Введение к работе
Актуальность проблемы. В течение последних трех десятилетий во многих лабораториях мира ведутся интенсивные поиски эндогенных регулятороз активности Na.K-ЛТФааы. Уабаин-чувствительная Na.K-АТФаза является одним иэ ключевых мембранних ферментов, регулирующих трансмембранный транспорт одновалетных катионов (Na.K-насос), одновременно являясь специфическим рецептором для ингибиторов группы сердечних гликозидов. Взаимодействуя с узнающим участком Иа.К-АТФазн. сердечные гликозиды вплывают угнетение активности Na.K-АТФазн и Na, К-насоса. Тот факі, что высокоспеиифич-кый и селективный рецептор для сердечных гликозидов сохранился в процессе эволюции у многих видов ливотных - веский аргумент в пользу существования природного лиганда этого рецептора. Вероятно, этот лиганд, названный эндогенным дигиталисоподобным фактором (ЭДФ), регулирует активность Na.K-АТФазы и играет важную роль в осуществлении основных функций клетки. Были установлены биологические свойства ЭДФ : он стимулирует натрийурез, вызывает вазо-констрикцию и положительный инотропный эффект, а также обладает дигоксиноподобной иммунореактивностью (обзоры: Sohoner, 1992; Boto et ah, 1991)
ЭДФ млекопитающих, являясь натрииуретическиы фактором, играет существенную роль в поддержании водно-солевого баланса организма и принимает участие в патогенезе различных форм артериальной гипертензии (Haddy et al,1987;Gorilck,1986). На различных моделях экспериментальной гипертензии (преимущественно при объем-зависимых формах) было показано, что увеличение концентрации ЭДФ в плазме крови, первоначально имеющее адаптивное значение и направленное на выведение избытка натрия и воды, также играет существенную роль в1 развитии вазоконстрикции.По-видимому, избыточное образование ЭДФ приводит к угнетению натриевого транспорта в мембране гладких мышц сосудов, что, в свою очередь,акгиверуег Na+ -Са++ обмен и способствует их сокращению (Blaustein et ah, 1987).
Была изучена роль ЭДФ в патогенезе острого инфаркта миокарда (Багров и соавт., 1987,19B9;Bagrov et ah, 1989). Вероятно, при состояниях, требующих увеличения работы сердца (в частности, при инфаркте миокарда), в плазме крови происходит повьшиСле концентрации эндогенного дигоксиноподобного ингибитора Na.K-АТФазы. За-' держка натрия внутри миокардиоцитов приводит, как известно, к
увеличению концентрации внутриклеточного кальция. Это, в свою очередь, повышает сократимость миокарда. Следовательно, С-ЩФ молот являться физиологическим регулятором сократимости сердца (de River,1984; Navaratham et al.,1900; BagroV eL al. ,1901,1991a; Rutin et al.,199b).
Однако, чрезмерное увеличение концентрации ЗДО в плжме крови выбывает, вместо Физиологического эдикта, чрезмерное угнетение активности На,К-ЛТФапы, что, в свою очередь, провоцирует развитие аритмий. Так. же как и в рассмотренном вше примере с гипертонической .оо.пезш.ю, в этом случае важную роль играет ' ко-бочнш" аффект первоначально адаптивного действия ЩФ.
Вопрос о химической структуре '.ДО до настоящего времени остается открытым. Псльшинотво исследователей считают, что эндогенны» дигитапиооподсбный фактор является стероидом и синтезируется г. коре надпочечников. Исследования последних лет показывают, что ткани человека содержат несколько веществ, способных угнетать Na, К-АТФазу и взаимодействовать с антителами к дигоксину (Kelly et al.,lU85; Shaikh et. al. , 1991 ;Dor is, 1994), но лишь уабаин был выделен из плазмы человека и достоверно идентифицирован ( Ludens et а!.,1У1Л). Однако, уаоаин не может являться единственным эндогенным ингибитором натриевого касоса, играющим ключевую роль в пато-геневе гипертенэии, поскольку не является актш.ным вазоконстрик-торск (Yuan et al.,1993).
Несомненный интерес при поиске ответа на вопрос о природе вазоактиьного ЩФ мдекоиитакщих представляют стероидные соединения класса оуфадиенолидов - эндогенные ингибиторы Na.K-АТФааы, синтепируемие в паротидкых хелеэах и коле амфибий (ВагЫег et al.,1959; Filer,197«),' которые, в силу особенностей их эволюции (приспособление к смешанным пресно-соленым ареалам), выработали особую систему, позволяющую обеспечивать гиОкую регуляции чрез-кожного транспорта натрия - Na.K-АТФаау и её регуляторы.
Недавно было показано (Bagrov et al.,1993), что яд жаб Bui о marlnus, имеющий в своем составе Суфадиенолиды , является активным вазомнстриктором, что может свидетельствовать в пользу буфа-
ДИЄНОЛИДНОЙ ПРИРОДЫ СІДФ.
В качестве кандидатов на роль вазоактивного ЭДФ млекопитающих из соединений группы Оуфадиенолидов рассматривались ранее буфалин (Kievai et al.,1988; Cress et al., 1991; Panesar.1994) и
резибуфагенин (Lichtsteln et аІ.ЛЯЯб). Однако, убедительные данные о том, что эти соединения действительно удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к ЭД'Х>. а также сведения oft их реальном присутствии в организме млекопитающих в литературе отсутствуют.
Таким образом,учитывая возможность синтеза буфчдиенолидов в организме позвоночных , участие данного класса соединений в системе, обеспечивающей регуляцию чрезкозшого транспорта натрия у амфибий, их дигиталисоподобную иммунорежтивность , использование в традиционной восточной медицине препаратов кожи жаб в качестве положительных инотрогших средств и диуретиков, а также ярко пыра-хонине валоклнетрикторнне свойства яда xaft Bufo mai inns, исследование биологических свойств ЭДО кожи жаб и поиск их аналогов у млекопитающих, в том числе и у человека, является обоснованным и перспективным.
Цель и задачи исследования. Цель данной работа заключалась в проверке гипотезы о буфпдиенолидной природе ЭДО млекопитающих.
В ходе работы ставились следующие конкретнее задачи:
-
Поиск среди Суфадиенолидов яда жабы Bufo mariniis веществ, обладающих, наряду со способностью инп'биропагь Na, К-насос, свойствами, ожидаемыми от ЭДФ : вазоконстрикт"рной аістизностш и дигоксиноподобной иммунореактиЕНОстью.
-
Исследование фармакологическом. свойств выявленного вещества (маринобуфагенина) и сравнение механизма его вазоконстрик-торного действия с механизмом вазоконстрикторного действия уабаи-на..
-
Получение поликлональннх антител к маринобуфагенину и разработка флюороиммунометрического метода для определения его (или подобного ему соединения) в организме млекопитающих.
-
Изучение природы ЭДФ, образующегося при остром расширении внеклеточного пространства у собак.
-
Определение уровня маринобуфагениноподобного вещества в организме человека в остром периоде инфаркта миокарда.
-
Выделение и идентификация эндогенного буфадиенолида(ов) у млекопитающих.
Научная новизна. В работе впервые исследованы ваооконстрик-торные свойства буфадиенолидов яда жаб Bufo marlmC и выявлено вещество, которое придает яду свойства, присущие эндогенному дигиталису. Этим веществом является стероидное соединение маринобу-
фаге пин (3,5 гидрокси 14,15 эпокси буфадиенолид).
Установлены различия в механизмах вазоконстрикции, вызванной двумя различными ингибиторами натриевого насоса, маринобуфагени-ном и уабанном.
Впервые получены поликлональные антитела к марииобуфагенину, и на их основе разработан фиюороиммунометрический метод определения мариноОуфагенииноподобной ишунореактивнооти.
Обнаружено, что образование маринобуфагенииноподобного фактора в организме человека значительно возрастает в остром периоде инфаркта миокарда и при экспериментальной патологии.
Впервые удалось выделить из мочи человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии вещество с маринобуфагенинопо-добнок иммунореактивноотью, физико-химические свойства которого оказались неотличимыми от свойств маринобуфагенина. что позволяет нам утверждать, что вазоактивным ЭДФ человека является мариноОу-фагенин или его стереоиэомер.
Научно-практнчесная ценность ра&оти. В ходе данной работы из мочи человека был выделен и идентифицирован новый эндогенный регулятор активности натриевого насоса, аналогичный ЭДФ синтезируемому в паротвдных железах амфиоий-маринобуфагенину. Разработанный нами на основе пмиклональных антител флюороиммунометрический метод исследования позволяет производить измерения маринобуфагино-подобной иммунореакгивности в различных тканях, в разных физиологических и патологических условиях, что позволит, в комплексе с использованием антител к марииобуфагенину в физиологических экспериментах in vivo и in vitro расширить наши знания о механизмах регуляции водно-солевого баланса и сердечно-сосудистой системы , а также патогенезе, профилактике и лечении заболеваний, связанных с нарушениями этой регуляции.
Реализация результатов исследования. Разработанный нами флюороиммунометрический метод определения маринобуфагениноподобной иммунореактивности был использован в клинике неотложной кардиологии НИИ скорой помаци им. И.И.Джанелидзе.
Апр(ч>ш>4я работу.Основные результаты работы были доложены на Международной конференции "Натриевый насос",( Тодтмоосб Германия, 1993), конференциях европейской секции Международного общества по исследованию сердца (Иерусалим,1993 и Копенгаген.1994), Ежегодном заседании Совета по высокому артериальному давлениюАме-
- б -
рикаиской сердечной ассоциации (Чикаго,1994), 15 и 16 конференциях Американского общества гипертеизии (Нью-Йорк, 1995,1996)
Структура и объйм раооты. Диссертация шлолена на J { страницах машинописного текста, состоит иа введения, обзора литературы, результатов исследований, изложенных в 5 главах, каждая из которых состоит из описания материалов и методов, результатов и их обсуждения; заключения и выводов; списка испольаовон-ной литературы, который содержит /Zf работ. Работа содержит 2в рисунков и 1 таолицу.
Публикации. По материала.'* диссертации опубликовано 11 работ.