Введение к работе
Актуальность исследования. NaJC-АТФаза (ЕС 3 6 1 37) - фермент, поддерживающий трансмембранные ірадиентьі Na* и К* за счет активного транспорта этих ионов, что обеспечивает мембранный потенциал и возбудимость, а также ряд других важных транспортных механизмов клетки Ыа,К-АТФаза представляет собой димер, состоящий из а-и р-субъединиц, в некоторых тканях включает также у-субъединицу Субъединица а, содержащая места связывания с АТФ и ионами Na+ и К*, отвечает за каталитические и транспортные свойства Ыа,К-АТФазы, ее наружный участок является специфическим рецептором для сердечных гликозидов
Для позвоночных известны четыре изоформы а-субъединицы Ыа,К-АТФазы (al - a4), каждая из которых кодируется собственным геном По ряду данных основную насосную функцию в клетке выполняет изоформа al, тогда как прочие выполняют регуляторные функции Изоформы Ыа,К-АТФазы различаются по чувствительности к Na+ и К*, АТФ, гормонам и физиологическим стимулам, а также к сердечным гликозидам Физиологическая рочь изоформ Ыа,К-АТФазы во многом остается неясной и яатяется предметом интенсивных исследований (Лопина, 1999, Lingrel, 1992, Sweadner, 1995, Blanco, Mercer, 1998, Mobashen et al, 2000, Dobretsov, Stimers, 2005, Mijatovic et al, 2007)
В последние годы появляется все больше подтверждений функциональной и молекулярной связи Ыа,К-АТФазы с различными мембранными и внутриклеточными белками, формируется представление о дополнительной (не насосной) функции Na,K-АТФазы как сигнальной молекулы (Крылов и др, 1999, Schemer-Bobis, Schoner, 2001, Xie, Askan, 2002, Apena, 2007, Schoner, Scheiner-Bobis, 2007)
В скелетной мышце экспрессируются al- и а2-изоформы Ыа,К-АТФазы, причем фракция а2-изоформы по разным данным составляет до 50% и более (Haber, Loeb, 1988, Lavoie et al, 1997, Thompson et al, 1999, Hansen, 2001, He et al, 2001, McDonough et al, 2002) Изоформа al равномерно распределена в поверхностной плазматической мембране, тогда как изоформа а2 присутствует и в поверхностной мембране, но преимущественно в Т-системе скелетных мышечных волокон вблизи триад (Williams et al, 2001, Cougnon et al, 2002) Тиреоидные гормоны, глюкокортикоиды, инсулин, гипокалемия и холиномиметики обладают селективным регулирующим влиянием на индукцию и/илн активность а2-изоформы скелетной мышцы (Haber, Loeb, 1988, Hundal et al, 1992, Marette et al, 1993, Kragenbnnk et al, 1996, Thompson et al, 2001, McDonough et al, 2002, Knvoi et al, 2006) Количество а2-изоформы в плазматической мембране регулируется мышечной активностью (Kristensen et al, 2008) У грызунов а2-изоформа чувствительна к уабаину, тогда как al-изоформа уабаин-резистентна, что позволяет фармакологически разделять эти изоформы
4 специфическим ингибитором уабаином в концентрации 1 мкмоль/л (Кривой и др , 2006, Не
et al, 2001, Hartford et al, 2004)
Хотя важность Ыа,К-АТФазы для поддержания работоспособности скелетной мышцы хорошо известна (Clausen, 1998, 2003, Sejersted, Sjogaard, 2000), физиологическая роль al- и а2-изоформ в скелетных мышечных волокнах во многом не выяснена, причем до недавнего времени подобные исследования проводили преимущественно на мышцах мутантных животных (Не et al, 2001) и эмбрионов (Radzyukevich et al, 2004) Лишь недавно в опытах на зрелых мышцах нормальных крыс было установлено, чго основную роль в поддержании электрогенеза скелетной мышцы играет аі-изоформа, вклад в мембранный потенциал покоя (МПП) а2-изоформы относительно невелик (Кривой и др, 2003, 2006) Что касается работоспособности мышц, индивидуальная роль изоформ Ыа,К-АТФазы остается совершенно не ясной
Другой вопрос связан со способностью ацетилхолина (АХ) регулировать Ыа,К-АТФазу, что имеет непосредственное отношение к классической проблеме немедиаторной функции медиаторов (Ухтомский, 1940, Гинецинский, Михельсон, 1937, Коштоянц, 1951, Беритов, 1959, Зефиров, 1967, Полетаев, 1974) В скелетной мышце АХ в наномолярных концентрациях активирует ИаД-АТФазу, за счет чего вызывает не деполяризацию, а гиперполяризацию мышечных волокон (Платонова и др, 1986, Dlouha et al, 1979, Vyskocil et al, 1983, Nikolsky et al, 1994) Показано, что этот эффект АХ в диафрагме крысы реализуется за счет увеличения электрогенного вклада <х2-изоформы Na,K-ATOa3bi, а в основе эффекта лежит функциональное взаимодействие между никотиновым холинорецептором (нХР) и этой изоформой (Кривой и др, 2004, 2006, Knvoi et al, 2006) Тонкие механизмы этого взаимодействия до конца не раскрыты В частности неясна роль ионных токов через каналы нХР в реализации гиперполяризующего действия АХ
Имеющиеся данные позволяют предположить, что а2-изоформа Ка,К-АТФазы в скелетной мышце может быть вовлечена в регуляцию мышечного электрогенеза циркулирующими в наномолярном диапазоне концентраций хочииергическими лигандами Такие состояния могут возникать при недостаточности активности ацетилхолинэстеразы, при клиническом использовании антихолинэстеразных препаратов, а также при курении, когда концентрация никотина в крови составляет сотни наномолей (Lester, Dam, 1995, Benovvitz et al, 1997, Dam, De Biasi, 2001) Основное внимание исследователей во всем мире сосредоточено на роли никотина в ЦНС Описано снижение экспрессии ос2-изоформы Na,K-АТФазы в мозге крысы в условиях хронического действия никотина (Wang et al, 1994) Что касается скелетной мускулатуры, содержащей большой пул нХР, - потенциальных мишеней никотина, то имеются лишь единичные работы о хроническом влиянии никотина на
5 скелетные мышцы (Larsson et al, 1988, Pnce et al, 2003) В частности, нет данных о
хроническом влиянии никотина на электрогенез и критически важный для
функционирования скелетной мышцы фермент - Ыа,К-АТФазу, хотя известно о
возможности холинергической модуляции этого белка
И, наконец, сердечные гликозидь. (уабаин, дигоксин и др), являющиеся высокоспецифичными ингибиторами Ыа,К-АТФазы, в терапевтических дозах обладают кардиотоническим действием за счет положительного инотропного эффекта в сердечной мышце Этот эффект обусловлен частичным ингибированием а2-изоформы Ыа,К-АТФазы, которая кластеризована с Ка,Са-обменником в субклеточных микродоменах, примыкающих к саркогшазматическому ретикулуму (Blaustein, Golovina, 2001, Dostamc et al, 2003, 2005) В скелетной мышце также описан подобный эффект сердечных гликозидов (Кривой и др, 2005, Yamamoto et al, 1981, Не et al, 2001) Механизм этого эффекта в скелетной мышце не известен, однако предположительно в нем 7акже участвует а2-изоформа Ыа,К-АТФазы (Не et al, 2001)
Цель работы: выявление возможной роли а2-изоформы Ыа,К-АТФазы в регуляции скелетной мышцы холинергическими лигандами и дигиталисоподобными ингибиторами Ыа,К-АТФазы в наномолярном диапазоне концентрации
Задачи исследования.
Провести подробный анализ гиперполяризующего эффекта АХ в скелетной мышце крысы, включающий изучение действия специфических блокаторов Ыа,К-АТФазы, динамики развития эффекта и роли ионных юков через каналы нХР в его реализации
Исследовать хроническое действие никотина на электрические и сократительные характеристики скелетной мышцы крысы, оценить возможность модулирующего влияния никотина на ос2-шоформу Ка,К-АТФазы
Исследовать вовлечение а2-изоформы Ыа,К-АТФазы в реализацию положительного инотропного эффекта кардиотонических стероидов в скелетной мышце крысы, оценить роль этой изоформы в поддержании работоспосоСности мышцы
Положения, выносимые на защиту
В мышечных волокнах диафрагмы крысы предполагается существование двух пулов а2-изоформы ЫаД-АТФазы с различным сродством к уабаину, только один из которых опосредует гиперполяризующий эффект АХ в наномолярной концентрации Ионные токи через каналы нХР не являются фактором развития гиперполяризации, вызываемой АХ
Хронические инъекции никотина в іечение 2-3 недель приводят к долговременной модуляции работы ИаД-АТФазы и нарушению электрогенеза скелетной мышцы крысы за счет уменьшения электрогенного вклада а2-изоформы Ыа,К-АТФазы
3) Полная блокада а2-изоформы уабаином не вызывает нарушения работоспособности диафрагмы крысы при разных паттернах стимуляции Специфические блокаторы Na,K-АТФазы уабаин и маринобуфагенин усиливают сокращения диафрагмы в наномолярном диапазоне концентраций, соответствующем уровню их циркулирующих эндогенных аналогов
Научная новизна Впервые установлено, что кривая доза - ответ для действия уабаина на МПП мышечных волокон диафрагмы крысы существенно изменяется в присутствии 100 нмоль/л АХ, гиперполяризующего мембрану При анализе кривых впервые предсказано существование двух пулов а2-изоформы 1\[а,К-АТФазы с различным сродством к уабаину, из которых только один вовлечен в реализацию гиперполяризующего эффекта АХ Впервые исследована динамика действия АХ в наномолярной концентрации и описано наличие фазы деполяризации, предшествующей развитию гиперполяризации Установлено, что проадифен - блокатор открытого ионного канала нХР, устраняет фазу деполяризации, не влияя на величину и динамику гиперполяризации, что свидетельствует о развитии этого эффекта АХ и при блокаде ионных токов через каналы нХР Впервые продемонстрировано, что маринобуфагенин из паротидных желез Bufo marinus, считающийся специфическим лигандом al-изоформы Ка,К-АТФазы, блокирует гиперполяризующий эффект АХ в диафрагме крысы аналогично уабаину, что свидетельствует о его способности блокировать а2-изоформу Впервые в условиях моделирования формирования никотиновой зависимости у крыс, хронически (в течение 2-3 недель) получавших инъекции никотина, обнаружено снижение МПП диафрагмы за счет уменьшения электрогенного вклада ос2-изоформы Ма,К-АТФазы Описано ускорение сократительного акта, согласующееся с данными об увеличении в мышцах курильщиков табака доли быстрых волокон и уменьшении доли медленных волокон Впервые показано, что при полной блокаде а2-изоформы уабаином (1 мкмоль/л) активности al-изоформы достаточно для поддержания работоспособности диафрагмальной мышцы при разных паттернах стимуляции Установлено, что уабаин и маринобуфагенин усиливают сокращения диафрагмы крысы (положительный инотропный эффект) в диапазоне концентраций, соответствующем уровню их эндогенных аналогов
Практическая значимость работы Полученные данные раскрывают механизм участия а2-изоформы КаД-АТФазы в дочговременной регуляции скелетной мышцы циркулирующими в наномолярном диапазоне холинергическими лигандами и дигиталисоподобными ингибиторами ЫаД-АТФазы Эти знания важны для понимания механизмов побочных эффектов применяемых в клинике сердечных гликозидов, антихолинэстеразных препаратов (применяемых как стимуляторы памяти, при лечении ряда
7 нейродегенеративных расстройств, миастении и др), а также негативных последствий
курения Исследование физиологической роли изоформ Ыа,К-АТФазы и механизмов их
регуляции также важно для понимания процессов адаптации в условиях стресса,
интенсивной двигательной активности и дір Выделение и идентификация эндогенных
ингибиторов а2-изоформы ИаД-АТФазы может стать основой для разработки новых
стимуляторов мышечной и сердечной деятел ьНОСТИ
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийских школах "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2000, 2001), Российской медико-биологической конференции "Человек и (,го здоровье" (Санкт-Петербург, 2000, 2001), конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москіа, 2001), 10* International Conference on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps (Elsmore, Denmark, 2002), 47л Biophysical Society Meeting (San Antonio, Texas, USA, 2003), 11" International ATPase Conference and 594 Annual Meeting and Symposium of the Society of General Physiologists (Woods Hole, Massachusetts, USA, 2005), International Symposium "Biological Motility Basic Research and Practice" (Pushchmo, Russia, 2006), XX Съезде Физиологического общества им И П Павлова (Москва, 2007)
Публикации По теме диссертации опубликовано 24 работы, из них 12 статей в рецензируемых изданиях
Структура и объем диссертации Диссертация объемом 121 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 176 источников, из которых 34 отечественных и 142 зарубежны» Диссертация иллюстрирована 21 рисунком и 1 таблицей
