во всех странах мира, включая Россию (Хоменко А.Г., 1997, 1998; Шевченко Ю.Л., 2000). Обращает на себя внимание возросшее число больных с прогрессирующими распространенными деструктивными формами заболевания (Коваленко И.П., 1989; Токаев КБ., Наумов В.Н., Шайхаев А.Я., 1994; Соловьев СВ., 1998 и др.). Несмотря на внедрение интенсивных курсов химиотерапии, консервативная лечебная тактика не всегда дает желаемого эффекта и результаты лечения таких больных остаются неудовлетворительными (Пристайко Я.И., 1998 и др.). В этих случаях эффективность лечения может быть повышена с помощью своевременного хирургического вмешательства (БогадельниковаИ.В., 1997 идр.).
Современная торакальная хирургия имеет широкий арсенал методов лечения туберкулеза (Перельман М.И., Наумов В.Н., Добкин В.Г., Стрельцов В.П., Дубровский А.В., 2000; Наумов В.Н., Шайхаев А.Я., 2001 и др.). На протяжении многих лет одной из актуальных задач хирургии туберкулеза легких является улучшение результатов оперативного лечения (Богуш Л.К. 1980; Елькин А.В., Репин Ю.М., Левашов Ю.Н., 2003). Исследованиями многих авторов показано, что после операций на легких осложнения чаще развиваются у больных, страдающих деструктивным прогрессирующим туберкулезом и сопутствующими инфекциями дыхательных путей, при этом последние способствуют прогрессированию самого туберкулезного процесса (Порханов ВА., Марченко Л.Г., Поляков И.С, Кононенко В.Б., Бодая В.Н и др. 2002; WeissbergD., 1997).
Этиология инфекций респираторного тракта у больных туберкулезом легких является предметом пристального внимания исследователей (Мишин В.Ю., Чуканов В.И., Васильева И.А., Пронин В.В., Ракишев Г.Б., Иванова О.Г., ЖусуповаР.Ж., Григоревская М.И., 1999 идр.).
Данные литературы последних лет свидетельствуют о возрастающей роли бактерий Chlamydophila pneumoniae (по старой номенклатуре Chlamydia
pneumoniae), а также их ассоциаций с другими бактериями и вирусами, как возбудителей воспалительных заболеваний дыхательных путей у больньж фтизиопульмонологического профиля (Шумская И.Ю., 2000; Allegra L, 1997).
Одной из причин, определяющих актуальность данной проблемы, является неуклонный рост числа больньж инфекциями, вызванными Chlamydophila pneumoniae во всех странах мира (Васильева Е.В. и др. 1997; Гранитов В.М., 2000; Shiina Y., 1985). Другой причиной является отсутствие характерной клинической симптоматики для данных инфекций, в результате получивших название «атипичные», что затрудняет их диагностику, особенно у больньж туберкулезом легких (Серов В.Н., Краснопольский В.И., Делекторский В.В., 1996; Ноников В.Е., 2001; Синопальников А.И., 2002 и
др)-
К настоящему времени не было проведено исследований, позволяющих
оценить особенности взаимодействия туберкулеза легких и «атипичных»
инфекций, которые могут являться факторами прогрессирования
туберкулезного процесса (Скрягина Е.М., Коломиец А.Г., Гуревич Г.Л.,
1999). В условиях, когда частота инфицированности Chlamydophila
pneumoniae больньж туберкулезом легких достигает высоких показателей -
до 24,7% (Шумская И.Ю., 2000), актуальным представляется изучение
влияния сопутствующей хламидиинои инфекции на результаты
хирургического лечения больньж с деструктивными формами туберкулеза легких.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является: повышение эффективности хирургического лечения больньж фиброзно-кавернозным туберкулезом легких путем своевременного вьшвления у них сопутствующей хламидиинои инфекции и разработка оптимальной тактики комплексной предоперационной подготовки и послеоперационного ведения.
Задачи исследования
1. Изучить частоту поражения хламидийной инфекцией больных
фиброзно-кавернозным туберкулезом легких.
Изучить особенности клинического течения заболевания у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и хламидийной инфекцией.
Разработать методику комплексной предоперационной подготовки больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и сопутствующей хламидийной инфекцией.
Оценить эффективность предоперационной подготовки больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и сопутствующей хламидийной инфекцией.
Оценить эффективность хирургического лечения больных с фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и сопутствующей хламидийной инфекцией.
Изучить морфологические особенности туберкулезного воспаления при сочетании фиброзно-кавернозного туберкулеза легких с хламидийной инфекцией в диагностическом материале и резецированных участках органов грудной клетки
Научная новизна.
Впервые изучена частота сочетания фиброзно-кавернозного туберкулеза легких с хламидийной инфекцией органов дыхания у больных, направленных на хирургическое лечение, которая составляет 56,5 %
Установлено, что клиническое течение фиброзно-кавернозного туберкулеза легких в сочетании с хламидийной инфекцией органов дыхания достоверно чаще характеризуется распространенностью деструктивных изменений, прогрессирующим и осложненным течением специфического процесса, тяжестью клинического состояния больных с выраженными симптомами интоксикации, легочно-сердечной недостаточности и массивным бактериовыделением.
3. Доказано, что своевременное выявление хламидийной инфекции у
больньж фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и включение в схему
антибактериальной терапии препаратов группы макролидов позволяет
изменить прогрессирующее течение заболевания и достичь относительной
клинической стабилизации процесса на этапе предоперационной подготовки
у значительной части больньж.
4. Впервые разработан лечебно-диагностический алгоритм у больньж с
фиброзно-кавернозным туберкулезом и сопутствующей хламидийной
инфекцией, применение которого позволяет значительно повысить общую
эффективность хирургического лечения этой категории больньж.
Доказана необходимость исследования мазков-отпечатков с резецированных участков легкого с помощью реакции прямой иммунофлюоресценции на хламидийную инфекцию, что позволяет назначить в раннем послеоперационном периоде препараты с антихламидийной активностью
Впервые изучены морфологические особенности туберкулезного воспаления в органах грудной клетки, пораженньж фиброзно-кавернозным туберкулезом и хламидийной инфекцией, которые заключаются в значительном преобладании в зоне поражения экссудативньж и казеозно-некротических реакций над продуктивными, наличии генерализованных васкулитов сосудов легких и поражении бронхов, наличии характерньж для Chlamydophila pneumoniae цитоплазматических включений в клетках -фагоцитах.
Основные положения, выносимые на защиту
Частота сопутствующей хламидийной инфекции у больньж фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, направленных на хирургическое лечение, достигает 56,5%.
Особенностью клинического течения фиброзно-кавернозного туберкулеза легких у больньж с сопутствующей хламидийной инфекцией является прогрессирование специфического процесса с развитием распространенных и осложненных форм заболевания.
В комплексную предоперационную подготовку больньж фиброзно-кавернозным туберкулезом легких и хламидийной инфекцией, а также в раннем послеоперационном периоде целесообразно включать антибиотики группы макролидов (азитромицин) сроком на 14 дней, что способствует повышению эффективности хирургического лечения на 35,9%.
Морфологическими особенностями туберкулезного воспаления при сочетании с хламидийной инфекцией являются: значительное преобладание в зоне поражения экссудативньж и казеозно-некротических реакций над продуктивными, наличие генерализованных васкулитов сосудов легких и поражение бронхов, наличие характерных для Chlamydophila цитоплазматических включений в клетках - фагоцитах.
Практическая значимость
Проведенная работа позволяет определить новые подходы в
предоперационном обследовании, подготовке и послеоперационном ведении больньж фиброзно-кавернозным туберкулезом легких. Дополнительное обследование больньж с целью вьшвления хламидийной инфекции при помощи реакции прямой иммунофлюоресценции в материалах браш-биопсии бронхов и изучение морфологии резецированньж участков легких, плевры, лимфатических узлов позволяет провести эффективную диагностику хламидийной инфекции.
Лечение больньж при сочетании фиброзно-кавернозного туберкулеза с хламидийной инфекцией как в предоперационном периоде, так и в раннем послеоперационном периоде осуществляется комплексно, с использованием антибактериальных препаратов группы макролидов, что позволяет существенно повысить качество хирургического лечения
Внедрение практику
Рекомендации, предложенные в диссертационном исследовании, внедрены в практической работе хирургического отдела ГУЦНИИТ РАМН.
Публикации и апробация работы
По теме диссертации имеется 16 публикаций в различных изданиях.
Основные положения исследований доложены на заседаниях секции торакальной хирургии Московского научного общества фтизиатров (Москва 2001 и 2002 гг.), на конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом (Московская медицинская академия им И.М. Сеченова, Москва, 2002г), на Ш конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Московская медицинская академия им И.М. Сеченова, Москва, 2004 г).
Работа апробирована на заседании отдела легочной хирургии ГУ ЦНИИТ РАМН (28 марта 2005 г.).
Структура и объем диссертации
Рецепторы, активируемые протеиназами (PAR): особенности структуры и функции
К настоящему моменту открыто три рецептора тромбина (рецептор, активируемый протеиназой - PARI, 3, 4). В 1991 году в лаборатории Coughlin впервые была клонирована мРНК и изолирована кДНК рецептора тромбина. Было показано, что рецептор принадлежит к суперсемейству семидоменных трансмембранных рецепторов и имеет близкое родство к подсемейству связанных с G-белками рецепторов гормонов и пептидов. Показано, что PARI имеет семь доменов, пронизывающих мембрану. Такое расположение приводит к образованию І Нг-концевой части из 94 остатков, трех внеклеточных петель, четырех внутриклеточных петель и внутриклеточного СООН-конца молекулы рецептора. Тромбин расщепляет пептидную связь Arg41-Ser в домене LDPR4,SFLLRN, за которым следует участок отрицательно заряженных аминокислотных остатков (DKYEPF) (Vu Т.К. et al, 1991а, 1991b). Этот отрицательно заряженный домен рецептора взаимодействует с анион связывающим сайтом 1 (АВЕ1) тромбина, индуцируя конформационные изменения в рецепторе и тромбине, облегчающие взаимодействие с каталитическим центром тромбина и обеспечивающие эффективный гидролиз рецептора. Отрицательно заряженная последовательность PARI по первичной структуре сходна с С-концевым доменом молекулы гирудина, который ингибирует тромбин за счет связывания и блокады его анионного сайта. О функциональной важности этого домена говорит тот факт, что его делеция приводит к потере способности тромбина активировать рецептор, а замена этой последовательности соответствующим доменом гирудина полностью восстанавливает активность рецептора (Vu Т.К. et al., 1991b). При расщеплении рецептора тромбином образуется новая N-концевая последовательность, так называемый привязанный лиганд, который селективно связывается со второй внеклеточной петлей расщепленного рецептора, активируя его.
Таким образом, активация рецепторов PAR тромбином — уникальный механизм: псевдоаутоактивация. Синтетические пептиды - аналоги «привязанного» лиганда, активируют рецептор без расщепления, что доказывает уникальность механизма активации рецепторов этого семейства протеиназами. Синтетический пептид SFLLRN, соответствующий N-концевой последовательности привязанного лиганда, и являющийся агонистом рецептора тромбина 1 типа, активирует клетки механизмом, не зависимым от расщепления рецептора. Анализ аналогов SFLLRN с заменами аминокислотных остатков выявил, что остатки Phe2, Leu4 и Arg являются критическими для активности лиганда (Coughlin SR., 1992 ). Пептид - агонист PARI подобно «привязанному» лиганду взаимодействует с рецептором в участке второй внеклеточной петли (Nanevicz Т. et al. 1995). Основанием для предположения о существовании второго рецептора тромбина (PAR3), помимо PARI, послужили опыты на PARl-нокаутных мышах, у которых тромбин индуцировал агрегацию тромбоцитов, но не активировал пролиферацию фибробластов (Connolly A.J. et al., 1996). PAR3 был впоследствии клонирован из тромбоцитов крысы. Выявлено 27% гомологии аминокислотной последовательности PAR3 с PARI и PAR2. Между PAR 1 и 3 есть структурное и функциональное сходство. PAR3 также содержит гирудиноподобный домен (FEEFP), комплементарный АВЕ1 молекулы тромбина, с которым взаимодействует тромбин. Так, у-тромбин, лишенный ABE, в 100 раз менее эффективен при активации PAR3, чем охгромбин. Мутация по связи активировать рецептор, что свидетельствует о расщеплении тромбином PAR3 в этом положении (Ishihara Н, 1997). Как и в случае с PARI новая N-концевая последовательность молекулы рецептора (TFRGAP) взаимодействует с рецептором как «привязанный» лиганд. Однако, синтетический пептид, гомологичный привязанному лиганду, не активирует PAR3. Тромбин также активировал тромбоциты дефицитных по PAR3 мышей, что дало основание предположить существование еще одного рецептора тромбина. Недавно клонирован PAR4, который имеет 30% гомологии с последовательностью PAR3. Тромбин расщепляет связь Arg47 -Gly48 в рецепторе PAR4 (Kahn ML, 1998). Найдены различия в чувствительности этих рецепторов к тромбину: PARI, PAR3 активируются низкими концентрациями тромбина, a PAR4 - высокими, что позволяет клетке дозозависимо отвечать на широкий спектр концентраций тромбина. В лаборатории Coughlin показано, что тромбоциты PAR4 дефицитных мышей не агрегировали в ответ на тромбин, а тромбоциты PAR3 дефицитных мышей отвечали на тромбин гидролизом фосфоинозитидов, причем эффективная концентрация индукторов была в 6 раз выше, чем в случае коэкспрессии PAR3 и PAR4. Авторы предложили новый механизм активации тромбином тромбоцитов мыши, заключающийся в том, что PAR3 функционирует как кофактор, необходимый для расщепления и активации тромбином PAR4 (Kahn ML, 1999; Coughlin SR, 2000). Этот механизм может объяснить неэффективность пептидных аналогов агониста PAR3 в активации рецептора. PAR2 — второй член семейства рецепторов, активируемых протеиназами, имеет 28% гомологии с PARI (Nystedt et al., 1994, 1995a, 1995b). Он был открыт с помощью скрининга библиотеки генома мыши методом ПЦР, используя праймеры ко второму и шестому трансмембранному доменам рецептора нейрокинина 2 (Nystedt et al., 1994, 1995 а). Аналогично тромбину, трипсин расщепляет единственную связь во внеклеточном домене, при этом экспонируется новая N-концевая последовательность, которая и аутоактявирует рецептор. Показано, что трипсин гидролизует связь Arg34 — Ser35 (Nystedt S., 1994; Hollenberg M., 1996). Пептиды - аговисты PAR2 (SLIGRL - у мышей, SLIGKV - у человека) активируют рецептор без расщепления и имитируют действие трипсина на такие клетки, как эпителиальные (энтероциты, кератиноциты), эндотелиальные клетки, миоциты, нейтрофилы и различные линии опухолевых клеток (Al-Ani, 1995; Bohm SK, 1996; Corvera CU, 1994; Howells GL, 1997; Hwa JJ, 1996; Kong W, 1997; Маті В, 1996; Mirza H, 1996; Saifeddine M, 1996; Santulli RJ, 1995). Трипсин взаимодействует с PAR2 только в месте расщепления, тогда как тромбин связывается со своим рецептором еще и в гирудиноподобном сайте.
Эффекты сериновых протеаз на нейроны и глиальные клетки
Появление сериновых протеаз в тканях мозга. Нарушение гематоэнцефалического барьера связано с цереброваскулярными инсультами, при которых значительно неизбирательно усиливается проницаемость мозговых капилляров к белкам (таблица проницаемости различных белков). Экстравазация сериновых протеаз в ткани мозга при патологических ситуациях не документирована. Возможный вход сериновых протеаз в мозг заслуживает тщательного рассмотрения в 3 сценариях. 1) Тромбин будет входить во внутритканевую жидкость во время проникающего ранения головы, геморрагического инсульта или разрыва мозговой аневризмы или при пороке развития артериовенозов. Предварительные исследования показали, что при субдуральной гематоме уровень тромбина в цереброспинальной жидкости может увеличиваться от ЮОпМ до 25нМ за более чем недельный период, что предполагает генерацию и присутствие значительных количеств тромбина в участке цереброваскулярных повреждений. Когда кровотечение происходит непосредственно в тканях мозга, тромбин и другие протеазы будут свободно проникать в межнейронные области за счет диффузии до тех пор, пока образовавшийся сгусток не закроет поврежденный сосуд и весь связавшийся тромбин не выйдет из сгустка. Присутствуют ли ингибиторы сериновых протеаз в концентрациях, достаточных для полной нейтрализации действия экстравазированных протеаз еще не установлено. Протромбин циркулирует в крови в высокой концентрации ( 1мкМ) (Lee KR, 1996). Повреждение сосуда запускает быстрое превращение его в тромбин и прямой вход тормбина в интестинальное пространство. Активация даже 0.02% протромбина, будет приводить к активации PARI нейронов и глии (для которых ECso = 50пМ) (Vu Т-К.Н,, 1991). Плазминоген также циркулирует в крови в высоких концентрациях ( 2мкМ) (Majerus PW, 1996). При попадании в мозг он может быть активирован эндогенным tPA в плазмин, который также может активировать PARI.2) Сериновые протеазы могут попадать в ткани мозга при терапевтическом лечении инсультов и хирургических операций. Например, при оперативных вмешательствах часто используют губки с адсорбированным тромбином (Gelfoam) для предупреждения избыточной кровопотери (Colon GP, 1996). Однако по данным ряда авторов появление тромбина может иметь нежелательные последствия независимо от хирургического исхода. Так показано, что активация PARI потенциировала функции NMDA рецептора: приводила к повышению цитотоксического уровня свободного цитозолъного Са + в некоторых популяциях нейронов (Gingrich М, 2000). Результаты исследования эффектов губок с адсорбированным тромбином на модели животных предполагают, что тромбин может участвовать в образовании отека и опухоли (Lee KR, 1996). Использование рекомбинантного tPA для восстановления реперфузии ишемических тканей после окклюзивного инсульта также может увеличивать уровень содержания в мозгу tPA и плазмина до уровня подобно как при увеличенной проницаемости ГЭБ во время ишемии. Драматическое уменьшение гибели нейронов на моделях ишемии у грызунов, вызванной делецией гена tPA, выдвигает на первый план важность изучения действия tPA на выживаемость нейронов. 3) Экстравазация сериновых протеиназ может происходить при нарушении ГЭБ во время гипертензии, беременности, эпилептического статуса, окклюзивного инсульта, инфекции, воспалении. Работ, по измерению уровня сериновых протеиназ крови в мозгу в этих условиях немного. Появление крупных маркеров (таких как флуоресцеин изотиоцианат меченный декстран (71.2 kDa) и альбумин (66 kDa)) вне сосудов в постишемический период, позволяет предполагать экстравазацию таких белков как тромбин, плазминоген и других протеаз крови. Кроме того, некоторые протеазы сами могут увеличивать проницаемость ГЭБ (NagyZ.,1998).
По данным ряда авторов мозг может быть источником протромбина (Dihanich М, 1991; Shikamoto Y, 1999; Deschepper CF, 1991). В работе Dihanich М (1991) показана экспрессия протромбина в коре, обонятельных луковицах, мозжечке и в других районах нервной системы крысы и человека, а также в культурах линий нервных клеток. Недавно показано, что мозг может быть также источником фактора X. Обнаружена экспрессия мРНК фактора X в мозге крыс и на клетках глиобластомы и нейробластомы человека (Shikamoto Y., 1999).
Недавно показано, что фибробласты, глиальные и нейрональные клетки экспрессируют активатор протромбина, связанный с мембраной (МАРА). Эта протеаза катализирует альтернативный путь образования активного тромбина, независимо от каскада свертывания (Sekiya F, 1994; Yamazaki Y, 1999).
Эффекты сери новых протеаз на нейроны и глиальные клетки. В настоящее время интенсивно изучаются молекулярные и клеточные процессы, приводящие к гибели нейронов, в том числе запускаемые сериновыми протеиназами в нейронах и глиальных клетках (рис.4).
Прорастание нейритов. Активация PARI вызывает втягивание нейритов в клетках нейробластомы мыши и куриных мотонейронах (Gurwitz D and Cunningham DD, 1998; Suidan HS, 1992; Turgeon VL, 1998), тогда как плазминоген и плазмин усиливают прорастание отростков (Nagata К, 1993). PARI вызванное втягивание нейритов в клетках нейробластомы NG108-15 блокируется АДФ рибозилированием Rho ГТФ - связанного белка (Grand RJA, 1996; Turgeon VL, 1997). Видимо, в патологической ситуации, при нарушении связей нейронов, тромбин может противодействовать способности нейритов создавать новые связи, вызывая изменение нейрональных процессов. Работы по изучению развития нервно-мышечных контактов, развития дофаминегрических нейронов in vitro дают основания для предположения вовлечения гРА, тромбина и PARI в ремоделирование отростков нейронов и синапсов (Baranes D, 1998; Liu Y, 1994; DebeirT, 1998).
Пролиферация глии. Глиальные рубцы часто связаны с повреждением мозга и пролиферирующая глия внутри этих рубцов формируют барьер для регенерирующих аксонов, мешая восстановлению нервов. Пикомолярные концентрации тромбина, также как и PARI активирующий пептид, стимулируют пролиферацию астроцитов и препятствуют стелляции астроцитов в культуре, что предполагает возможность проявления митогенных свойств тромбина in vivo (Grabham Р, 1995; Cavanaugh КР, 1990).
Исследование влияния тромбина на секрецию медиаторов перитонеальными тучными клетками
Данные об активации тучных клеток тромбином противоречивы. Ранее Rasin (1986), Nishikawa (1999), Kawabata (2000), используя коммерческие препараты тромбина, не получили доказательств активации перитонеальньк тучных клеток этим ферментом. В это же время в нашей лаборатории было установлено, что тромбин вызывает дозозависимое увеличение емкости и проводимости мембраны тучных клеток, а также двухфазное изменение внутриклеточного рН. Тромбин в высоких концентрациях вызывает деграиуляциго тучных клеток и освобождение гистамина, тогда как в низких концентрациях фермент повышает уровень цГМФ и снижает спонтанную секрецию гистамина. Эти данные позволили нам предположить существование рецепторов тромбина на тучных клетках (Струкова и др., 1992; Strukova et al, 1996; Умарова и др, 1997).
Противоречивые данные о взаимодействии тромбина и ПТК связаны с использозанием препаратов тромбина разной степени очистки. Тромбин - очень лабильный фермент и требует при работе в условиях in vitro стабилизации протеолитического и субстратсвязывающих центров. Поэтому в серии экспериментов по изучению механизмов взаимодействия тромбина с ПТК мы использовали более стабильный чем тромбин человека а-тромбин быка, в 0,15М NaCl (забуференном Трис-HCl до рН 7,3), содержащим 1М глицина и 0,3% бычьего сывороточного альбумина. Активность тромбина составляла 1000 NIH ед/мг белка и не менялась в течение всего эксперимента.
Было установлено, что а-тромбин в диапазоне концентраций 0.00 ЫмкМ активирует ПТК и вызывает секрецию Р-гексозаминидазы (рис.6). Максимум секреции медиатора составил 18.5±3.1% при спонтанной секреции 5.5±1.4% (р 0.01, п=10), ЕС50=0.1мкМ.
Для выяснения вопроса, участвуют ли PARs тромбина, в частности PARI в реализации действия фермента на клетки, мы инактнвировали PARI катепсином G. Известно, что катепсин G, помимо связи Arg -Ser, расщепляемой тромбином в PARI, гидролизует в структуре рецептора дополнительно еще две связи, что приводит к инактивации рецептора и подавлению активации тромбином эндотелиальных клеток и тромбоцитов (МоИпоМ, 1998).
Тучные клетки предварительно инкубировали с ЮОмкМ катепсина G в течение 5 мин, затем добавляли к ним 50нМ тромбина. Тромбин в этой концентрации повышал секрецию р-гексозаминидазы до 13.9±2.3% (при спонтанной секреции 5.5±1.4% в интактных ПТК) (р 0.05, п=8). Предобработка клеток ЮОмкМ катепсином G ингибировала вызванную тромбином секрецию до уровня, который достоверно не отличается от спонтанной секреции (7.8±2.1%) (рис.7). Эти данные дают основание предполагать, что тромбин активирует ПТК через рецептор PARI, хотя другие рецепторы тромбина также могут принимать участие в активации. В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние тромбина на секрецию тучными клетками оксида азота (N0) и фактора активации тромбоцитов (PAF), которые относятся к вновь синтезируемым медиаторам в ответ на активацию клеток. Для детекции этих медиаторов мы использовали их свойство влиять на агрегацию тромбоцитов: NO блокирует агрегацию тромбоцитов, a PAF служит мощным ее стимулятором (Salvemini D et al., 1990; Masini E et al., 1991; Hogaboam С et al., 1993). В работе анализировали изменение агрегации тромбоцитов, вызванную 5мкМ АДФ, в присутствии тучных клеток, активированных тромбином (Струкова СМ. и др., 1999). При инкубировании тучных клеток с тромбином в концентрации 1пМ во всех аликвотах регистрировали блокирование агрегации тромбоцитов (на 62±5.5% к 15-ой мин инкубации). Данный эффект низких концентраций тромбина можно объяснить активацией в тучных клетках NO-синтазы и продукцией N0, который блокирует агрегацию тромбоцитов. Антиагрегантная активность ПТК блокировалась L-NAME - ингибитором образования N0 и при использовании «ловушки» N0 - оксигемоглобина (Струкова СМ. и др., 1999) При добавлении 0,1 нМ тромбина к ПТТС отмечали ингибирование агрегации на 5-ой мин на 22±2.0%, а к 10-ой мин — увеличение агрегации на 33.5±5.3%. К 15-ой мин инкубации тучных клеток с тромбином (0,1нМ) агрегация вновь снижалась на 14,4% по сравнению с 10 мин (рис.8). При добавлении аликвот надосадочной жидкости из инкубата тучных клеток, обработанных 1нМ тромбином, наблюдали повышение агрегации тромбоцитов на 38±7,9% (15 мин инкубации с тромбином). Одной из причин активации тучных клеток наномолярными концентрациями тромбина может быть секреция ими PAF, Для доказательства этого предположения мы использовали специфический блокатор рецепторов PAF — гинголид В (ЗОмкМ). К тромбоцитам, обработанным гинголидом, добавляли тучные клетки, инкубированные с ОЛнМ тромбином. Увеличение агрегации было почти полностью заблокировано (рис.9). Данные этого опыта показывают, что тучные клетки при стимуляции 0.1 нМ тромбином высвобождают PAF, что приводит к активации агрегации тромбоцитов. Таким образом, тромбин в низких (нМ) концентрациях не вызывает секреции преформированных медиаторов тучных клеток, но стимулирует секрецию медиаторов, синтезируемых клетками de novo в ответ на активацию, к которым относится PAF. Данные о том, что тромбин в пМ-концентрациях ингибирует активность тучных клеток, снижая секрецию ими провоспалительных медиаторов, подтверждает предположение ряда авторов о роли тромбина как противовоспалительного агента в низких концентрациях (Gaboury JP, 1996; Kubes, Salvemini D, 1990; Струкова и др 1999). Можно предположить, что противовоспалительное действие тромбина осуществляется через активацию NO-синтазы в тучных клетках и продукцию ими оксида азота. В высоких концентрациях тромбин стимулирует секрецию преформированных медиаторов (гистамин, гексозаминидаза).
Исследование влияния агониста рецептора PARI на процесс репарации ткани в модели заживления резаной раны у мышей
Известно, что в месте повреждения сосуда имеет место тромбиногенез. Тромбин усиливает адгезию нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к эндотелиальным клеткам капилляров, увеличивает проницаемость сосудов и трансэндотелиальнуго миграцию клеток воспаления (Garcia JGN, 1996). Из тромбоцитов и эндотелиальных клеток, стимулированных тромбином, освобождается ряд ростовых и хемотактических факторов (Grandaliano G, 1994; Hung DT, 1992). Тромбин также может прямо влиять на миграцию, пролиферацию и способность клеток секретировать различные ростовые факторы и медиаторы воспаления, реализуя свое действие через активацию PAR (Струкова СМ, 1998; Fager G, 1995). Использование тромбина как фактора роста при заживлении ран представляет огромный интерес и мало изучено, однако, ограничено из-за его лабильности и провоспалительного эффекта высоких концентраций и возможности вирусной контаминации и, видимо, неперспективно (Major CD, 2003; Струкова СМ, 2001). Поэтому целесообразно использовать пептиды-агонисты рецепторов тромбина для заживления ран. Иммобилизация белков и пептидов в полимерную матрицу является эффективным методом их стабилизации.
Ранее были предложены методы иммобилизации высокоаффинного агониста PARI в полимерные композиты поливинилкапролактама (ПВКЛ) и поливинил-капролактам-кальций-альгинатные гидрогелевые пленки со слоями хитозана и поли-Ь-лизина (Струкова СМ и др., 1998; Strukova SM, 2001; Марквичева и др., 2002). Показано, что гидрогели с инкапсулированным пептидом-агонистом PARI существенно ускоряют репаративные процессы, вызванные усилением миграции, пролиферации клеток и неоваскуляризации в грануляционной ткани (Струкова СМ. и др., 1998; Strukova S, 1998).
Однако эти полимерные матрицы не являются биодеградабльными. Возможность использования пептидов-агонистов PARI для терапии ран в медицинской практике обусловливает необходимость продолжения поиска биосовместимых и биодеградируемых носителей, способных высвобождать лабильные пептиды в область повреждения ткани с заданной и контролируемой скоростью. С этой точки зрения сополимер молочной и гликолевой кислот является весьма перспективным. Он является биосовместимым, биодеградируемым и позволяет модулировать скорость высвобождения инкапсулированных агентов манипуляцией соотношения молочной и гликолиевой кислот.
В работе методом двойного эмульгирования были получены микрочастицы с иммобилизованным PARI-АР. Микрочастицы содержали 50% полимолочной и 50% гликолевой кислоты, их средний размер составил 30-40 мкм (рис.22). Для исследования кинетики десорбции PARI-АР использовали хорошо известное свойство пептида стимулировать агрегацию тромбоцитов человека in vitro. Установлено, что в течение первых 4 часов из микрочастиц десорбируется 90% пептида, спустя 23 ч в элюатах с поверхности микрочастиц все еще обнаруживали пептид (рис.22). Поскольку десорбированный пептид был способен активировать рецепторы PARI на тромбоцитах и вызывал их агрегацию, мы сделали вывод, что пептид сохраняет свою физиологическую активность после десорбции.Для изучения способности PARI-АР, иммобилизованного в микрочастицы ускорять репарацию тканей были проведены эксперименты in vivo на модели кожной резаной раны у мышей.
Процесс заживления ран включает три фазы: воспаление, пролиферацию и созревание грануляционной ткани. Фаза воспаления, которая обычно длится 3-5 дней, характеризуется появлением в очаге большого количества макрофагов, принимающих участие в остром адаптивном ответе. Для фазы пролиферации характерно резкое увеличение количества пролиферирующих фибробластов, синтезирующих коллаген и другие структурные компоненты внеклеточного матрикса, а также новообразование сосудов в грануляционной ткани (ангиогенез). Исследование динамики заживления показало, что уже на третьи сутки репарации количество макрофагов в ране, покрытой микрочастицами с PAR-1 АР, было меньше на 25%, чем в ранах у контрольных групп животных. Количество фибробластов, напротив, было больше в 2 раза по сравнению с контрольными группами (рис.23). На срезах грануляционной ткани в опытной группе можно видеть 3-4 слоя эпителия с многочисленными митозами, в контрольных - 2-3 слоя (рис.25-фото). Эти результаты свидетельствуют о сокращении фазы воспаления в области раны под действием десорбирующегося из микрочастиц PAR-1 АР. На 7-ые сутки инфильтрация раны макрофагами была снижена в контрольных группах в 4 раза, а в опытной группе в 6 раз по сравнению с 3-ми сутками и в 2 раза по сравнению с контрольными группами. Количество фибробластов в опытной группе было максимальным (рис.23). Эти данные свидетельствуют о сокращении фазы пролиферации в ранах, покрытых микрочастицами с PAR-1 АР и, соответственно, об ускорении заживления ран. На срезах грануляционной ткани хорошо различимы 7-8 слоев ороговевшего эпителия, а образцы грануляционной ткани из открытой раны и раны, покрытой пустыми микрочастицами, имели 4 и 5 слоев эпителия (рис.26-фото). Изучение динамики сокращения площади ран показало, что на 7 день репарации наименьший размер имели раны, покрытые микрочастицами с PAR-1AP (8,6% от размера исходной раны) (рис.24). Следует отметить положительное действие на заживление ран самого сополимера молочной и гликолевой кислот (16% от размера исходной раны, покрытой пустыми микрочастицами по сравнению с 28% в открытой ране), что, возможно, связано с предохранением раны от внешней инфекции.
Таким образом, пептид-агонист рецептора тромбина PARI включается в воспалительную и пролиферативную фазы заживления раны, регулируя функции клеток в очаге повреждения и ускоряя заживление ран. Включение агониста PARI в полимерные матрицы (микрочастицы из полимолочной и гликолевой кислот) позволяет сохранить и оптимизировать его активность в области раны путем постепенного и контролируемого высвобождения.
