Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Гетерохронии в развитии функциональных областей коры млекопитающих 8
2.1.1. Гетерохрония и фрагментация органов в теории системогенеза 8
2.1.2. Гетерохронии в развитии функциональных областей коры : 10
2.1.2.1. Гетерохронии в развитии областей коры: электрофизиологические данные 11
2.1.2.2. Гетерохронии в развитии областей коры: данные морфологических исследований 20
2.2. Избирательная экспрессия генов в коре 36
2.3. Роль внешних и внутренних факторов в развитии областей коры 50
3. Методика :..:62 CLASS
4. Результаты исследований 73 CLASS
4.1. Места экспрессии трансгена 6А-99 73
4.2. Сроки и возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре ; 82
4.2.1. Определение сроков экспрессии трансгена 6А-99 в
первичной соматосенсорной коре 83
4.2.2. Возрастная динамика послойного распределения экспрессии трансгена 6А-99 в первичной соматосенсорной коре 85
4.2.3. Возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в
проекционных зонах соматосенсорной коры 92
4.3. Исследование роли-внешних факторов в становлении областеспецифичной-экспрессии трансгена 6А-99 95'
4.3.1. Влияние частичной деафферентации соматосенсорной коры вследствие удаления вибриссной подушки на экспрессию трансгена 6А-99 96
4.3.2. Влияние деафферентации соматосенсорной коры, вызванной иссечением окологлазничного нерва, на экспрессию трансгена 6А-99 98
4.3.3. Экспрессия трансгена 6А-99 после унилатеральной
аспирации соматосенсорной коры 103
CLASS 5. Обсуждение результатов 10 CLASS 7
5.1. Региональная экспрессия трансгена 6А-99 в коре 107
5.2. Возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре 111
5.3. Экспрессия трансгена 6А-99 и гетерохронная динамика развития отделов соматосенсорной коры 116
5.4. Роль внешних факторов в становлении региональной экспрессии трансгена 6А-99: 123
5.4.1. Роль афферентации от вибрисс на развитие первичной соматосенсорной коры и экспрессию трансгена 6А-99 123
5.4.2. Влияние афферентации из противоположного полушария на экспрессию трансгена 6А-99 128
5.4.3. Генетическая детерминация системных гетерохронии в развитии коры головного мозга 131
Выводы 133
Список литературы 135
- Гетерохронии в развитии функциональных областей коры млекопитающих
- Гетерохронии в развитии функциональных областей коры
- Сроки и возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре
- Возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре
Введение к работе
1.1. Актуальность исследования
В современной физиологии центральной нервной системы остро стоит вопрос о механизмах функционального созревания и регионализации коры больших полушарий (Krubitzer, Huffman, 2000; Pallas, 2001; O'Leary, Nakagawa, 2002; Krubitzer, Kahn, 2003; Krubitzer, Kaas, 2005; Sur, Rubenstein, 2005; Chambers, Fishell, 2006; Rash, Grove, 2006; Inan, Crair, 2007; O'Leary et al., 2007).
В настоящее время, благодаря пристальному вниманию молекулярной нейробиологии к проблеме формирования функциональных областей коры, были выявлены сигнальные молекулы (Ragsdale, Grove, 2001) и транскрипционные факторы (Rubenstein, Rakic, 1999; O'Leary, Nakagawa, 2002), контролирующие процесс регионализации коры, а также молекулы, регулирующие упорядоченный областеспецифичный рост афферентных волокон (Yu, Bargmann, 2001).
Однако, несмотря на существенные успехи в этой области, до сих пор проблема молекулярных основ регионализации коры решалась преимущественно на структурно-морфологическом уровне, в отрыве от выполняемых корой функций в обеспечении сложного приспособительного поведения. Функциональный подход к пониманию развития и эволюции коры в настоящее время практикуется лишь в небольшом числе исследований (Krubitzer, Huffman, 2000; Krubitzer, Kahn, 2003; Krubitzer, Kaas, 2005; Catania, Henry, 2006).
Вместе с этим, данные накопленные в рамках теории системогенеза, не позволяют рассматривать развитие структур организма только в морфологическом ключе, поскольку этот процесс подчиняется не просто закономерностям органо- и гистогенеза, а осуществляется в соответствии с созреванием целостных функций - функциональных систем организма (Анохин, 1948, 1968).
Согласно теории системогенеза, функциональные системы, развиваются путем избирательного и неравномерного созревания их отдельных элементов (принцип внутрисистемной гетерохронии). Таким образом, на каждом этапе онтогенеза отдельный орган или структура развиваются не как единое морфологическое целое, а как функционально фрагментированное образование (принцип фрагментации органа) (Анохин^ 1968). Кора головного мозга в данном случае не является исключением и гетерохронии в ее развитии были обнаружены в электрофизиологических исследованиях функционального становления»сенсорных областей коры (см; обзоры: Волохов, 1968, 1979; Максимова, 1979).
На современном этапе исследований механизмов регионализации коры остро стоит вопрос о соотношении вклада генетических и внешних факторов в разделение однородного зачатка коры на функциональные регионы в ходе развития (Krubitzer, Huffman, 2000; Pallas, 2001; O'Leary, Nakagawa, 2002; Vanderhaeghen, Polleux, 2004; Hunt et al., 2006) и эволюции головного мозга (Krubitzer, Kahn, 2003; Krubitzer, Kaas, 2005; Catania, Henry, 2006). В рамках теории системогенеза ответ на этот важный вопрос позволит понять, являются ли гетерохронии в развитии коры её внутренним свойством, сформировавшимся в ходе эволюции, или они являются следствием гетерохронного развития периферических органов.
Сам П.К.Анохин считал, что «гетерохрония представляет собой специальную закономерность, состоящую в неравномерном развертывании наследственной информации» (Анохин, 1968). Тем не менее, работ, напрямую посвященных исследованиям генетических процессов, лежащих в основе гетерохронного развития тех или иных образований, практически не проводилось (см. обзоры: Кокина, 1980; Ата-Мурадова, Угрюмов, 1983) и объективных доказательств тому, что наблюдаемые в развитии морфо-функциональные гетерохронии обусловлены избирательной и гетерохронной экспрессией генов, получено не было.
Для выяснения роли внутренних и внешних факторов в развитии областей коры принципиальным стал вопрос о существовании генов,
избирательно экспрессирующихся в различных областях развивающейся» коры (Levitt et al., 1997; Rubenstein, Rakic, 1999). Однако поиски таких генов до сих пор не принесли заметных успехов (O'Leary, Nakagawa, 2002). Вместе с этим, исследования работы генов, избирательно экспрессирующихся в одной или нескольких функционально специализированных областях коры, могут стать инструментом для решения вопросов, касающиеся генетических механизмов гетерохронного развития мозга.
В настоящей работе для исследования этого вопроса использовалась экспрессия (3-галактозидазного трансгенного маркера (LacZ)' в мозге мышей линии 6А-99, полученных методом gene trapping - «вылавливания генов» (Salminen et al., 1998) в Институте биофизической химии им. М. Планка (Гёттинген, Германия). Предварительные данные показали, что у данной линии мышей экспрессия LacZ имеет пространственно ограниченную локализацию в коре головного мозга, по всей видимости, совпадающей с границами соматосенсорной коры. В случае подтверждения этих предположений, трансгенная линия мышей 6А-99 может оказаться удобной моделью для1 изучения механизмов функциональной регионализации неокортекса и обнаружения гетерохронии на уровне регуляции активности генов в развивающемся мозге.
1.2. Цель и задачи исследования
Перед работой была поставлена цель:
Исследовать системные закономерности и роль внешних и эндогенных факторов в развитии экспрессии трансгена 6А-99 в ходе онтогенеза коры головного мозга мышей.
Конкретными задачами работы было:
1. Определить локализацию экспрессии трансгена 6А-99 в головном мозге и установить совпадают ли границы его экспрессии с границами какой-либо функциональной области коры.
2. Исследовать сроки и возрастную динамику экспрессии трансгена 6А-99 в
* коре головного мозга.
Установить, подчиняется ли экспрессия трансгена 6А-99 в коре головного мозга принципу системной гетерохронии.
Установить, зависит ли экспрессия трансгена 6А-99 от экстракортикальных воздействий: афферентации с периферии и противоположного полушария.
1.3. Научная новизна
Впервые найден трансгенный маркер II-V слоев первичной и вторичной соматосенсорнои коры. Обнаруженная избирательность экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорнои коре мышей подтверждает предположение о молекулярной специфичности функциональных областей коры.
Впервые установлено, что выявляемая по экспрессии 6А-99 молекулярная специфичность соматосенсорнои коры появляется у мышей уже в первые дни после рождения, одновременно с формированием ее связей с периферией и противоположным полушарием.
С помощью операционных вмешательств доказано, что формирование молекулярной специфичности соматосенсорнои коры, выявляемое по экспрессии трансгена 6А-99, происходит независимо от влияний с периферии и гомологичной области противоположного полушария.
Впервые показано, что молекулярная специфичность соматосенсорнои коры по избирательной экспрессии в ней трансгена 6А-99 существует только во время ее развития и не обнаруживается у взрослых животных.
Впервые обнаружена последовательная гетерохрония в экспрессии
трансгена 6А-99 в различных проекционных зонах первичной
соматосенсорнои коры, соответствующая гетерохронной
последовательности функционального развития этой области коры головного мозга у мышей.
Впервые обнаружена гетерохрония в появлении экспрессии трансгена 6А-99 в первичных и вторичных сенсорных областях коры: в первичной соматосенсорнои коре трансген начинал экспрессироваться раньше, чем в эволюционно более молодой вторичной соматосенсорнои коре.
Впервые показано, что наблюдаемые гетерохронии в экспрессии трансгена 6А-99 обусловлены внутренними факторами развития коры головного мозга, независимыми от внешних влияний.
1.4. Научно-практическое значение работы
Результаты данной работы подтверждают существование молекулярной специфичности областей коры головного мозга и расширяют представления о роли внешних и эндогенных факторов в ее развитии.
Данные, полученные в работе, вносят вклад в понимание генетических механизмов гетерохронного созревания соматосенсорнои коры в процессе онтогенеза.
Трансгенная линия мышей 6А-99 в дальнейшем может быть \
использована как модель для изучения механизмов гетерохронного развития соматосенсорнои коры и процессов становления региональной специфичности неокортекса в экспериментах с депривационными воздействиями, трансплантацией и с использованием мутантных животных.
Последующее определение структуры последовательности ДНК, меченной LacZ, у мышей линии 6А-99 позволит в дальнейшем получать нокаутных животных с избирательным выключением любого из известных генов в соматосенсорнои коре.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Гетерохронии в развитии функциональных областей коры млекопитающих
Феноменология гетерохронного созревания органов и тканей была достаточно подробно описана в трудах биологов-эволюционистов. Особенно глубоко этот вопрос был разработан в трудах А.Н.Северцова и его последователей (Северцов, 1939; Матвеев, 1940; Емельянов, 1941). В отличие от гетерохронии, описанных А.Н.Северцовым и его учениками, под которыми подразумевались сдвигания во времени закладки или изменения темпов развития какого-либо органа в сравнении с закладкой его у предков (Северцов, 1939), в теории системогенеза рассматриваются гетерохронии в развитии не отдельных органов, а целостных функций, или функциональных систем. «Гетерохрония в развитии органов есть только наиболее бросающийся в глаза частный признак гетерохронного развития тех функциональных систем, которые приспосабливают животное к внешним условиям на всем протяжении его жизни - от рождения до старости» (Анохин, 1948).
Другой принципиальной особенностью гетерохронии, по П.К.Анохину, является феномен фрагментации органа. Функциональные системы, согласно теории системогенеза, развиваются путем избирательного и неравномерного созревания их отдельных элементов, а значит, на каждом этапе онтогенеза отдельный орган или структура созревают не как единое морфологическое целое, а как функционально фрагментированное образование. Таким образом, в ходе онтогенеза в гетерохронное развитие вовлечены не только целые органы или структуры, но и их отдельные фрагменты (Анохин, 1948).
Первые определения системным гетерохрониям были даны П.К.Анохиным в филогенетическом значении. В частности, под внутрисистемной гетерохронией понимался «процесс сдвигания во времени закладки и изменения темпов развития отдельных фрагментов функциональной системы по сравнению с закладкой этих же фрагментов и для этой же функциональной системы у предков» (Анохин, 1948). Главным фактором в возникновении системных гетерохронии П.К.Анохин считал внешние факторы, постоянно действующие на животных в ряду поколений в течение длительного времени. Системные гетерохронии, таким образом являются результатом действия естественного отбора, направленного на «подгонку» онтогенеза данного вида животного к условиям окружающей среды, обеспечивая ему выживание (Анохин, 1949а).
В последующие годы был накоплен большой фактический материал о системных гетерохрониях в ходе пре- и постнатального онтогенеза, на примере разных видов животных (Голубева, 1949; Никишин, 1949; Милягин, 1951; Ата-Мурадова, Чернышевская, 1966 и др.) и человеке (Шулейкина, 1953; Голубева, Шулейкина, 1966 и др.). Системные гетерохронии были обнаружены не только на структурно-функциональном (Шулейкина, 1953; Голубева, 1961 и др.), но и на клеточном уровне (Ата-Мурадова, Чернышевская, 1966). Все это позволило П.К.Анохину в 1968 году дать более завершенную формулировку принципам гетерохронии и функциональной фрагментации органа. Всё многообразие гетерохронных процессов в ходе онтогенеза было разделено П.К.Анохиным (1968) на две основные категории: внутрисистемную, представляющую собой «неодновременную закладку и различные темпы созревания отдельных фрагментов одной и той же функциональной системы», и межсистемную гетерохронию, под которой понимались гетерохронные процессы развития тех «структурных образований, которые необходимы организму в различные периоды его постнатального онтогенеза» (Анохин, 1968).
Принцип системной гетерохронии в дальнейшем активно развивался. в школе П.К.Анохина на клеточном уровне (см. обзор: Шулейкина, Хаютин, 1989). Также он применялся в исследованиях сенсорного обеспечения ранних форм поведения у птиц (Хаютин, Дмитриева, 1980) и млекопитающих (Любимова, 1985; Любимова и др., 1999), благодаря чему был обнаружен феномен смены типов ведущей и пусковой афферентаций в ходе развития ранних функциональных систем.
Таким образом, работы, выполненные в рамках теории системогенеза, разработанной ПК.Анохиным, в настоящий момент позволяют считать гетерохронии универсальным механизмом развития организма на всех уровнях его организации.
Кора головного мозга млекопитающих имеет дискретную организацию и включает в себя около 50 регионов у человека (Brodmann, 1909) и около 20-функционально специализированных областей у мыши (Ragsdale, Grove, 2001), отличающихся друг от друга по функциональным свойствам, клеточным составом, цито-, хемо- и миело-архитектоникой, а также входящими и исходящими проекциями. Разные области коры при этом четко разграничены между собой. Благодаря такому строению коры головного мозга, в ходе ее развития можно наглядно наблюдать функциональную фрагментацию однородного зачатка коры на специализированные регионы, а также косвенные проявления меж- и внутрисистемных гетерохронии в виде неодновременных закладок и различных темпов морфологического и функционального созревания различных функционально специализированных регионов. Рассмотрению экспериментальных данных о гетерохрониях в развитии функциональных областей коры посвящена настоящая часть литературного обзора.
Гетерохронии в развитии функциональных областей коры
Основные данные о развитии электрической активности разных проекционных областей коры были получены в 60-70-х годах XX века-. Наблюдения были выполнены на кошках, собаках и кроликах методами регистрации ЭЭГ, вызванных потенциалов (ВП) и активности отдельных нейронов в ответ на раздражение периферии специфической модальности. Данные о появлении и созревании электрической активности коры- были получены, главным образом, для соматосенсорной, слуховой и зрительной областей коры. Сведения, полученные в этих экспериментах позволяют судить о степени функциональной зрелости того или иного региона коры головного мозга.
Формирование в онтогенезе вызванных соматосенсорных ответов в коре на болевые и тактильные стимулы или раздражение нервов изучалось у кошек (Marty, 1962; Баклаваджян, Адамян, 1963; Дзидзишвили, Джавришвили, 1961; Раевский, 1970; Черников, 1976; Максимова, 1979), кроликов (Marty, 1962; Ата-Мурадова, 1963; Шимко 1970) и крыс (McCandlish et al., 1993). В этих работах было показано раннее функциональное созревание соматосенсорной коры: первичные ответы соматосенсорной коры кошек, кроликов и крыс на адекватные стимулы начинают регистрироваться уже на 1-е сутки после рождения, и даже в пренатальном периоде (у кошки) в ответ на раздражение седалищного, тройничного, лучевого и локтевого нервов (Marty, 1962; Максимова, 1979).
У новорожденных животных ВП в соматосенсорной коре в ответ на адекватное и электрическое раздражение нервов представляют собой поверхностно-негативные колебания без начальной позитивности, имеющейся в вызванных ответах взрослых животных (Marty, 1962; Ата-Мурадова, 1963; Баклаваджян, Адамян, 1963; Дзидзишвили, Джавришвили, 1961; Шимко 1970). Позитивная волна, предшествующая негативному колебанию, появляется у кролика на 5-10-е сутки (Marty, 1962; Ата Мурадова, 1963; Шимко 1970) и на 3-9-е сутки у кошки (Баклаваджян, Адамян, 1963; Дзидзишвили, Джавришвили, 1961). С возрастом снижаются латентные периоды ответов, а амплитуда их увеличивается, и в течение последующих 2-3-х недель все параметры ВП достигают величин, сходных с таковыми взрослого животного.
Появление вызванных ответов в слуховой коре происходит позже, чем в соматосенсорной области: ВП на одиночный акустический стимул (щелчок) в форме поверхностного негативного колебания низкой амплитуды в слуховой коре впервые регистрируется у кошки между 5-10-ми постнатальными сутками (Rose et al., 1957; Ellingson-, Wilcott, 1960; Marty, Thomas, 1963), у собаки на 9-10-е сутки (Клявина, 1966; Myslivecek, 1967) и на 14-е сутки у крысы (Мысливечек, 1965). У кошки позитивная волна появляется через 1-2 дня от момента появления первичного ответа. Типичная форма вызванного слухового ответа у кошек и крыс формируется приблизительно к концу 3-й нед постнатального развития.
Непосредственное электрическое раздражение кохлеарного нерва у котенка, как и в случае раздражения соместетических нервов, выявило более ранние сроки появления ВП в слуховой коре: в виде поверхностно-негативных колебаний они обнаруживаются уже на 2-е сутки, а на 5-е сутки ВП приобретают позитивно-негативную конфигурацию (Marty, Thomas, 1963). У крысы электрическая стимуляция внутреннего коленчатого тела также позволяет регистрировать ВП в слуховой коре в более ранние сроки — уже в первые часы после рождения (Мысливечек, 1965, Myslivecek, Hassmanova, 1967). Данные о более раннем появлении ВП в слуховой коре на раздражение афферентных нервов и ядер таламуса, полученные на кошках и крысах, свидетельствуют об их опережающем по отношению к слуховым рецепторам развитии.
Ответы в зрительной коре появляются позже, чем в соматосенсорной и слуховой: ВП на световой сигнал (вспышку света) в виде медленного поверхностно-негативного колебания возникает у кролика на 5-8-е сутки жизни (Волохов, Шилягина, 1969; Писарева, 1971; Фарбер, 1963; 1969), у кошки на 2-6-е сутки (Marty, 1962; Marty, Scherrer, 1964; Scherrer et al., 1970) и у собаки на 2-3-е сутки (Myslivecek, 1967, Myslivecek, 1970). В течение следующих нескольких дней у этих животных появляется позитивный компонент вызванного ответа, предшествующий негативному. Постепенное укорочение временных и увеличение амплитудных параметров, ВП происходит в течение последующих 3-х нед, и к 22-25-м сут у кошек и кроликов ВП по всем показателям становится идентичным таковому взрослых животных.
Электрическое раздражение оптического нерва (Hunt, Goldring, 1951; Marty, 1962) или специфических ядер таламуса (Фарбер, 1969) также вызывает более ранний ответ в зрительной коре: у кролика и кошки ВП при этих способах стимуляции были зарегистрированы сразу после рождения. Максимовой (1979) первые ВП в затылочной коре на раздражение зрительного нерва были зарегистрированы еще раньше - у плодов кошки примерно на 5-й нед внутриутробного развития. Таким образом, первичное возникновение кортикального ВП на световое раздражение, также как и в случае со слуховой корой, зависит от зрелости периферии. Известно, что у кролика формирование наружного сегмента фоторецепторных элементов сетчатки и образование синапсов биполярами на ганглиозных клетках происходит лишь на 5-6-е сутки постнатального развития (Мс Ardle et al., 1977). В этот же период впервые удается зарегистрировать разряды ганглиозных клеток сетчатки при действии света (Masland, 1977) и ВП в коре (Волохов, Шилягина, 1965; Писарева, 1971; Фарбер, 1963; 1969).
Таким образом, сравнение сроков появления ВП коры головного мозга на болевые, тактильные, слуховые и зрительные афферентные раздражения у кроликов, котят, крысят и щенков показывает, что первыми начинают регистрироваться соматосенсорные вызванные ответы, затем слуховые и в последнюю очередь - зрительные.
Сроки и возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре
Данные относительно сроков экспрессии трансгена 6А-99, полученные на препаратах целой коры головного мозга совпадают с данными полученными на срезах (см. ранее) и позволяют проследить возрастную динамику экспрессии трансгена 6А-99 в проекционных зонах первичной соматосенсорной коры.
В препаратах мозга новорожденных мышат (0 сутки) и в возрасте 1 суток, окрашенных in toto, экспрессия 6А-99 выявлена не была (рис.16). Впервые заметную экспрессию трансгена в коре головного мозга фиксировали на 3-й сутки после рождения. В этом возрасте область, экспрессирующая трансген, повторяла очертания первичной соматосенсорной коры и состояла из двух сходящихся полос, верхняя из которых соответствовала зонам представительств нижней челюсти и передних лап. В этой части соматосенсорной коры экспрессия обладала низкой интенсивностью, особенно в представительстве передних лап. Нижняя широкая полоса представляла собой будущие заднемедиальное и переднелатеральное бочонковые подполя, являющиеся представительствами вибрисс и передней части мордочки соответственно. Экспрессия в этой части соматосенсорной коры была интенсивней, чем в представительстве челюстей (рис.16). Наибольшая плотность экспрессии 6А-99 наблюдалась в дорсальной части заднемедиального бочонкового подполя и затухала по градиенту в назальном и темпорально-вентральном направлениях. У животных в возрасте 3-х постнатальных суток отсутствовала экспрессия трансгена во вторичной соматосенсорной коре. Это было видно как на препаратах целой коры, так и на фронтальных блоках головного мозга, где трансген экспрессировался только в слое V коры. Экспрессия при- этом носила менее интенсивный характер, чем в последующих возрастах.
На 5-е сутки после рождения границы неокортикальной экспрессии трансгена 6А-99 приобретали более четкие очертания, особенно в назальной части, где экспрессия становилась наиболее интенсивной. В области заднемедиального бочонкового подполя экспрессия LacZ была менее интенсивной, такой же, как на 3-й сутки. Задняя граница этого подполя не была окончательно оформлена. В зоне представительства нижней челюсти трансген интенсивно экспрессировался, однако граница между этой частью первичной соматосенсорной коры и переднемедиальным бочонковым подполем не была выражена. На 5-е сутки появлялась экспрессия в зоне представительств задних лап, а в представительстве передних лап наблюдалась слабая трансгенная экспрессия, более сильная, однако, чем в соседнем представительстве задних лап и чем на 3-е сутки после рождения; Так же выраженная, с чёткими границами экспрессия трансгена появлялась во вторичной соматосенсорной коре (рис. 16).
На 7-е постнатальные сутки экспрессия 6А-99 в коре была наиболее выраженной. Интенсивно прокрашивались зоны представительств нижней челюсти, передних и задних лап. Тем не менее, экспрессия в представительстве задних лап была слабее, чем в таковом передних. Менее интенсивная окраска в темпоральной части заднемедиального бочонкового подполя сохранялась, однако задняя граница представительств вибрисс становилась более четкой, просматривались полосы, соответствующие рядам бочонков. Представительство нижней челюсти отграничивалось от переднемедиального подполя, представительства передних и задних лап принимали характерный обособленный характер (рис. 16).
Тотальные препараты коры мышей старше 7-х суток получить невозможно из-за недостаточной тканевой проницаемости X-gal. В связи с этим оценку границ экспрессии трансгена 6А-99 у животных старших возрастов производили на реконструкциях серийных тангенциальных срезов. Границы экспрессии LacZ у животных в возрасте 14-ти постнатальных суток были аналогичными тому, что наблюдалось у 7-суточных мышат, однако, в отличие от них, одинаково интенсивная экспрессия трансгена 6А-99 была отмечена во всех представительствах (рис.7, а, б).
Таким образом, изучение возрастной динамики экспрессии трансгена 6А-99 на препаратах целой коры, головного мозга выявило разные сроки ее появления в первичной и вторичной областях соматосенсорной коры: экспрессия трансгена 6А-99 в первичной соматосенсорной коре появлялась раньше, чем во вторичной. Гетерохронное появление экспрессии трансгена 6А-99 было показано также и в отношении различных проекционных зон первичной соматосенсорной коры: LacZ в представительствах вибрисс, передней части мордочки и нижней челюсти начинал экспрессироваться раньше, чем в проекционной зоне передних лап. В представительстве задних лап экспрессия трансгена 6А-99 появлялась позже, чем в других проекционных зонах первичной соматосенсорной коры.
Возрастная динамика экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре
Следующимшринципиальным вопросом было установить, является ли трансген 6А-99 постоянным молекулярным маркером соматосенсорной коры, или он экспрессируется только во время ее развития. Важным также было выяснить, как рано появляется областеспецифичная экспрессия трансгена 6А-99, появляются ли «молекулярные» границы соматосенсорной-коры в вентрикулярной зоне коры вне зависимости от внешних факторов до начала стратификации коры и врастания таламических афферентов, или она приурочена к более поздним срокам, когда идет становление связей соматосенсорной коры с другими областями и подкорковыми структурами и может быть подвержена периферическим влияниям. С этой целью мы исследовали возрастную динамику экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре.
Отправной точкой для определения сроков начала экспрессии трансгена 6А-99 в коре были выбраны 16-е эмбриональные сутки. В этом возрасте у плодов мыши идет генерация нейронов слоя V коры (см.: Максимова, 1990), в которых наблюдается интенсивная экспрессия трансгена 6А-99, и таламокортикальные волокна начинают радиально врастать внутрь коры (Auladell et al., 2000). Исходя из этого, можно было предположить начало экспрессии трансгена 6А-99 в коре именно в этом возрасте. Однако, исследования показали отсутствие кортикальной экспрессии трансгена в этом возрасте, а также на 18-е эмбриональные и 1-е постнатальные сутки.
Первые клетки в коре, экспрессирующие трансген 6А-99, появлялись только на 2-е сутки после рождения в слое V. В этом возрасте цитоархитектонические границы соматосенсорной коры еще не оформлены, однако, они выявляются методиками, выявляющими распределение таламических окончаний: пять рядов бочонков, соответствующих рядам вибрисс, становятся различимыми на тангенциальных срезах, импрегнированных серебром (Waite, 1977) или иммуногистохимией на серотонин (Gittton et al., 1999а). Границы соматосенсорной коры можно выявить и окраской на Л/тенасцин, адгезивную молекулу экстраклеточного матрикса, участвующую в процессах врастания и ветвления волокон1 (Steindler et al., 1989). Гистохимией на ацетилхолинэстеразу и антероградным транспортом Dil бочонко-подобный паттерн и границы соматосенсорной коры можно обнаружить и на более ранних сроках — на 1-е сутки после рождения (Schlaggar, O Leary, 1994).
Выраженная экспрессия 6А-99 в соматосенсорной коре появлялась только на 3-й сутки после рождения: В этом возрасте соматосенсорная кора имеет дифференцированные слои I, V и VI; а слой IV, в котором в будущем будут располагаться бочонки и по которому соматосенсорная кора цитоархитектонически заметно отличается от остальных регионов,- еще не выделился из корковой пластинки (Rice, Van Der Loos, 1977). На 3-е сутки после рождения мышей специфические афференты из таламуса активно ветвятся в слоях коры V-VI (Auladell et al., 2000). В этом же возрасте наблюдалось появление цитоархитектонических границ соматосенсорной коры, определяемое на тангенциальных срезах по более плотному скоплению клеток в области будущих бочонковых полей. Таким образом, начало интенсивной экспрессии трансгена 6А-99 в коре отстает от появления границ соматосенсорной коры, выявляемых таламическими волокнами, но совпадает со сроками появления её цитоархитектонических границ. Это может означать, что активация транскрипции трансгена 6А-99 осуществляется не факторами, ответственными за становление границ данной области коры, а скорее, сигналами, действующими внутри уже сформированных границ соматосенсорной коры. Значительное запаздывание появления экспрессии трансгена 6А-99 в коре в сравнении со-сроками врастания таламических афферентов в кору косвенно может свидетельствовать о независимости её от подкорковых влияний.
На 4-5-е сутки после рождения» у крыс начинается внедрение таламических волокон в корковую пластинку и кластеризация их на отдельные бочонки (Wise, Jones, 1978). В этом же возрасте выделяется слой-IV и начинает стратифицироваться слой III коры, отростки клеток которых обеспечивают связи первичных и вторичных проекционных зон (Дуринян, Рубин, 1971), а бочонки у мышей впервые становятся различимы как цитоархитектонические единицы (Шее, Van.Der Loos, 1977); Именно в эти сроки мы наблюдали заметное усиление экспрессии трансгена 6А-99! в соматосенсорной коре: экспрессия появлялась в только что выделившемся слое IV первичной соматосенсорной коры и во вторичной коре. Границы трансгенной экспрессии становились яркими и чёткими к 7-м суткам после рождения, т. е. к возрасту, когда бочонковые поля становятся полностью сформированными (Rice, Van Der Loos, 1977). На 7-е сутки на морфологически окрашенных срезах становились выраженными слои П-Ш коры, в это же время в них появлялась экспрессия трансгена 6А-99. Таким-образом, в возрасте 7-х суток после рождения экспрессия наблюдалась-во-всех слоях соматосенсорной коры за исключением слоев I и VI. Совпадение динамики появления экспрессии трансгена 6А-99 в соматосенсорной коре с последовательностью выделения слоев коры могло свидетельствовать о связи этой экспрессии с процессами миграции нейронов. Действительно экспрессия LacZ в слоях II-IV появлялась вскоре после того, как эти слои выделялись из корковой пластинки, тем не менее, клетки слоя V коры
