Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 8
1.1 Рецепторные тирозинкиназы 8
1.2 Мини-семейство рецептора инсулина
1.2.1 Структурная характеристика рецептора инсулина, инсулиноподобного фатора роста и рецептора, подобного рецептору инсулина 11
1.2.2 IRR – сенсор внеклеточного pH 14
1.2.3 Физиологическая роль IRR 15
1.3 Сигнальные каскады рецептора инсулина, инсулиноподобного фактора роста и рецептора IRR 21
1.3.1 Семейство субстратов рецептора инсулина 21
1.3.2 Фосфатидилинозитол-(3,4,5) трифосфат и фосфоинозитид-3-киназа 25
1.3.3 Нижестоящие киназы и фосфатиды 26
1.3.4 Инсулиновый сигнальный путь, нижестоящий от фосфоинозитид 3-киназы 27
1.3.5 IRR-опосредованные сигнальные пути и клеточные эффекторы 31
1.4 Механизмы резистентности к инсулину 32
1.4.1 Липид-зависимый механизм резистентности к инсулину 33
1.4.2 Церамид-зависимый механизм резистентности к инсулину 34
1.4.3 Воспалительный процесс 35
1.4.4 Реакция несвернутого белка 36
1.4.5 Оксидативный стресс 37
ГЛАВА II Объекты и методы исследования 38
2.1 Выделение геномной ДНК из хвостов и ушей мышей 38
2.2 Генотипирование мышей с помощью ПЦР 39
2.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле 40
2.4 Извлечение органов 40
2.5 Секвенирование транскриптомов 41
2.6 Выделение РНК и синтез кДНК 41
2.7 ПЦР в реальном времени (TaqMan Realime PCR) 42
2.8 Получение плазмидных конструкций 44
2.9 Получение компетентных клеток Е. coli 45
2.10 Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК с использованием теплового шока 46
2.11 Выделение плазмидной ДНК 46
2.12 Трансфекция эукариотических клеток
2.14 Электрофорез и Вестерн-блот анализ белков 47
2.15 Поведенческие особенности мышей
2.15.1 Тестирование социального интереса мышей 48
2.15.2 Тест «резидент-интрудер» 48
2.15.3 Тест «принудительного плаванья» по Порсолту 49
2.16 Статистическая обработка данных 49
ГЛАВА III Результаты исследованИЙ 50
3.1 Получение гомозиготных мышей одного поколения (littermates) 50
3.2 Генотипирование мышей методом ПЦР 51
3.3 Результаты сравнительного анализа количества транскриптов почек мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену рецептора IRR 54
3.4 Сравнительный анализ экспрессии генов почек методом ПЦР в реальном времени 59
3.5 Результаты сравнительного анализа количества транскриптов мозга мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену рецептора IRR 62
3.7 Поведенческие особенности мышей, нокаутных по гену сенсора щелочи insrr 66
3.7.1 Функциональная взаимосвязь рецептора IRR с белком Lynx2 70
3.8 Анализ роли фосфолипазы С2 в сигнальном каскаде рецептора IRR 72
Выводы 79
Список сокращений и условных обозначений 80
Список литературы 85
- Сигнальные каскады рецептора инсулина, инсулиноподобного фактора роста и рецептора IRR
- Электрофорез ДНК в агарозном геле
- Электрофорез и Вестерн-блот анализ белков
- Результаты сравнительного анализа количества транскриптов почек мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену рецептора IRR
Введение к работе
Актуальность исследования, степень ее разработанности. Почки служат регуляторами кислотно-щелочного баланса, поглощая НСОз" (фильтруется клубочками и генерируется в нефрон) и подкисляя мочу. Аномалии в этих процессах приводят к нарушению кислотно-щелочного баланса и вызывают метаболические кислотно-основные нарушения. Поддержание кислотно-щелочного гомеостаза имеет решающее значение для нормального существования жизни животных. Любые изменения рН могут иметь серьезные последствия для всех биологических процессов на уровне клеток, тканей и целого организма. Изучение сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию кислотно-щелочного равновесия, является актуальным.
Сигналы, поступающие из окружающей среды к клеткам, передаются через клеточную мембрану трансмембранными рецепторами. Одним из больших семейств рецепторов являются рецепторные тирозинкиназы (РТК) (van der Geer et al, 1994), которые играют существенную роль в клеточных процессах, таких как обмен веществ, контроль клеточного цикла, выживание, пролиферация, подвижность и дифференцировка клеток (Maruyama, 2014). Одним из таких является мини-семейство рецептора инсулина (IR), которое включает также рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR) и рецептор, подобный рецептору инсулина (IRR) (Tatulian, 2015).
Рецептор, подобный рецептору инсулина - IRR (IRR - insulin receptor-related receptor) - это «сиротская» рецепторная тирозинкиназа (Petrenko et al., 2013). Было выявлено, что IRR-рецептор, в отличие от его гомологов, способен активироваться при рН > 8,0, и является клеточным сенсором слабощелочной внеклеточной среды (Deev et al, 2006, Deyev et al, 2011).
Цель исследования поиск и характеристика белков, функционально связанных с рецептором щелочи IRR.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
S получить однопометные (littermates) мыши и выявить методом генотипирования гомозиготные мыши одного поколения - дикого типа и нокаутные по гену insrr;
S методом NGS-секвенирования транксриптомов определить гены, у которых изменена экспрессия у мышей, нокаутных по гену insrr, в сравнении с мышами дикого типа;
S на основе данных, полученных в результате секвенирования, провести анализ экспрессии генов из почек мышей методом ПЦР в реальном времени (TaqMan Real-Time PCR);
S провести анализ поведенческих особенностей мышей, нокаутных по гену рецептора щелочи insrr;
S проанализировать сигнальный каскад рецептора IRR.
Научная новизна. Впервые был проведен сравнительный анализ транскриптомов однопометных мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену insrr. Было выявлено несколько десятков генов с измененной экспрессией. Была обнаружена взаимосвязь рецептора IRR с белком Lynx2, экспрессируемым, также как и IRR в холинэргических нейронах мозга и делеция гена которого вызывает
схожие поведенческие нарушения у мышей. У мышей, нокаутных по гену insrr,
нарушается социальное поведение и наблюдается дефицит агрессивно-
оборонительного поведения. Впервые было обнаружено, что фосфолипаза PLC-2 вовлечена в сигнальный каскад рецептора IRR.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные в диссертационной работе, имеют перспективное значение в поиске лекарств для борьбы с раком, диабетом, ожирением и различными метаболическими нарушениями. Данные могут быть использованы при подготовке лекционного материала по курсам «молекулярная биология» и «физиология человека и животных», а также при разработке методических материалов для практических и семинарских занятий.
Методология и методы диссертационного исследования. Диссертационная работа выполнена с использованием классических и современных методов молекулярной и клеточной биологии, современных методов секвенирования с использованием новейшего оборудования.
Положения, выносимые на защиту
1. Внутриклеточная фосфолипаза PLC-2 участвует в сигнальном каскаде
рецептора IRR.
2. Нокаут гена insrr у мышей приводит к изменению экспрессии ряда белков, в
частности продуктов генов hsd3b2, slc8a, pds, которые регулируют ионный обмен, и
гена igf2, кодирующего лиганд рецепторной тирозинкиназы IGF-IR,
высокогомологичной рецептору IRR.
3. Нокаут гена insrr вызывает нарушения в социальном и агрессивно-
оборонительном поведении у insrr-нокаутных мышей, что может быть связано с
увеличением экспрессии гена lynx2, что приводит к нарушению холинэргической
регуляции в мозге.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях: XXVI Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 10-14 февраля 2014 г.); XXI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 7-11 апреля 2014 г.); XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2015» (Москва, 13-17 апреля 2015 г.).
Личный вклад автора. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены автором на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства ФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и в лаборатории клеточной биологии рецепторов ФГБУ Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук. Планирование, выполнение экспериментов, анализ данных, написание статей проведен при личном участии автора. Эксперимент с поведенческими особенностями мышей выполнен совместно с коллегами из ФГБУ «ФМИЦПН им. В.П. Сербского» Минздрава России (Зубков Е.А., Морозова А.Ю., Чехонин В.П.). Аспирантом лично проведен анализ литературы и подготовлен обзор, написана и оформлена диссертация.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, 2 из которых – статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы, список сокращений и условных обозначений, приложения. Работа содержит 7 таблиц, 17 рисунков и 6 приложений. Список цитируемой литературы содержит 147 источников.
Сигнальные каскады рецептора инсулина, инсулиноподобного фактора роста и рецептора IRR
Активация IRR щелочной средой специфична, дозозависима, а также сопровождается конформационными изменениями во внеклеточной части рецептора, определяемой эктодоменом, и напоминает особенности взаимодействия лиганд-рецептор. Также происходит активация белков внутриклеточного сигнального каскада IRS-1 и Akt, включая ремоделирование актинового цитоскелета. Эксперименты in vivo с использованием мышей, нокаутных по гену insrr, показали, что рецептор IRR участвует в удалении избыточных оснований почками, что необходимо для поддержания кислотно-щелочного равновесия в организме (Deyev et al., 2015, Deyev et al., 2013, Deyev et al., 2011). Поддержание внеклеточного и внутриклеточного рН имеет важное значение для организма. Белки представляют собой макромолекулы, которые ведут себя, как буферы. Они могут связывать вариабельное число протонов (или гидроксильных анионов) в зависимости от значения рН окружающей их среды. В качестве примера: все ферменты проявляют максимальную каталитическую активность при одном конкретном значении рН и их активность резко снижается, когда рН окружающей среды отклоняется от этого значения. Действительно, изменения в состоянии протонирования могут вызвать значительные модификации третичной структуры белков. В качестве альтернативы, протоны могут также непосредственно связываться с остатками, участвующими в каталитическом сайте. Некоторые белки могут связывать протоны. Так, например, натрий/протонный обменник NHE3 имеет внутренний сайт связывания протона и протоны могут вызывать аллостерическую стимуляцию транспортной активности NHE3 независимо от его роли в качестве субстрата для обмена с внешним Na+ (Aronson et al., 1982).
К факторам, нарушающим стабильность рН организма, относятся: образование большого количества СО2, вследствии клеточного окислительного дыхания, которое представляет собой чистую нагрузку летучей кислоты, а также образование кислот в результате метаболизма белков, вызванного диетой. В случае вегетарианской диеты или при употреблении бикарбонат-содержащей минеральной воды в организм человека поступают основания. Для того, чтобы нейтрализовать кислоты или основания организм выводит избыточный СО2 легкими, а физиологическая концентрация бикарбоната в плазме поддерживается почками (Alpern, 2000).
Почки имеют большое количество узкоспециализированных эпителиальных клеток, которые выполняют три основные функции: 1) бикарбонат плазмы фильтруется через клубочки и реабсорбируется вдоль почечных канальцев; 2) протоны, образующиеся в результате метаболизма белков, секретируются в почечный фильтрат, где нейтрализуются слабыми основаниями (например, креатинином, фосфатами, цитратами) или сильным основанием NH3, а затем выводятся с мочой; 3) избыток основания также может выводиться из организма, главным образом, в виде бикарбоната в моче. Два первых процесса критически зависят от подкисления мочи натрий/протонным обменником или с помощью Н+-АТФазы (Alpern, 1990), в то время как последний является результатом либо уменьшения утилизации бикарбоната, либо, что более важно, уменьшением секреции бикарбоната (Atkins and Burg, 1985, McKinney and Burg, 1977). Так как почка может выделять либо кислоты, либо основания в зависимости от физиологических условий (Alpern, 2000), что является противоположными процессами, существует необходимость в координированной регуляции механизмов секреции кислот и оснований. Например, в случае метаболического алкалоза (избыток оснований), абсорбция бикарбоната (основания) проксимальной частью нефрона уменьшается (Alpern et al., 1983, Eladari et al., 2002), в то время как секреция бикарбоната дистальным нефроном стимулируется (Galla et al., 1991).
Биологическая необходимость поддержания гомеостаза рН и адаптации к постоянным и меняющимся экстремальным значениям рН обуславливает существование биологических сенсоров как внеклеточных, так и внутриклеточных, способных обнаруживать изменения рН и вызывать ответ на физиологические изменения в регуляторных механизмах кислотно-щелочного равновесия. Однако, CO2, бикарбонат и рН взаимосвязаны между собой, определение «истинного» сенсора рН, т.е. молекулы, способной быть непосредственно активированной изменениями концентрации протонов или гидроксилов анионов оказывается затруднено, по крайней мере, в биологических жидкостях.
На сегодняшний день существующие сенсоры внеклеточного pH можно разделить на несколько групп: ионные каналы, например CatSper, который участвует в регуляции подвижности сперматозоидов, считается, что он активируется внутриклеточным подщелачиванием; однако не ясно, является ли это прямым следствием зависимости от pH (Lishko et al., 2012); ионотропные рецепторы реагируют на изменения внеклеточного pH, вызывающего аллостерические изменения молекулы рецептора, которые изменяют активность рецепторов; G-белоксопряженные рецепторы, реагирующие на подкисление клеточной окружающей среды, по-видимому, с помощью прямой Н+-чувствительности. Рецептор IRR является единственным примером метаботропного рецептора, который может быть активирован внеклеточным подщелачиванием (Petrenko et al., 2013). Существует другой пример тирозинкиназы, связанной с внутриклеточной рН-чувствительностью. Было показано, что тирозинкиназа Pyk2, член подсемейства фокальной адгезии цитоплазматических тирозинкиназ, активируется низкими значениями рН и работает в качестве основного внутриклеточного сенсора рН, инициирующего кислотно - регулируемый сигнальный каскад, участвующий в регуляции натрий/протонного обменника 3 (NHE3) в почечных проксимальных канальцах клеточной линии ОКР (Gluck, 2004, Li et al., 2004). В то время как механистические аспекты рН-сенсора и дальнейшего сигналинга IRR и Pyk2 недостаточно хорошо изучены, стоит отметить прямую активацию этих двух тирозинкиназ экстремальными значениями рН и их функции в качестве сенсоров щелочности / кислотности в почках и, возможно, других типах клеток.
Филогенетический анализ белков семейства рецептора инсулина показал, что IRR-рецептор эволюционировал из земноводных, и вместе с ортологами IR и IGF-IR остается консервативным у млекопитающих, включая человека. У рыб, существует два варианта IR и IGF-IR, но ортолога IRR не существует (Petrenko et al., 2013).
Для понимания функции гена insrr, ранее было отмечено, что он проявляет высокую тканеспецифическую экспрессию, по сравнению с широко распространенным распределением IR и IGF-IR в различных тканях и типах клеток. С помощью ПЦР-анализа кДНК тканей, большая концентрация продуктов гена insrr была обнаружена в почках. Примерно в 3-10 раз более низкие концентрации мРНК гена insrr были найдены в вилочковой железе, головном мозге, сердце и желудке, в то время как 150-кратно более низкие концентрации мРНК этого гена были обнаружены в плаценте, скелетных мышцах и печени (Mathi et al., 1995).
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Клетки НЕК 293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ФБС (fetal bovine serum, Hyclone), 1% пенициллин/стрептомицин, 2мМ L-глутамин при стандартных условиях (37 С, 5% СО2). Клетки с плотностью примерно 50% котрансфецировали плазмидами PLC-2 с IRR, pcDNA 3.1, с использованием реагента Unifectin-56 (Unifect Group, Москва, Россия) согласно рекомендациям производителя.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в буфере с SDS проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
При Вестерн-блот анализе белки подвергали электрофоретическому разделению в 10% ПААГ в присутствии SDS, а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Перенос белков осуществляли в электродном буфере (250 мМ Tris-HCl, 1% SDS, 2 М глицин, 20% метанол, рН 8,5) при постоянном значении силы тока 250 мА в течение 1,5 часов. После переноса белков на мембрану, её промывали TBS-буфером (20 мМ Tris-HСl, рН 7.6, 140 мМ NaCl, 0.1% Tween-20.). Для уменьшения неспецифической сорбции мембрану инкубировали в TBS-буфере, содержащем 2% BSA для мембран, которые в дальнейшем инкубировали с антителами на фосфорилированную форму белков или 5% обезжиренного молока для всех других случаев в течение 1-1,5 часов при комнатной температуре. Затем мембрану инкубировали с первичными антителами, специфичными к тому или иному белку в течение ночи при +4С. После этого 4 раза промывали TBS-буфером и далее инкубировали в течение часа со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Далее мембрану снова промывали 4 раза TBS-буфером, после чего связавшиеся антитела детектировали системой хемилюминесценции Super Signal West Pico (производитель «Pierce»). Проявку мембран проводили на приборе Fusion Solo WL.4M (производитель «Vilber Lourmat»).
В домашнюю клетку экспериментального самца (вес 29,5+0,9) подсаживали ювенильного самца линии Balb/c (5 недель, вес 19,4 ±1,5 г). Социальные и агрессивные элементы поведения были оценены с точки зрения их количества и продолжительности в течение 10 мин. Социальное взаимодействие включает обнюхивание головы партнера, обнюхивание тела, гениталий и хвоста, груминг и следование. Агрессию оценивали по проценту животных, проявляющих агрессивное поведение, а также по количеству и продолжительности атак (Vishnivetskaya et al, 2007).
Данный тест для измерения межсамцовой агрессии проводили по ранее описанному протоколу (Kulikov et al, 2005) с модификациями. В домашнюю клетку с тестируемым самцом (вес 29,5 + 0,9) помещали незнакомого ему половозрелого самца линии Balb/c возрастом около 3 месяцев (чужака) меньшей массы (масса чужаков составляла 25,2 + 0,3 г), для обеспечения дополнительного преимущества хозяина. После начала драки число и длительность нападений тестируемого самца на чужака регистрировали наблюдателем в течение 2 мин. Самцов, не нападающих на чужака за время теста (10 мин), квалифицировали как неагрессивных. Агрессивное поведение оценивали двумя индексами: 1) уровень агрессивности – процент агрессивных животных в линии; 2) интенсивность агрессии – число нападений на чужака за 2 мин. Чтобы избежать влияния опыта драк, самцов тестировали только один раз. Каждого чужака использовали так же один раз. Среднее число нападений определяли только для агрессивных самцов.
Мышь помещали в стеклянный цилиндр (высота 20 см, диаметр 14 см), заполненный водой при температуре 24 0С на 15 см, чтобы мышь не могла касаться хвостом дна. После 2 мин адаптации в течение 6 минут регистрировали время иммобильности. За иммобильность считали отсутствие активных движений. Воду меняли.
Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди-Вайнберга проводили по критерию 2 в сравнении с ожидаемыми (теоретическими) распределениями расщепляющихся потомств.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программ GraphPad Prism 5, MS Excel 2007, Statistica версии 6.0. Статистическую обработку данных результатов исследования уровней экспрессии генов проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни.
Данные по измерению показателей поведения животных выражали как M±SEM и сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Соотношение животных, не проявляющих характерного для линии C57BL/6J оборонительно-агрессивного поведения сравнивали по точному методу Фишера.
Электрофорез и Вестерн-блот анализ белков
В результате сравнительного анализа транскриптомов генов мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену insrr, был выявлен ряд генов с измененной экспрессией (приложения 1-3). Среди них экспрессия 7 генов у мышей, нокаутных по insrr, превышает экспрессию генов мышей дикого типа примерно в 2 раза. Данные гены кодируют белки: аквапорин-5, 3-бета гидроксистероиддегидрогеназа второго типа, бестрофин-1, рецептор эритропоэтина, белок 2, связывающий инсулиноподобный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста-2, галектин-3. Экспрессия 6 генов была больше у мышей дикого типа по отношению к мышам, нокаутным по insrr. Эти гены кодируют следующие белки: пендрин, транспортер мочевины 2 (UT2), аквапорин-2, натрий-калиевый обменник 1, калиевый канал входящего выпрямления, ядерный рецептор подсемейства 4 (таблица 5). Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа транскриптов с использованием метода глубокого секвенирования была выявлена взаимосвязь рецептора IRR с белками, принимающими участие в регуляции кислотно-щелочного равновесия и белками сигнального каскада рецептора инсулина.
Данные, полученные в результате глубокого секвенирования, анализировали методом ПЦР в реальном времени. К выбранным целевым генам со статистически достоверной разницей по результатам NGS-секвенирования (aqp5, aqp2, bestr1, epoR, igfbp2, slc14a2, igf2, pds, hsd3b2, slc8a, kcnj5, nr4a1, lgals3) мы подбирали праймеры и специфически отжигающийся зонд. В качестве гена сравнения был использован ген – gapdh. Ген gapdh – «ген домашнего хозяйства» высоко экспрессируется во всех клетках и тканях и используется в качестве контроля в ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинге (Huggett et al., 2005). Реакцию ПЦР в реальном времени ставили в 4-х повторностях.
В результате ПЦР в реальном времени была выявлена статистически достоверная разница экспрессии генов (рисунок 8, таблица 6 и приложение 4).
Примечание: WT – мыши дикого типа; KO – мыши, нокаутные по гену insrr Исходя из полученных результатов, представленных на рисунке 8, таблице 6 и приложении 4 были выявлены статистически значимые отличия в экспрессии генов, так как во всех случаях критерий Манна-Уитни Uфакт Uкрит и критерий значимости p-value 0,05. Таким образом, методом ПЦР в реальном времени показано, что экспрессия 4 генов статистически достоверно отличается у мышей, нокаутных по гену insrr, по отношению к мышам дикого типа. Аналогичные данные были получены по белку-пендрину методом Вестерн-блот анализа ранее в нашей лаборатории (Deyev, et al., 2011). Достоверное изменение экспрессии выявлено для генов hsd3b2, slc8a, pds, продукты которых регулируют ионный обмен, и гена igf2, лиганда рецепторной тирозинкиназы IGF-IR, высокогомологичной рецептору IRR. Гены hsd3b2, slc8a, pds принимают участие в регуляции водно-солевого и кислотно-щелочного равновесия, почки, таким образом, регулируют ионный обмен за счет изменения экспрессии этих генов, вызывая компенсаторный механизм защиты организма от нарушений водно-солевого баланса у мышей, нокаутных по insrr. Изменение экспрессии гена igf2 – природного лиганда рецептора IGF-IR связано с изменением сигнального каскада реакций у мышей, нокаутных по гену insrr. В результате ПЦР в реальном времени по генам aqp2, aqp5, bestr1, epoR, igfbp2, slc14a2, lgals3, kcnj5, nr4a1 не выявлено статистически достоверных различий в экспрессии (приложение 4). По данным секвенирования мыши, нокаутные по insrr, имели тенденцию к снижению в экспрессии генов aqp2, aqp5, bestr1, slc14a2, kcnj5, что связано с нарушением водно-солевого и кислотно-щелочного равновесия в результате нокаута гена insrr и выработки компенсаторного механизма защиты организма от данных отклонений. Так как у нокаутных по гену insrr мышей повышена концентрация СО2 в крови и наблюдается замедленное дыхание (Deyev et al., 2011), то увеличение экспрессии гена epoR (рецептора эритропоэтина) может быть связано с механизмом защиты организма от гипоксии. При гипоксических состояниях наблюдается повышенная секреция эритропоэтина, что приводит к быстрому повышению уровня гемоглобина и кислород снабжающей способности крови. Следует отметить, что у мышей, нокаутных по гену insrr, наблюдалась повышенная концентрация гемоглобина в крови по сравнению с мышами дикого типа (Deyev et al., 2011). Изменение экспрессии генов lgals3, nr4a1, igfbp2 связано с изменениями сигнального каскада реакций у мышей, нокаутных по гену insrr.
Мы проводили сравнительный анализ количества транскриптов в препаратах мозга. Анализ проводили на трех парах гомозиготных однопометных мышах дикого типа и мышах, нокаутных по гену insrr. Далее образцы отдавали для проведения глубокого секвенирования на платформе Illumina в ЗАО «Геноаналитика», ЗАО «Евроген» (приложения 5, 6). В качестве референсного генома была использована версия генома Mus musculus Ensembl, mm10. Картирование прочтений осуществляли в программе TopHat2 (Kim et al., 2013). При анализе дифференциально экспрессирующихся генов все типы РНК (rRNA, miRNA, snRNA, snoRNA, misc-RNA, mt_tRNA, pseudogenes), кроме mRNA, были маскированы. Анализ дифференциальной экспрессии проводили в R-пакете DESeq (Anders, 2012). Фильтровали те гены, суммарное количество прочтений в которых меньше 20. Значимыми считались изменения экспрессии, для которых p-value 0,05. В целом качество данных можно охарактеризовать как хорошее, более 99% прочтений прошли фильтрацию по качеству и были использованы в работе. Фильтрацию по качеству последовательностей проводили в программе fastq-mcf (Aronesty, 2011), удаление адаптеров, и коротких последовательностей в программе flexbar (Dodt et al., 2012). Качество данных анализировали в программе FastQC (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc).
Результаты сравнительного анализа количества транскриптов почек мышей дикого типа и мышей, нокаутных по гену рецептора IRR
Анализ активации mPLC-2 при совместной котрансфекции с mIRR и дефосфорилирования PLC-2 при разном времени экспозиции под слабощелочной средой (а - вестерн-блот анализ; б-диаграмма количественного анализа активации PLC- при p-value 0,03). Слева указано положение белковых маркеров в геле; Plcg2+IRR - совместная котрансфекция клеток HEK 293 конструкциями из мыши; снизу указаны антитела, с которыми инкубировали мембраны: anti-pPLCg2 - антитела на фосфорилированную форму PLC-2; anti-HA - антитела на С-концевую область фосфолипазы; anti-IRR - антитела на С-концевую область IRR; anti-pIRR – антитела на фосфорилированную форму IRR.
В результате данного эксперимента было показано, что при обработке котрансфецированных клеток плазмидными ДНК PLC-2 и IRR слабощелочным pH происходит активация рецептора IRR (вестерн-блот на pIRR) и активация фосфолипазы PLC-2 (вестерн блот на pPLC-2). Фосфорилирование белка - PLC-2 в слабощелочной среде наблюдается определенное время (дефосфорилирование PLC-2 при разном времени экспозиции), увеличение времени экспозиции приводит к снижению активации PLC-2. Проведенный количественный анализ активации (диаграмма справа) подтвердил наши опыты (p-value 0,03).
В следующем эксперименте через 36-48 ч после трансфекции клетки обрабатывали 20 мМ TrisHCl с промежуточными pH 7.1, 8.0, 8.4 в течение 15 мин (рис. 16).
Анализ активации рецептора при совместной котрансфекции Plcg2+IRR с промежуточными pH Tris HCl и базальное фосфорилирование PLC-2 (а - вестерн-блот анализ; б-диаграмма количественного анализа активации PLC-2 при p-value 0,001). Слева указано положение белковых маркеров в геле; Plcg2+IRR - совместная котрансфекция клеток HEK 293 конструкциями из мыши; Plcg2-трансфекция фосфолипазой клеток HEK 293 конструкциями из мыши; IRR- трансфекция IRR клеток HEK 293 конструкциями из мыши; снизу указаны антитела, с которыми инкубировали мембраны: anti-pPLCg2-антитела на фосфорилированную форму PLC-2; anti-HA - антитела на С-концевую область фосфолипазы; anti-IRR- антитела на С-концевую область IRR; anti-pIRR- антитела на фосфорилированную форму IRR.
В результате данного эксперимента было обнаружено, что при обработке трансфецированных клеток 20 мМ Tris-HCl, начиная с pH 8.4 только при одновременной котрансфекции и активации IRR происходит фосфорилирование PLC-2 (рис. 16). Количественный анализ активации (с учетом базального фосфорилирования PLC-2) подтвердил наши опыты (p-value 0,001). Поэтому согласно приведенным данным, представленным на рисунках 15 и 16, можно сказать, что между PLC-2 и IRR существует функциональная связь.
После этого, нам было интересно посмотреть, происходит ли фосфорилирование PLC-2 при активации рецептора IRR человека (Homo sapiens). Для этого мы проводили котрансфекцию клеток линии HEK293 конструкциями, кодирующими последовательности hIRR (с HA-тагом в С-концевой области) и hPLC-2 (с Myc-тагом в С-концевой области). В качестве контроля использовали клетки, трансфецированные плазмидой, кодирующей белок hPLC-2 совместно с вектором без вставки pcDNA-3.1, а также нетрансфецированные клетки HEK 293. Мы проверяли, что происходит при совместной контрансфекции рецепторов IRR с PLC-2. Через 36-48 ч после трансфекции клетки обрабатывали в течение 15 мин 20 мМ HEPES pH 7.1 и 8.8. После этого получали тотальные лизаты и анализировали вестерн-блоты (рис. 17). В качестве первичных антител служили: на фосфорилированную форму PLC-2 - Phospho- PLC-2 (Tyr 1217) 3871 (производитель «Cell Signaling»), антитела anti-Myc - антитела на С-концевую область фосфолипазы, антитела на фосфорилированную форму IRR и C-концевую область IRR были получены в нашей лаборатории. В качестве вторичных антител, служили антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (производитель «Jackson ImmunoResearch Laboratories»). Рисунок 17. Вестерн-блот анализ тотальных лизатов клеток линии HEK293. Слева указано положение белковых маркеров в геле; Plcg2+IRR совместная котрансфекция клеток HEK 293 конструкциями человека; PLCg2+pcDNA - трансфекция клеток HEK 293 фосфолипазой c вектором без вставки; снизу указаны антитела, с которыми инкубировали мембраны: anti pPLCg2-антитела на фосфорилированную форму PLC-2; anti-Myc - антитела на С-концевую область фосфолипазы; anti-pIRR- антитела на фосфорилированную форму IRR; anti-IRR – антитела на С-концевую область IRR. В результате проведенного эксперимента было показано, что при обработке слабощелочной средой котрансфекцированных клеток плазмидными ДНК PLC-2 и IRR человека происходит фосфорилирование PLC-2 и активируется рецептор IRR, что свидетельствует об их функциональной связи. Таким образом, можно заключить, что обнаружен сигнальный ответ внутриклеточной фосфолипазы PLC-2 при активации белка IRR слабощелочной средой.