Функциональная взаимосвязь аммонийного (RhAG) и анионного (AE1) транспортеров эритроцитов человека Судницына Юлия Станиславовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы .10

1.1 Аммиак/аммоний в биологических системах .10

1.1.1 Биофизические характеристики аммиака/аммония .11

1.1.2 Источники аммиака/аммония в организме 12

1.1.3 Токсические эффекты аммиака/аммония .15

1.2 Трансмембранный транспорт аммиака/аммония 18

1.2.1 Rhesus-гликопротеины – транспортеры аммиака/аммония 19

1.2.2 Структура и функции RhAG 25

1.2.3 Патофизиология RhAG .28

1.3 Анионный транспортер AE1 .31

1.3.1 Структура и функции AE1 .32

1.3.2 Взаимодействие AE1 и гемоглобина 37

1.4 Структурная взаимосвязь аммонийного (RhAG) и анионного (AE1) транспортеров 39

1.5 Заключение 41

Глава 2. Объект и методики 44

2.1 Материалы .44

2.2 Методы 45

2.2.1 Доноры .45

2.2.2 Подготовка суспензии эритроцитов .45

2.2.3 Исследование импорта NH3/NH4+ эритроцитами .46

2.2.4 Исследования методом лазерной дифракции .47

2.2.5 Исследования методом проточной цитометрии 47

2.2.6 Ингибирование анионного транспорта 49

2.2.7 Исследования форм гемоглобина спектроскопическим методом 49

2.2.8 Статистический анализ 50

Глава 3. Результаты .51

3.1 Эритроциты человека импортируют аммиак/аммоний .51

3.2 Транспорт NH3/NH4+ в эритроциты человека обусловлен функционированием белков-транспортеров 56

3.2.1 Метод лазерной дифракции для исследования объемных характеристик эритроцитов 56

3.2.2 Скорость начального увеличения объема эритроцитов экспоненциально зависит от температуры среды 60

3.2.3 Скорость начального увеличения объема эритроцитов имеет pH-оптимум при 25 и 37С .63

3.3 Взаимодействие RhAG и AE1 транспортеров 65

3.3.1 HCO3- увеличивает скорость начального увеличения объема эритроцитов .65

3.3.2 Блокатор анионного транспортера DIDS ингибирует гемолиз в аммонийной среде .66

3.4 Взаимосвязь изменения pHi и объема при аммонийной нагрузке 69

3.4.1 Калибровка и выбор красителя 70

3.4.2 Влияние ингибирования анионного транспорта на pHi 71

3.4.3 Взаимосвязь изменения MCV и pHi 72

3.5 Влияние гипоксии на функцию RhAG-AE1 .76

Глава 4. Обсуждение 81

Глава 5. Заключение 88

Выводы 90

Список использованной литературы 91

• Rhesus-гликопротеины – транспортеры аммиака/аммония
• Эритроциты человека импортируют аммиак/аммоний
• Взаимосвязь изменения MCV и pHi
• Обсуждение

Введение к работе

Актуальность исследования. Сохранение аммонийного гомеостаза
организма является важной, однако недостаточно изученной темой на стыке
биологической и медицинской наук. Одним из маркеров нарушения
биохимического гомеостаза является изменение концентрации ионов

аммиака/аммония (NH₃/NH₄⁺) во внутренней среде. Известно, что NH₃/NH₄⁺ транспортируются путем диффузии и белками-транспортерами, но точный механизм транспорта и характер переносимого субстрата в эритроцитах остаются неясными. В связи с этим детальное исследование трансмембранного транспорта и его механизмов позволит понять пути регуляции процессов, связанных с патологией азотистого обмена, и позволит вырабатывать более корректные и эффективные терапевтические подходы.

Аммиак/аммоний – постоянные побочные продукты катаболизма аминокислот и реакций дезаминирования, но при превышении допустимой концентрации они становятся цитотоксичными, поэтому метаболизм и транспорт NH₃/NH₄⁺ являются важными составляющими биологических процессов практически всех органов (Ludewig et al., 2001). У взрослого здорового человека концентрация NH₃/NH₄⁺ в крови поддерживается на уровне 30-60 мкМ (Diaz et al., 1995). Концентрация аммиака повышается (гипераммониемия), когда печень не способна более конвертировать аммиак в мочевину (цирроз, острый гепатит, печеночная недостаточность), или, когда продукция аммиака превышает метаболическую емкость печени (физическая нагрузка, инфекции мочевыводящих путей, чрезмерное развитие микрофлоры желудочно-кишечного тракта, лечение вальпроевой кислотой или химиотерапия) (Gifford et al., 2017). Повышение концентрации аммиака в крови наблюдается при наследуемых дефектах цикла мочевины (от 500 до 2000 мкМ), органической ацидурии (от 100 до 1000 мкМ), нарушении окисления жирных кислот (до 300 мкМ), при таких неонатальных заболеваниях как синдром Рейе (от 100 до 350 мкМ и транзиторная гипераммониемия новорожденных (от 150 мкМ до 4000 мкМ в тяжелых случаях) (Chou et al., 2004; LaGow et al., 2007; Niranjan-Azadi et al., 2016; Gifford et al., 2017;

4 Dasarathy et al., 2017). Аммиак легко диффундирует сквозь гематоэнцефалический барьер, поэтому в случае гипераммониемии велик риск возникновения энцефалопатии.

У человека основные органы, вовлеченные в генерацию, секрецию и экскрецию аммиака – печень, почки, кожа, кишечник экспрессируют аммонийные транспортеры Rhesus-гликопротеины RhCG и RhBG (Marini et al., 2000; Liu et al. 2001; Huang et al., 2001; Weiner et al., 2010). Изоформа аммонийного транспортера – RhAG экспрессируется исключительно в эритроцитах человека (Westhoff et al., 2002). Кроме того, в отличие от других клеток крови, эритроциты проявляют уникальную реакцию увеличения объема до критических значений и лизиса при помещении в изотоническую аммонийную среду (Jacobs, 1924; Chernyshev et al., 2008). Такое поведение клеток указывает на возможную вовлеченность эритроцитов в аммонийный метаболизм в качестве «захватчиков и переносчиков». Однако роль эритроцитов в аммонийном гомеостазе и азотистом обмене недостаточно изучена. В связи с этим важно выявить возможный вклад эритроцитов в поддержание оптимальной концентрации NH₃/NH₄⁺ в кровотоке. Известно, что RhAG связан структурно с анионным транспортером (AE1, белок полосы 3, Cl^-/HCO₃^-обменник, SLC4A1), основным белком, регулирующим внутриклеточный pH (pH_i) и механическую стабильность эритроцита (Bruce et al., 2003; Swietach et al., 2010). В связи с этим, представляется необходимым изучить возможное наличие функциональной взаимосвязи аммонийного и анионного транспортеров, в частности в условиях гипоксии, так как гемоглобин (Hb) в T-форме (дезокси-Hb) связывается с цитоплазменным доменом AE1 (cdAE1) (Zhang et al., 2003; Welbourn et al., 2017), что может влиять на транспортную функцию AE1. Однако, остается неясным, влияет ли такое взаимодействие на транспорт NH₃/NH₄⁺ эритроцитами.

В связи с вышеизложенным были определены следующая цель и задачи
исследования. Цель настоящей диссертационной работы – изучение

функциональной взаимосвязи аммонийного (RhAG) и анионного (AE1) транспортеров эритроцитов человека в условиях аммонийной нагрузки. В

5 соответствии с поставленной целью, были сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1. Охарактеризовать способность эритроцитов человека импортировать NH₃/NH₄⁺;

2. Оценить роль простой диффузии аммиака и транспорта аммония, обусловленного белками-транспортерами, в эритроциты человека в условиях импорта NH₃/NH₄⁺;

3. Выявить функциональную взаимосвязь между RhAG и AE1 транспортерами эритроцитов человека в условиях транспорта NH₃/NH₄⁺;

4. Охарактеризовать изменение внутриклеточного pH (pH_i) и объема эритроцитов человека в условиях импорта NH₃/NH₄⁺;

5) Исследовать влияние гипоксии на импорт NH₃/NH₄⁺ эритроцитами человека.
Научная новизна диссертации. В результате проведенных исследований

охарактеризована способность эритроцитов импортировать (захватывать) NH₃/NH₄⁺. Исследование функциональных характеристик эритроцитов в условиях аммонийной нагрузки позволило выявить, что транспорт NH₃/NH₄⁺ эритроцитами человека обусловлен, в основном, функционированием белков-транспортёров, а не простой диффузией. Впервые предложено объяснение взаимосвязи работы аммонийного и анионного транспортеров эритроцитов человека. Также в рамках работы впервые показано, что именно изменение объема эритроцита, а не изменение внутриклеточного pH, отражает импорт NH₃/NH₄⁺ в клетку. Таким образом, в результате исследования получены доказательства в пользу важной роли эритроцитов человека в аммонийном метаболизме организма.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о путях и механизмах азотистого обмена организма, в частности о роли эритроцитов в сохранении аммонийного гомеостаза и механизмах его опосредующих. Данное исследование имеет как теоретическое, так и прикладное значение. На основании исследования создан аммонийный тест, позволяющий оценивать не только хрупкость мембраны эритроцита (как широко распространенный в клинике тест на осмотическую

6 резистентность эритроцитов), а также функциональные характеристики эритроцитов и активность мембранных белков-транспортеров. Тест на аммонийную резистентность эритроцитов уже применяется для корректировки терапии недоношенных новорожденных в критическом состоянии в «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта». В разработке находится тест-система для корректировки лечения пациентов с патологиями азотистого обмена и функционального состояния эритроцитов, в частности, пациентов, находящихся на терапии хроническим гемодиализом, и пациентов с заболеваниями печени. Полученные результаты и сделанные на их основе теоретические и практические выводы могут быть использованы при подготовке курсов лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Научные положения, выносимые на защиту

1. При физиологических условиях захват аммиака/аммония эритроцитами обусловлен, в большей степени, белками-транспортерами;

2. Аммонийный (RhAG) и анионный (AE1) транспортеры осуществляют сопряженный транспорт аммиака/аммония в эритроцитах человека;

3. Наряду с транспортом респираторных газов, эритроциты транспортируют аммиак/аммоний, обеспечивая гомеостаз аммонийных форм в крови. Личный вклад автора. Все экспериментальные данные, приведенные в

диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии. Автор проводил статистическую обработку полученных результатов, осуществлял их анализ, интерпретацию и обобщение, принимал участие в написании и подготовке публикаций по материалам работы.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, 3 из которых – статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций, 3 статьи в сборниках материалов конференций, 6 тезисов докладов всероссийских и международных конференций, 1 глава в монографии.

Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде устных и стендовых докладов на Всероссийской молодежной медицинской конференции с

7 международным участием «Алмазовские чтения — 2018» (Санкт-Петербург, 2018); XV Всероссийском совещании с международным участием, посвященном памяти академика Л.А. Орбели и 60-летию ИЭФБ РАН (Санкт-Петербург, 2016); V Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, 2016); III и IV Конгрессах гематологов России (Москва, 2016, 2018); International Congress of Cell Biology ICCB 2016 - 12^th (Прага, Чехия, 2016); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015, 2017); III Научно-технической конференции молодых ученых «Неделя науки – 2013» (СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2013); Международной конференции студентов и молодых ученых «Дни биохимии в СПбГМУ» с дипломом III степени (СПбГМУ, Санкт-Петербург, 2012).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (№ 16-04-00632 «Сценарии гибели эритроцитов человека: условия формирования микрочастиц», 2016-2018 гг.), программы Президиума РАН (№ АААА-А18-118013190188-5 «Аммонийный стресс в условиях экстремальной физической нагрузки: концепция оценки и условия коррекции», 2018-2020 гг.), государственного задания ФАНО России (№ АААА-А18-118012290371-3, 2018г.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы по исследуемой теме – глава 1, описания методики – глава 2, описания результатов исследования – глава 3, их обсуждения – глава 4, заключения – глава 5, выводов и списка литературы, который включает 197 источников (из них 193 иностранных). Работа иллюстрирована 30 рисунками и 2 таблицами.

Rhesus-гликопротеины – транспортеры аммиака/аммония

Первые признаки биологической роли Rh-гликопротеинов, заключающейся в осуществлении захвата «азота», были выявлены в результате наблюдения, что Amt («ammonium transporter» в E. coli) и Mep («methylammonium permease» в Saccharomyces cerevisiae) необходимы для роста микроорганизмов на среде с NH4Cl в качестве единственного источника азота (Fabiny et al. 1991; Marini et al., 1994). Marini с соавторами выявили что Rh-белки млекопитающих гомологичны Mep- и Amt-транспортерам дрожжей, бактерий и растений (Marini et al., 1997). Эти исследования показали, что трансфекция дрожжей, лишенных Mep, человеческим Rh-гликопротеином, восстанавливала их рост на среде, содержащей малые количества аммония/аммиака (Marini, Andre, 2000). В дальнейшем при исследовании этого феномена развернулась дискуссия о транспортируемом веществе, NH3, NH4+ или NH3/NH4+ (Bakouh et al., 2006). Ключевое событие в исследовании структуры Rh-гликопротеинов произошло в 2004 году, когда рентгеноструктурным анализом было выявлено строение бактериальной AmtB, оказавшейся гомотримером (Khademi et al., 2004; Zheng et al., 2004). Структурные исследования указали на то, что NH3 является транспортируемым субстратом, проникающим через каждую пору трех мономеров AmtB. Кристаллические структуры стали доступны для комплекса AmtB–GlnK (Conroy et al., 2007), Amt-1 грибов (Andrade et al., 2005), бактериального Rh50 (Lupo et al., 2007) и RhCG человека (Gruswitz et al., 2010).

Rh-белки млекопитающих включают 3 эритроцитарных белка (RhAG, RhCE and RhD) и 2 неэритроцитарных белка (RhBG and RhCG). RhCE и RhD (Rh30-белки), представляют собой 2 высоко сходных (92% идентичность в аминокислотной последовательности) 30-32кДА негликозилируемых белка. Rh30 взаимодействуют с Rh-ассоциированным гликопротеином, Rh50, (RhAG), определяющим экспрессию Резус-белков в мембране эритроцита (Planelles, 2007). Для RhCG, изоформы RhAG в печени, была определена кристаллическая структура тримерной архитектуры, как и у гомологов Rh-белков — Amt-транспортеров (Planelles, 2007; Gruswitz et al., 2010). Более того, анализ кристаллической структуры RhCG и высокая степень идентичности последовательности между RhCG и эритроцитарной изоформой указывают на сохранение олигомеризации. Исследования позволили предположить существование Rh-комплекса в виде гетеротримера 2RhAG/1Rh30, хотя данные компьютерного моделирования отмечали 1RhAG: 2Rh30 как более стабильную структуру (Planelles, 2007). Дальнейшие исследования привели к развитию идей о существовании Rh-комплекса, состоящего из 2RhAG/1RhCE/1RhD (Eyers et al., 1994; Boron, 2010; Gruswitz et al., 2010) (Рисунок 4).

Неэритроцитарные белки RhCG и RhBG экспрессируются в тканях, вовлеченных в гомеостаз NH3/NH4+ и/или транспорт NH3/NH4+ (в частности, в пищеварительном тракте, печени, почках) (Liu et al., 2001; Eladari et al., 2002; Quentin et al., 2003; Weiner, Verlander, 2003; Nakhoul, Hamm, 2004; Handlogten et al., 2005; Han et al., 2009). Важно отметить, что в печени RhBG избирательно экспрессируется в плазматической мембране перипортальных гепатоцитов. Так как эти клетки обладают высокоафинной глутамин-синтетазой, они должны иметь эффективный механизм, осуществляющий транспорт NH3/NH4+ (Planelles, 2007).

В почках присутствуют как RhBG, так и RhCG (Liu et al., 2000, 2001; Marini et al., 2000; Eladari et al., 2002; Verlander et al., 2003; Bakouh et al., 2006; Ripoche et al., 2006; Weiner, Verlander, 2010). Они ко-локализованы в кислото-секретирующих -клетках дистального канальца нефрона и в основных клетках собирательных трубочек почки. Секреция NH3 в полость (параллельно с выходом H+ в каналец полости приводит к формированию NH4+) играет важную роль в почечной экскреции H+ и, таким образом, в контроле системного pH. В то время как RhBG локализован в базолатеральной мембране (Eladari et al., 2002; Quentin et al., 2003; Verlander et al., 2003), RhCG присутствует как в базолатеральной, так и в апикальной мембранах (Han et al., 2006; Seshadri et al., 2006; Kim et al., 2009). Поддерживают гипотезу о том, что RhCG важен для секреции NH3 собирательной трубкой следующие факты: (1) у RhCG-нокаутных мышей не происходит достаточного закисления мочевины (Biver et al., 2008); и (2) специфичный по RhCG собирательной трубки нокаут приводит к подавлению базальной экскреции NH4+ в совокупности с нарушенным приростом экскреции NH4+ в ответ на кислотную нагрузку (Lee et al., 2009). Специфичный нокаут RhCG в вставочных клетках собирательной трубки приводит к менее жесткому дефициту экскреции NH4+ (Lee et al., 2010).

Осуществленные вслед за Marini с соавторами функциональные исследования подтвердили определяющую роль Rh-гликопротеинов в транспорте аммония/аммиака. Исключая исследование на тенях эритроцитов, большинство функциональных исследований были проведены при гетерологичной экспрессии Rh-гликопротеинов. Как описано ниже, все исследования согласуются в том, что Rh-гликопротеины – это первые известные специфические аммонийные транспортеры млекопитающих. Однако, механизм транспорта (транспортер, канал, каналоподобный белок), осуществляемого Rh-гликопротеинами и тип субстрата(ов) NH4+ и/или NH3 или H+ по–прежнему не установлен.

Нет прямого подхода для исследования транспорта аммония/аммиака, осуществляемого белками. Функциональные подходы позволили исследовать поток метиламмония в обе стороны, изменения pHi вызванные NH3/NH4+ и/или ток, обусловленный NH3/NH4+ методом фиксации напряжения в ооцитах Xenopus laevis. Все использованные методы имеют технические и принципиальные ограничения. Меченый метиламмоний, CH3NH2/CH3NH3+ (MeA), использованный как суррогатный субстрат для исследования потоков NH3/NH4+ через мембрану, является не самым подходящим индикатором для аммония (сродство транспортера к метиламмонию и аммонию различается, 10.65 против 9.25). В некоторых исследованиях, отсутствие изменения напряжения в ответ на MeA поток было расценено как важный аргумент в пользу электронейтральности транспорта NH3/NH4+.

Однако, эффект изменения pH в ответ на потоки MeA может быть вызван как прямым влиянием MeA, так и изменением трансмембранного градиента протонов или изменением в концентрации нейтральной формы MeA. При равном внеклеточном pH и равной концентрации MeA и NH3/NH4+, [CH3NH2] [NH3] в то время как [CH3NH3+] примерно равна [NH4+], в связи с разностью pKa.

Исследование изменения внутриклеточного pH, вызванного NH3/NH4+ – это наиболее широко используемый метод оценки потоков NH3 и NH4+ через мембрану.

Схематически возможные изменения внутриклеточного pH (определенные посредством использования pH-маркера или pH селективных микроэлектродов) при помещении клетки в среду, содержащую аммоний/аммиак в миллимолярной концентрации отражены на рисунке 5. pHi изменения как временная функция (dpHi/dt) являются маркером (Amm flux = dpHi/dt beta, beta - буферная способность клетки) входа NH3 (фаза защелачивания) и NH4+ входа (фаза закисления) в клетку. Тщательность (точность) определения зависит от чувствительности и скорости метода, используемого для измерения изменения pHi. Также, внутренние токи, вызванные NH3/NH4+, в ооцитах измеренные методом фиксации напряжения, используются как индекс транспорта NH4+. Главная сложность в интерпретации токов, вызванных NH3/NH4+, возможность различить ток, вызванный NH4+ транспортом, обусловленным экспрессируемым белком, ток специфически связанный с экспессированным белком и активацию эндогенной проводимости (Planelles, 2007).

RhBG и RhCG осуществляют транспорт аммония/аммиака. Функции эпителиальных Rh-гликопротеинов человека исследовали в ооцитах, экспрессирующих RhCG (Planelles, 2007). В отличие от контрольных ооцитов, аммоний/аммиак в субмиллимолярных концентрациях (от 0.1 мМ) вызывал внутренние токи в соответствии с NH4+ входом из внеклеточной среды в клетку. Амплитуда тока, вызванного NH4+, была потенциало-зависимой и pH зависимой (повышалась при щелочных значениях внеклеточного pH и понижалась при кислых значениях внеклеточного pH). Исследования кинетики транспорта аммония/аммиака выявили процесс, характеризуемый насыщаемостью и высоким сродством (Km для NH3 около 8 мкМ), в независимости от внеклеточного pH и концентрации NH4+, в соответствии с RhCG осуществляемым транспортом NH3. Важно отметить, что исследования pHi pH-чувствительными микроэлектродами выявили, что низкие концентрации NH3/NH4+ вызывают начальное защелачивание, с последующим закислением внутриклеточной среды в RhCG-экспрессирующих ооцитах. Бифазное изменение pHi не поддерживает теории о простом NH3-NH4+ котранспорте и предполагает, что транспорт NH3 и NH4+ обусловленые RhCG происходят независимо. Эти наблюдения подтверждают гипотезу о несвязанном входе NH3 и NH4+ или бинаправленном входе с входом NH4+. Planelles с соавторами пришли к выводу, что RhCG осуществляет NH3 транспорт и индуцирует NH4+ транспорт. Дальнейшие исследования подтвердили, что RhCG осуществляет бинаправленный транспорт NH3.

Эритроциты человека импортируют аммиак/аммоний

Установлено, что в норме соотношение аммония, содержащегося в эритроцитах и в плазме крови, составляет около 3 к 1 (Seligson, Hirara, 1957; Conn, 1966; Conn, 1992; Huizenga et al., 1994). При долговременном хранении крови в банках переливания крови было выявлено увеличение концентрации NH4+ в плазме до 419 ± 70 мкМ (Barta, Babusikova, 1982). Учитывая показатели нормы плазмы – до 60 мкМ, эти результаты свидетельствуют о том, что эритроциты могут депонировать NH3/NH4+. Соответственно, в этих клетках должна существовать система импорта/экспорта NH3/NH4+. В связи с этим первой задачей исследования являлось выявление способности эритроцитов импортировать аммоний. Для решения поставленной задачи был адаптирован ферментативный метод определения аммония в биологических образцах для 96-луночного планшета.

Сначала были получены калибровочные кривые для NH4Cl и (NH4)2SO4 (Рисунок 11), которые полностью совпадали.

Калибровочная кривая для Ammonia Assay kit, построенная по отношению разницы ОП проб на длине волны 340 нм (A340) до и после проведения ферментативной реакции. В качестве стандартов использованы (NH4)2SO4 и NH4Cl в концентрации (мкМ): 0, 50, 300, 588, 800. Данные представлены в виде M±SD (n=8, p0.05). Для получения проб, в суспензию эритроцитов (гематокрит HCT 10%) добавляли NH4Cl в концентрации 100/200/800 мкМ. Аликвоты суспензии отбирали через 1, 3, 6, 9, 12, 15 мин, центрифугировали, получали супернатант (пробу), используемый далее в ферментативной реакции.

При концентрации NH4Cl близкой к физиологической - 100 мкМ, происходил захват аммония эритроцитами (79±5%, n=4), эффект воспроизводился и при патофизиологических концентрациях: 200 мкМ (концентрация, которая вызывает тремор конечностей) и 800 мкМ (концентрация, вызывающая кому).

Эритроциты человека импортируют NH4+/NH3 из внеклеточной среды. (а) - в суспензию эритроцитов (гематокрит - HCT 10%, 1.2х109 кл/мл, среда №1, 37С) вносили NH4Cl в концентрациях, мкМ: 100, 200, 800; (б) - в суспензию эритроцитов (гематокрит - HCT 10%, 1.2х109 кл/мл, среда №1, 37С) вносили NH4Cl в концентрации 100 мкМ и 100 мкМ в условиях ингибирования AE1 (преинкубация 100 мкМ DIDS, 30 мин); (в) - в суспензию эритроцитов (гематокрит - НСТ 10%, 1.2х109 кл/мл, среда №1, 37С) вносили NH4C1 в концентрации 800 мкМ и 800 мкМ в условиях ингибирования АЕ1 (преинкубация 100 мкМ DIDS, 30мин); Пробы отбирали центрифугированием через 1-4 мин до добавки NH4C1 (контроль) и через 1, 3, 6, 9, 12, 30 мин после добавки NH4C1. Измеряли оптическую плотность ОП супернатанта, вычисляли Aз40 и использовали калибровочную кривую для получения абсолютных значений концентрации аммония в надосадке. Данные представлены в виде M±SD ( р 0.015 по сравнению с клетками без DIDS (критерий Уилкоксона для связанных выборок), п=4 для каждой концентрации, стрелкой отмечен момент внесения NH4CI, пунктирная стрелка отмечает кривую, характеризующую супернатант эритроцитов прединкубированных DIDS).

При исследовании воздействия хлорида аммония в субмаксимальных концентрациях на эритроциты было выявлено, что уже через 1 мин после добавки 200 мкМ NH4CI в суспензию эритроцитов концентрация аммония в супернатанте уменьшалась на 47±5% (п=4) и оставалась на таком уровне вплоть до 30 мин после внесения 200 мкМ NH4CI (Рисунок 12а). После добавки 800 мкМ концентрация аммония в супернатанте уменьшалась на 59±7% (п=4) и держалась на таком уровне в течение 30 мин. Блокирование функции анионного транспортера при 100 мкМ NH4CI ингибировало поглощение аммония/аммиака эритроцитами на 35±5% (п=4) (Рисунок 12в), при 800 мкМ NH4CI - на 34±2% (п=4) (Рисунок 12б).

На основании полученных результатов было рассчитано изменение внутриклеточной концентрации NH/ в условиях импорта МЇ3/МЇ4+. По соотношению внеклеточной и внутриклеточной воды и данным изменения концентрации аммония в среде (Рисунок 12), можно рассчитать внутриклеточную концентрацию аммония, используя следующее балансовое уравнение: [NHt]cell = [NHifceu+ (№t]0 [Ш+U, где [МЇ4+]сеіі - текущая внутриклеточная концентрация аммония; [МЇ4+]щ - текущая концентрация аммония в среде; Vm/VCeii - соотношение внеклеточной и внутриклеточной воды; [NH4+]out - исходная внутриклеточная концентрация аммония; [МЇ4+]о - нагрузочная концентрация аммония в среде при добавке. Исходная концентрация эритроцитов в суспензии RBC = 1.2х1012 кл/мл, средний объем клеток MCV = 84 fL, тогда соотношение внеклеточной и внутриклеточной воды оценивается как 9:1 (Vm/Vcell = 9). Начальные условия: [NH4+]out0 = 30 мкМ (постулируя равновесное состояние со средой) и [NH4+]0= 800 мкМ. На основании этих данных и составленного балансового уравнения была рассчитана динамика изменения внутриклеточной концентрации аммония, представленная на Рисунке 13. Рассчитано, что определяемая экспериментально убыль аммония в среде (Рисунок 12) должна приводить к увеличению внутриклеточной концентрации аммония до 4.32±0.12 мМ (n=4). В случае ингибирования AE1 внутриклеточная концентрация аммония должна была увеличиться до 2.20±0.19 мМ (n=4).

Эритроциты импортируют NH3/NH4+. Результаты теоретического расчета внутриклеточной концентрации NH3/NH4+ по соотношению объемов внутри- и внеклеточной воды. Расчет сделан для концентрации 800 мкМ NH4Cl в условиях ингибирования анионного транспорта (красная линия на графике) и без (зеленая линия на графике).

Приведенные выше данные указывают на то, что в эритроцитах человека присутствует система импорта NH3/NH4+, позволяющая захватывать и депонировать NH3/NH4+. Ингибирование захвата аммония в условиях блокирования AE1 свидетельствует о вовлеченности анионного транспортера в импорт NH3/NH4+ эритроцитами.

Результаты теоретического расчета внутриклеточной концентрации NH4+ в условиях импорта NH3/NH4+ показали, что транспорт должен осуществляться против градиента и указали на необходимость существования некой сопрягающей силы для обеспечения транспорта.

Взаимосвязь изменения MCV и pHi

Помещение клеток в среду, содержащую NH3/NH4+ вызывает изменения pHi, что в свою очередь влияет на объем клетки, активируя транспортные механизмы, осуществляющие вход и выход растворенных веществ и воды. Сдвиги, вызываемые NH3/NH4+ исследуется достаточно долго, но механизмы, степень и кинетика этих изменений по-прежнему остаются недостаточно изученными.

Для исследования взаимосвязи изменения объема и pHi были проведены эксперименты на проточном цитофлуориметре Navios (Рисунок 25а-г, 26а-б). При воздействии на эритроциты максимальной концентрации NH3/NH4+ (140 мМ) наблюдалось увеличение объема клеток, при этом (Рисунок 25в, gate B), одновременно наблюдалось компенсаторное внутриклеточное закисление, обусловленное реакцией AE1-обменника на изменение градиента pH, с последующим лизисом по достижении клетками максимального объема (Рисунок 25а-б).

Исследование взаимосвязи изменения объема эритроцитов и pHi при аммонийной нагрузке и ингибировании AE1 (проточная цитометрия). Оригинальные данные эксперимента на проточном цитометре. Эритроциты (2х106 кл/мл), инкубированные с 5 мкМ BCECF-AM 30 мин, помещали в изотонический буфер (среда №1, pH 7.4). Проводили исследование в режиме TIME. Далее меняли буфер на изотоническую аммонийную среду (среда №2, pH 7.4) и продолжали исследование до гемолиза. Затем меняли буфер на изотоническую аммонийную среду (среда №2, pH 7.4) с добавлением 300 мкМ DIDS. Представлены данные прямого светорассеяния (FS INT LIN), являющиеся характеристикой объема, и соотношения каналов FL1/FL3 (RATIO FL1/FL3), характеризующее изменение pHi. (а) – точечная диаграмма распределения эритроцитов по объему (параметр FS) в условии аммонийной нагрузки (NH4Cl 140 мМ) и в условии аппликации ингибитора AE1 – DIDS (NH4Cl 140 мМ/DIDS 300 мкМ); (б) – гистограммы распределения клеток по объему; (в) – точечная диаграмма распределения эритроцитов по pHi (параметр RATIO) относительно времени действия эффекторов; (г) – гистограммы распределения клеток по pHi. Обработка данных кинетики (FCS Express, De Novo Software) по медианам.

При добавлении клеток в среду, содержащую 100 мМ NH4Cl (максимальная [NH4+], не вызывающая полного лизиса клеток), наблюдалось быстрое внутриклеточное защелачивание и последующее вторичное закисление pHi (Рисунок 26а-б). При добавлении в изотоническую аммонийную среду (среда №2, pH 7.4, 5 мМ [HCO3–]), скорость Vi возрастала по сравнению с реакцией в буфере без ионов гидрокарбоната. Это подтверждает данные о том, что HCO3–является лимитирующим фактором скорости гемолиза в аммонийной среде (рис. 20). В условии добавления в среду ионов гидрокарбоната закисление (как восстановление pHi) проходило значительно быстрее (Рисунок 26а-б). Рисунок 26. При аммонийной нагрузке изменение объема эритроцитов в большей, чем pHi степени, отражает импорт NH3/NH4+. (а) – динамика изменения pHi и объема эритроцитов в условиях аммонийной нагрузки (100 мМ NH4Cl), в присутствии 5 мМ HCO3- и при ингибировании AE1; (б) – кинетика изменения pHi и объема эритроцитов в условиях аммонийной нагрузки (100 мМ NH4Cl), в присутствии 5 мМ HCO3- и при ингибировании AE1. ( оригинальный эксперимент на проточном цитометре, обработка с помощью Cytometry List Mode Data Aquisition&Analysis Software)

Взаимосвязь изменения Vi и pHi в кинетике (оригинальные данные эксперимента на проточном цитометре). Показаны кривые, характеризующие динамику изменения объема и pH внутриклеточной среды эритроцитов в условии аммонийной нагрузки (с добавлением блокатора анионного транспортера AE1 – DIDS 300 мкM)

Увеличение объема продолжалось при уже достигнутом максимальном значении pHi (Рисунок 25, 26, 27). Объем клеток продолжал увеличиваться, хотя уже наблюдался процесс закисления внутриклеточной среды (Рисунок 25, 26б, 27).

Таким образом, было выявлено, что отсутствует прямая зависимость между изменениями pHi и MCV в условиях транспорта NH3/NH4+.

Обсуждение

В настоящее время в литературе нет общего мнения по поводу процессов, происходящих в эритроцитах человека при воздействии повышенных концентраций NH4+.

Согласно данным литературы, внесение клеток в среду, содержащую NH3/NH4+, должно вызывать изменение внутриклетчного pH, определяемое относительной проницаемостью плазматической мембраны к NH3 и NH4+ и наличию специфических pH-регулирующих систем, присутствующих в каждой клетке. Эти изменения во внутриклеточном pH и механизмы, их обуславливающие интенсивно исследовались и достаточно ясны (Boron, Weer, 1976; Thomas, 1984; Putnam, 1984), но относительно мало известно о том, как NH3/NH4+ и pHi изменения, которые они вызывают, влияют на контроль клеткой ее осмотического состояния. Известно, что осмотические изменения клеточного объема происходят при изменении внутриклеточного pH, в связи с тем, что регуляция этих двух функциональных процессов затрагивает функцию основных ионных транспортеров и каналов мембраны.

Как уже упоминалось, с некоторыми исключениями (Kikeri et al., 1989; Waisbren et al., 1994; Singh et al., 1995) большинство клеток проницаемы для NH3 и до некоторой степени NH4+. Ранние исследования связывали защелачивание, наблюдаемое в клетках растений и животных помещенных в соли аммония, с быстрым проникновением незаряженного NH3 (De Vries, 1871; Jacobs, 1922). Согласно упомянутым исследованиям, протонирование NH3 внутри клеток определяет увеличение pH, которое должно происходить пока NH3 не уравновесится по обе стороны мембраны. В течение этого процесса должен генерироваться NH4+, способный аккумулироваться внутриклеточно в миллимолярных концентрациях (Boron, De Weer, 1976; Fresser et al., 1991; Luo et al., 2006). Таким образом, было принято, что помещение клеток в среду, содержащую NH3/NH4+ должно приводить к увеличению внутриклеточного осмотического давления, вызывая опосредованный вход воды и набухание клетки. В случае, когда этому процессу не противодействуют механизмы объемной регуляции, осмотическое увеличение объема клеток может завершиться лизисом (Jacobs, Parpart, 1938).

Несмотря на вышеупомянутые классические представления о процессах, происходящих в клетках при воздействии NH3/NH4+, механизмы и пути согласно которым клетки, в том числе эритроциты, реагируют на изменение своего объема в изоосмотической среде недостаточно исследованы и понятны. Кроме того, после открытия специфичных аммонийных транспортеров, белков Amt/Mep/Rh-семейств, механизмы ответа некоторых клеток на воздействие NH3/NH4+ были значительно пересмотрены. Были предложены как различные модели событий, происходящих в клетке при экспозиции в NH4+-содержащую среду, так и механизмы транспорта NH3/NH4+ в эритроциты в таких условиях.

В качестве первичного эффекта обсуждается и закисление внутриклеточного pH, и защелачивание. Например, Caner с соавторами показали, что RhAG транспортирует не только ионную форму, но и незаряженный аммиак, при этом, транспорт NH4+ электрогенный и маскирует транспорт нейтральной формы (Caner et al., 2015). Результаты этих исследований на ооцитах, экспрессирующих эритроцитарный RhAG, показали первичное понижение pHi при экспозиции клеток в среду, содержащую 5 мМ NH4Cl. По-видимому, отсутствие AE1 в использованных ооцитах привело к результатам, противоположным как нашим данным (Рисунок 25-27), так и данным некоторых других групп. Blanco с соавторами, используя в качестве модели N1E-115 нейробластому мышей, проницаемую для NH3, показали первичное повышение (с последующим компенсаторным закислением) внутриклеточного pH при внесении клеток в среду, содержащую от 0.5 до 20 мМ NH4Cl (Blanco et al., 2013). В тоже время Ripoche с соавторами, используя в качестве модели эритроциты Rh-/Rh+/Rhmod/Rhnull человека и мышей, показали, что RhAG ответственен за транспорт аммония/метиламмония/аммиака эритроцитами человека (Ripoche et al., 2004). В случае нокаутных мышей (Rhnull), не экспрессирующих эритроцитарный RhAG или экспрессирующих его в малом количестве, защелачивание происходило гораздо медленнее, а вторичное закисление не наблюдалось. В опытах на эритроцитах человека Swietach с соавторами показали критическое повышение pHi с последующим компенсаторным закислением внутриклеточной среды при помещении эритроцитов в изоосмотическую аммонийную среду с 30 мМ NH4Cl, что согласуется с нашими данными (Рисунок 25, 27) (Swietach et al., 2010). В отличие от Swietach с соавторами, в среде № 3, содержащей 5 мМ HCO3-, мы наблюдали ускоренное вторичное закисление pHi, по сравнению с аммонийной средой № 2, содержащей HEPES, что свидетельствует об активном вовлечении в процесс анионного транспортера AE1, использующего HCO3- как один из субстратов (Рисунок 26).

Полученные результаты указывают на то, что сдвиги pHi в кислую или щелочную сторону компенсируются в течение нескольких минут с помощью AE1. В эукариотических клетках, основные потоки кислот и щелочей осуществляются отдельными мембранными белками-транспортерами, такими как Na+/H+-обменник (H+ выход) и Cl-/HCO3- - обменник (эквивалентный вход H+). Согласно данным Swietach с соавторами ингибитор Na+/H+-обменника, диметил амилорид, не влиял на восстановление pHi, в то время как DIDS полностью блокировал выход H+ в эритроцитах (Swietach et al., 2010). Соответственно, можно заключить, что AE1 осуществляет ключевую роль в регуляции pHi в условиях транспорта NH3/NH4+.

Исследования кинетики начального увеличения объема эритроцитов в аммонийной среде в зависимости от pH показали, что при 10С процесс представляет собой простую диффузию NH3, в то время как при 25-37С, зависимость характеризуется наличием pH-оптимума, что говорит об обусловленности процесса функционированием белков-транспортеров (Рисунок 19). Эти результаты подкрепляются данными температурной зависимости транспорта, которые указали на вовлеченность конформационного изменения белков (Рисунок 18). На данный момент не определен ингибитор RhAG-транспортера, однако влияние ингибитора AE1 косвенно подтверждает обусловленность процесса функционированием белков-транспортеров (Рисунок 11б-в, 13, 21, 22, 26, 27). Таким образом, представленные экспериментальные данные (Рисунок 17-22) свидетельствуют о том, что вход NH4+/NH3 обусловлен в большей степени транспортерами белковой природы, чем простой диффузией NH3 сквозь мембрану эритроцита (Chernyshev et al., 2008).

На основании проведенных исследований кинетики изменения скорости начального увеличения объема эритроцитов дополненных результатами экспериментов по импорту NH4+/NH3, которые показали, что уже через минуту после внесения 100/200/800 мкМ NH4Cl, концентрация NH4Cl в супернатанте эритроцитов уменьшается на 79±5% при 100 мкМ, 47±5% при 200 мкМ, 59±7% при 800 мкМ, мы заключили, что в эритроцитах есть система транспорта NH3/NH4+.

Кроме того, на основании результатов экспериментов по импорту NH4+/NH3 была рассчитана динамика изменения внутриклеточной концентрации NH4+ внутри эритроцита, которая показала, что при воздействии на эритроциты (HCT 10%) NH4Cl в концентрации 800 мкМ внутриклеточная концентрация NH4+ может достигать 4.32±0.12 мМ (Рисунок 13), соответственно, транспорт аммония/аммиака в клетку, вероятно, происходит против градиента концентрации. Для обеспечения такого транспорта RhAG транспортеру необходимо использовать некую сопрягающую силу.

В наших экспериментах, ингибирование AE1 вызывало достоверное сокращение импорта аммония эритроцитами (Рисунок 12б-в), снижение максимального достигаемого объема эритроцитов (Рисунок 21, 22), отсутствие компенсаторного закисления внутриклеточной среды и полное предотвращение гемолиза в изотонической аммонийной среде (Рисунок 21, 22, 24-27). Кроме того, скорость начального увеличения объема в изотонической аммонийной среде зависела s-образно от концентрации субстрата AE1 – HCO3-. Важно отметить, что Vi увеличивалась в практически 50 раз (48.6±3.4) при наличии в среде физиологической концентрации 25 мМ HCO3- (Рисунок 20). Полученные результаты указывают на существование, помимо структурной взаимосвязи, также функциональной взаимосвязи между RhAG и AE1, регулирующей импорт аммиака/аммония в эритроциты. Исследования кинетики транспорта NH4+/NH3 дополняют биохимические данные коиммунопреципитации Bruce с соавторами, которые показали, что AE1 и RhAG транспортеры составляют единый структурный комплекс эритроцитарной мембраны (Bruce et al., 2002, 2003).

Соответственно, мы пришли к выводу, что AE1 транспортер, по-видимому, опосредует сопрягающую силу, необходимую RhAG для захвата NH3/NH4+ против градиента концентрации.

Предложенная схема сопряжения транспортеров RhAG и AE1 (Рисунок 30) объясняет возможность закачивания аммония/аммиака внутрь клетки против его градиента и накопления (депонирования) его внутри клетки В поддержку этой теории выступают данные о том, что в то время как концентрация аммония/аммиака в плазме составляет 0.1 - 0.2 мМ, в эритроците концентрация в 3 раза больше (Westhoff, 2007) и то, что все методики для измерения концентрации NH3/NH4+ в жидкостях (плазме) категорически запрещают использовать пробы с малейшими признаками даже частичного гемолиза. В связи с тем, что исходные данные по концентрации NH3/NH4+ в эритроцитах получили косвенным методом в 1966 году (Conn, 1966), а дальше, в основном, цитировали результаты тех исследований, необходимо дальнейшее совершенствование метода определения концентрации NH3/NH4+ в эритроцитах и разработка методов прямого определения внутриклеточной концентрации NH3/NH4+.