Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1.1.Норадренергическая система 10
1.1.1.1. Топография норадренергических нейронов 10
1.1.1.2 Функциональная характеристика норадренергических нейронов 12
1.1.1.2.1. Синтез норадреналина 12
1.1.1.2.2. Запасание и выделение норадреналина 13
1.1.1.2.3. Обратный захват норадреналина 15
1.1.1.2.4. Катаболизм норадреналина 16
1.1.1.3. Рецепторы к норадреналину 17
1.1.2. Развитие норадренергической системы мозга 18
1.1.2.1. Образование и дифференцировка норадренергических нейронов 18
1.1.2.2. Функциональная характеристика развивающихся норадренергических нейронов 20
1.1.2.3. Рецепторы к норадреналину в перинатальном развитии 21
1.1.3. Гематоэнцефалический барьер 22
1.2. Периферическая норадреналин-продуцирующая система 23
1.2.1. Симпатическая нервная система 24
1.2.1.1. Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация 24
1.2.1.2. Рецепторы к норадреналину 26
1.2.2. Развитие симпатической нервной системы 27
1.2.2.1. Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация в перинатальном развитии 28
1.2.3. Адреналовая и экстраадреналовая система 29
1.2.3.1. Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация 29
1.2.3.2. Рецепторы к норадреналину 30
1.2.4. Развитие надпочечников и органа Цукеркандля 30
1.2.4.1. Метаболизм катехоламинов: синтез и деградация в перинатальном развитии 34
1.3. Функциональное значение норадренергических систем мозга и периферических органов 35
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1 Животные 37
2.2 Эксперименты 38
2.2.1. Стереотаксическое введение иммунотоксина в боковые желудочки мозга 38
2.3. Взятие и обработка материала 40
2.4. Методы 43
2.4.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография 43
2.4.2. Иммуногистохимический анализ 43
2.4.3. Вестерн-блоттинг 44
2.4.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 45
2.5. Статистическая обработка результатов 46
Глава 3. Результаты 47
3.1. Оценка секреторной активности центрального и периферических источников норадреналина в перинатальном периоде развития у крыс 47
3.1.1. Содержание норадреналина в мозге, надпочечниках, органе Цукеркандля и концентрация норадреналина в плазме крови 47
3.1.2. Активность тирозингидроксилазы и дофамин-бета-гидроксилазы (in vitro) 50
3.1.3. Содержание ферментов синтеза норадреналина – тирозингидроксилазы и дофамин-бета-гидроксилазы 52
3.1.4. Экспрессия генов ферментов синтеза норадреналина – тирозингидроксилазы и дофамин-бета-гидроксилазы 55
3.2. Разработка модели хронического выключения синтеза норадреналина в мозге неонатальных крыс 58
3.2.1. Содержание норадреналина в мозге, концентрация норадреналина в плазме крови через 24, 48, 72 часа после стереотаксического введения анти-ДБГ-сапорина в боковые желудочки мозга крыс на разработанной модели 58
3.2.2. Иммуногистохимическое исследование норадренергических нейронов голубого пятна мозга крыс через 48 и 72 часа после введения анти-ДБГ-сапорина 60
3.3. Оценка показателей синтеза норадреналина в надпочечниках через 48, 72 часа после стереотаксического введения анти-ДБГ-сапорина в боковые желудочки мозга крыс на разработанной модели 62
3.3.1. Содержание норадреналина 62
3.3.2 Экспрессия ферментов синтеза норадреналина – тирозингидроксилазы и дофамин-бета-гидроксилазы 62
3.4. Оценка показателей синтеза норадреналина в органе Цукеркандля через 48, 72 часа после стереотаксического введения анти-ДБГ-сапорина в боковые желудочки мозга крыс на разработанной модели 64
3.4.1. Содержание норадреналина 64
3.4.2 Экспрессия ферментов синтеза норадреналина - тирозингидроксилазы, дофамин-бета-гидроксилазы 65
Глава 4. Обсуждение результатов 67
4.1. Оценка вклада центрального и периферических источников норадреналина в поддержание физиологически активной концентрации норадреналина в крови в процессе развития организма 68
4.2 Разработка модели хронического выключения синтеза норадреналина в мозге неонатальных крыс 74
4.3 Оценка функционального взаимодействия органов, продуцирующих норадреналин в перинатальном периоде развития у крыс 74
Заключение 79
Выводы 80
Список сокращений 81
Список литературы 82
- Образование и дифференцировка норадренергических нейронов
- Содержание норадреналина в мозге, надпочечниках, органе Цукеркандля и концентрация норадреналина в плазме крови
- Оценка вклада центрального и периферических источников норадреналина в поддержание физиологически активной концентрации норадреналина в крови в процессе развития организма
- Оценка функционального взаимодействия органов, продуцирующих норадреналин в перинатальном периоде развития у крыс
Образование и дифференцировка норадренергических нейронов
НА-ергические нейроны мозга наряду с другими моноаминергическими нейронами у грызунов появляются довольно рано в онтогенезе – на 9-10,5 день эмбрионального периода (Э9-Э10,5) а дифференцировка их завершается в раннем постнатальном периоде. Развитию нейронов способствуют последовательное включение ряда транскрипционных факторов, таких как Mash1, Phox2a, Phox2b и Rnx / Tlx3 [Hirsch et al., 1998; Pattyn et al., 2000; Goridis, Rohrer, 2002]. С образованием НА-ергических нейронов ствола мозга начинает экспрессироваться ключевой фермент синтеза НА – ТГ.
В ходе развития задний мозг временно подразделяется на восемь сегментов, называемых ромбомерами. Каждый ромбомер отличается экспрессией определенных генов, поэтому НА ергические нейроны, полученные из отдельного ромбомера, характеризуются экспрессией разных транскрипционных факторов, которые могут быть генетическими маркерами различных групп НА-ергических нейронов. Известно, что группы нейронов А6, А7, образуются из 1,2,3 ромбомеров, группа нейронов А5, А2, А1 из 2,3,4 ромбомеров (рисунок 6) [Robertson et al., 2013; Plummer et al., 2017].
На Э14 начинается рост аксонов от тел нейронов, а на Э15 эти аксоны прорастают в вентральный средний мозг и дорсальный мост, образуя вентральные и дорсальные пучки НА-ергических волокон [Specht et al., 1981]. Хотя в развивающемся мозге НА-ергические аксоны одновременно иннервируют медиальную и латеральную кору головного мозга, дорзальная кора не иннервируется до Э19. Большинство НА-ергических волокон обнаруживается в гиппокампе приблизительно на Э18. В последствии эти НА-ергические волокна пересекают в латеральном направлении переднюю коммиссуру на Э20, где они достигают маргинальных и промежуточных зон латеральной фронтальной коры [Levitt et al., 1971; Verney et al., 1984]. После того как НА-ергические волокна достигают мозолистого тела, они следуют по двум разным направлениям: одна группа перемещается к мозолистому телу и входить в цингулярную кору, а вторая группа проходит ниже мозолистого тела и входит в перегородку. Примечательно, что на 7 постнатальный день жизни (П7) почти все слои неокортекса имеют НА-ергическую иннервацию. К П14 плотность иннервации НА-ергических волокон в неокортексе становится такой же, как в мозге взрослых грызунов [Levitt et al., 1971; Lidov et al, 1978; Berger et al., 1983].
Содержание норадреналина в мозге, надпочечниках, органе Цукеркандля и концентрация норадреналина в плазме крови
Согласно нашим данным, содержание НА в мозге в эмбриональном периоде развития является минимальным по сравнению со всеми изученными сроками. У плодов крыс на Э18 содержание НА в мозге составило 0,69±0,04 нг. К Э21 содержание НА увеличивается в 6,5 раз. После рождения содержание НА продолжает увеличиваться и на П3 составляет 37,79±2,63 нг. В период П3-П7 содержание НА увеличивается в 1,6 раз, а к П15 в 3,6 раз и составляет 213,16±10,86 нг. К П30 содержание НА продолжает расти (279,36±9,20 нг) (рисунок 12).
Содержание норадреналина в мозге у крыс в онтогенезе Э – эмбриональный день развития, П – постнатальный день развития Р 0,05 различия по сравнению с предыдущим сроком исследования
В надпочечниках содержание НА увеличивается в ходе всего рассматриваемого периода (рисунок 13). В эмбриональном периоде уровень НА достаточно низкий, резкий рост его наблюдается, начиная с третьей недели постнатального периода развития. Так, на Э18 содержание НА составляет 14,50±1,27 нг, с Э18 по Э21 увеличивается в 3,2 раза и составляет 46,16±3,07 нг. В период Э21-П3 содержание НА увеличивается в 2,5 раза (116,56±9,33) и к П7 продолжает увеличиваться. К концу второй недели жизни – на П15 содержание НА достоверно растет в 2 раза и составляет 358,95±22,95 нг. С П15 по П30 содержание НА продолжает увеличиваться и к П30 составляет 1234,12±49,84 нг.
Содержание НА в органе Цукеркандля достигает максимальных значений непосредственно перед рождением и в первые дни после него, в то время как уже к концу первой недели постнатального развития оно падает (рисунок 14). Так, на Э18 содержание НА составляет 8,99±1,22 нг, к Э21 оно резко увеличивается и составляет 44,16±4,92 нг. На П3 содержание не меняется (48,29±3,13), а на П7 – достоверно снижается и составляет 13,51±0,95 нг. К концу второй недели жизни на П15 содержание НА падает в 4,6 раза и составляет 2,90±0,24 нг, а на П30 не меняется. 40 і
Концентрация НА в плазме крови у крыс на Э18 составила 6,9±0,97 нг/мл. Далее к Э21 уровень НА падает в 5 раз (1,3±0,1 нг/мл), и на П3 увеличивается в 1,7 раз (2,23±0,27 нг/мл). В постнатальный период П3-П7 концентрация НА падает в 1,4 раза (1,58±0,12 нг/мл), а в период П7-П15 увеличивается 2,1 раза. К П30 концентрация НА падает в 2,3 раза и составляет 1,47±0,36 нг/мл (рисунок 15).
Оценка вклада центрального и периферических источников норадреналина в поддержание физиологически активной концентрации норадреналина в крови в процессе развития организма
Для достижения цели данной работы было поставлено несколько задач. Первая задача заключалась в оценке динамики экспрессии ферментов синтеза НА (ТГ, ДБГ). Вторая задача включала в себя оценку секреторной активности органов, продуцирующих НА в процессе онтогенеза. Исследование было проведено в перинатальном периоде у крыс на Э18, Э21, П3, П7 и П15, а также у взрослых грызунов в препубертатном периоде (П30).
Синтез норадреналина и секреторная активность мозга
Экспрессия ферментов синтеза НА в мозге имеет разную динамику (таблица 3). Экспрессия гена ТГ в мозге поддерживается на одном и том же уровне в течение всего перинатального периода. В отличие от экспрессии гена ТГ, содержание самого фермента увеличивается в ходе развития, достигая максимальных значений на П30. Известно, что экспрессия гена, количество белка и активность ТГ находятся под контролем транскрипционных и трансляционных механизмов, как у взрослых животных, так и в ходе развития организма [Flatmark, 2000; Fujinaga, Scott, 1997]. Разная динамика по экспрессии гена и белка может свидетельствовать о том, что происходит разная регуляция ТГ как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне.
В отношении динамики экспрессии ДБГ можно сказать обратное, так как экспрессия гена и белка имеют однонаправленные изменения, что говорит о схожей регуляции. Интересно, что в отличие от ТГ, которая является основным ферментом синтеза не только НА, но и дофамина, ДБГ участвует в основном только в синтезе НА, поэтому она может являться более специфическим показателем, характеризующим синтез НА в мозге [Levitt et al., 1965; Sabban, Nankova, 1997].
Синтез НА определяется скоростью синтеза, которая характеризуется таким показателем как активность ферментов. Активность обоих ферментов увеличивается к моменту рождения (на П3), далее активность ТГ продолжает увеличиваться, в то время как активность ДБГ не меняется. При сравнении содержания ТГ и его активности можно отметить, что эти показатели имеют схожую динамику (увеличиваются). По всей вероятности это говорит, о том, что в процессе развития увеличение активности ТГ в мозге происходит за счет увеличения содержания самого фермента. Активность ДБГ имеет пик на П3 и далее не меняется, при этом содержание фермента падает на П15. Это может свидетельствовать о том, что в пре – и раннем постнатальном периоде активность ДБГ в мозге увеличивается так же за счет содержания самого фермента. В дальнейшем же, в процессе развития нейронов и становления процессов нейротрансмиссии, для поддержания определенного уровня активности требуется меньшее количество фермента.
Содержание НА в органах, являющееся показателем результата синтеза и накопления НА в клетках, является, в конечном итоге, показателем секреторной активности органов. Содержание НА в мозге увеличивается в ходе развития (таблица 3). Вероятно, это может быть связано с процессами разрастания отростков нейронов и синаптогенезом, которые активно протекают в этот период онтогенеза [Nomura et al., 1976]. Кроме того, в течение второй недели постнатального развития происходит формирование гематоэнцефалического барьера [Miyaguchi et al., 1999; Kostrzewa, 2007], поэтому в это время увеличение содержания НА возможно за счет его накопления в НА-ергических нейронах.
Синтез норадреналина и секреторная активность надпочечников
Экспрессия ферментов ТГ и ДБГ в надпочечниках увеличивается к П3 и далее экспрессия генов падает, в то время как содержание белка не меняется (таблица 4). Это свидетельствует о том, что пока идет интенсивный рост содержания белка, экспрессия генов также растет, как только содержание белка ТГ и ДБГ достигает определенного уровня, необходимость в усиленной экспрессии генов этих ферментов снижается. При этом динамика экспрессии обоих ферментов схожая. Стоит отметить, что после рождения в надпочечниках происходит дифференцировка НА-ергических и адренергических хромаффинных клеток, что видимо и является следствием пика экспрессии этих генов [Tishler, 1989; Verhofstad et al., 1985]. Также необходимо учитывать, что содержание ферментов является результатом синтеза и деградации, поэтому оно может определяться скоростью обоих процессов. Известно, что ТГ локализуется в цитоплазме клеток и ее деградация происходит по убиквитин-протеасомному пути, при этом ДБГ находится в секреторных гранулах, тем самым данный фермент защищен от пептидаз и, вероятно, его разрушение происходит в межклеточном пространстве после экзоцитоза гранул [Nakashima, 2012; Tischler, DeLellis, 1988]. Если уровень деградации обоих ферментов в процессе развития не меняется, то увеличение содержания в клетке свидетельствует на усиление синтеза, однако литературных данных об этом недостаточно, чтобы провести такой анализ. Известно только, что симпатическая иннервация надпочечников у крыс созревает к П10 [Slotkin, 1973]. Поэтому возможно механизмы контроля синтеза и деградации до и после установления функциональной иннервации надпочечников могут отличаться.
В надпочечниках активность ТГ постепенно увеличивается к П3, что согласуется с активностью ДБГ, при том, что эти показатели также коррелируют с экспрессией ферментов. Далее изменение активности двух ферментов приобретает полностью противоположную направленность: в то время как активность ТГ увеличивается в ходе развития, активность ДБГ имеет скачкообразные изменения, что в литературе связывают с созреванием иннервации мозгового вещества надпочечников на П10 и изменением свойств везикулярных пузырьков, т.к. они также меняются в ходе онтогенеза [Slotkin, 1973].
Несмотря на то, что уровень НА увеличивается в надпочечниках на протяжении всего исследуемого периода, можно выделить 2 этапа, когда увеличение идет гораздо интенсивнее. Первый этап – с Э21 по П7, коррелирует с увеличением экспрессии ферментов. Рост уровня НА на данном этапе можно объяснить созреванием хромаффинной ткани надпочечников и началом установления симпатической регуляции. Второй этап – с П15 по П30, можно объяснить созреванием иннервации мозгового вещества надпочечников [Slotkin, 1973]. К П15 заканчивается формирование гематоэнцефалического барьера и инволюция органа Цукеркандля [Shobert, et al., 2013] т.е. надпочечники на ряду с симпатической нервной системой становятся важным источником НА в общей системе циркуляции, что требует большего синтеза НА.
Синтез норадреналина и секреторная активность органа Цукеркандля
Изменение синтеза НА в экстраадреналовых хромаффинных клетках органа Цукеркандля связано с особенностью данного органа, а именно с его инволюцией на второй-третьей неделе у грызунов. По данным литературы процессы, связанные с дегенерацией органа Цукеркандля, начинают возникать уже после рождения. Так, у мышей процессы аутофагии начинают проявляться на П3, в этот период уже обнаруживаются поврежденные хромаффинные клетки в органе Цукеркандля. Количество вырожденных хромаффинных клеток на П6 составляло у них приблизительно 10% от общего числа хромаффинных клеток. На П10 обнаруживаются отдельные клетки с небольшими остатками хромаффинных гранул [Shobert et al., 2013].
Экспрессия ферментов ТГ и ДБГ наибольшая в пренатальном периоде, далее в связи с началами процесса аутофагии она начинает снижаться и на П30 имеет наименьшие показатели. При этом динамика экспрессии обоих ферментов схожая (таблица 5).
Интересно отметить, как меняется активность ТГ и ДБГ. Активность ТГ увеличивается в начиная с пренатального периода и имеет пик на П7, дальше снижается. Активность ДБГ имеет пик на П3 и далее происходит ее снижение на П30. По полученным данным можно предположить, что процессы аутофагии проявляются на каждом из показателей синтеза по-разному. В то время как экспрессия ферментов резко снижается, активность этих ферментов еще сохраняется на высоком уровне и снижается только к моменту инволюции органа. Это можно объяснить тем, что по мере того как начинает происходить дегенерация хромаффинных клеток, неконтролируемым образом начинает снижаться содержание белка и мРНК ТГ и ДБГ, при этом живые клетки пытаются сохранить секреторную активность органа в целом.
Содержание НА согласуется с изменениями экспрессии ферментов ТГ и ДБГ – имея максимальный пик на П3, далее содержание НА снижается, имея минимальные значения на момент инволюции органа.
Оценка функционального взаимодействия органов, продуцирующих норадреналин в перинатальном периоде развития у крыс
Для оценки функционального взаимодействия НА-продуцирующих органов в перинатальном периоде развития была сформирована четвертая задача – проверить гипотезу о наличии взаимной гуморальной регуляции между органами-источниками НА.
Изменение показателей синтеза НА в надпочечниках
Через 24 и 48 часов после введения анти-ДБГ-сапорина в боковые желудочки мозга крыс на П2 содержание НА в надпочечниках по сравнению с контролем не меняется. Однако через 48 часов после введения иммунотоксина в опыте увеличивается экспрессия гена ТГ и ДБГ, что свидетельствует о том, что на уровне транскрипции компенсаторные процессы запускаются довольно быстро (раньше, чем меняется содержание НА). При этом на уровне трансляции изменений не наблюдалось, что может говорить о том, что для обнаружения изменений в экспрессии ферментов необходимо больше времени. Через 72 часа после введения анти-ДБГ-сапорина, т.е. на этапе восстановления уровня НА в плазме крови, увеличивается содержание НА в надпочечниках, также как и экспрессия генов ТГ и ДБГ. По этим результатам можно предположить, что в надпочечниках усиление экспрессии генов основных ферментов синтеза НА является началом компенсаторной реакции усиления их синтеза в ответ на снижение уровня НА в периферической крови. Это предположение подтверждается и тем, что через 72 ч после введения в желудочки мозга анти-ДБГ-сапорина в надпочечниках увеличивается спонтанное выделение НА [Бондаренко, 2017]. Механизм компенсаторного увеличения синтеза НА, обнаруженный на данной модели, возможно осуществляется через специфические ауторецепторы, которые как в нервных, так и в хромаффинных клетках у крыс начинают экспрессироваться уже в пренатальном периоде [Fujinaga, Scott, 1997]. Все эти изменения, наблюдаемые в надпочечниках на фоне дефицита синтеза НА в мозге могут свидетельствовать о наличии механизмов взаиморегуляции между НА-продуцирующими органами.
Изменение показателей синтеза НА в органе Цукеркандля
Через 24 и 48 часов после введения анти-ДБГ-сапорина в боковые желудочки мозга крыс на П2 по сравнению с контролем содержание НА в органе Цукеркандля не менялось. При анализе экспрессии ферментов, мы обнаружили, что через 48 часов после введения иммунотоксина в органе Цукеркандля в опыте увеличивается экспрессия гена ТГ и ДБГ, (такие же изменения наблюдали в надпочечниках). В то время как содержание ферментов оставалось на уровне контроля. Через 72 часа после введения анти-ДБГ-сапорина, содержание НА в органе Цукеркандля снижается. При этом показано, что спонтанное выделение НА в органе Цукеркандля увеличивается [Бондаренко и др, 2017]. По-видимому, на снижение концентрации НА в плазме орган Цукеркандля реагирует усиленным выделением, однако из-за протекающих параллельно процессов инволюции орган не в состоянии восстановить пул НА до исходного уровня.
Через 72 часа после введения анти-ДБГ-сапорина содержание мРНК ТГ и ДБГ в органе Цукеркандля не менялось. При этом, если рассматривать ответ со стороны органа Цукеркандля, все же стоит отметить, что процессы аутофагии, которые начинают проявляться с П3 могут влиять и на синтез НА, т.к. при уменьшении количества клеток, соответственно снижается синтез НА в целом во всем органе [Shobert, et al., 2013]. Тот факт, что экспрессия гена ТГ и ДБГ остается на уровне контроля, может говорить о том, что в оставшихся клетках усиливается синтез НА, и можно предположить, что при сохранении целостности всех клеток, мы бы увидели компенсаторный ответ.
Таким образом, на модели хронического выключения синтеза НА в мозге у крыс в неонатальном периоде развития показано компенсаторное увеличение секреторной активности периферических источников НА, что способствует поддержанию физиологически активной концентрации НА в общей системе циркуляции (рисунок 38). Полученные данные также свидетельствуют о наличии взаиморегуляции временных и постоянных источников НА в перинатальном периоде онтогенеза.