Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 9
2. Основная часть 18
2.1 Обзор литературы 18
2.1.1 Трансформация экосистем в условиях антропогенной нагрузки 18
2.1.1.1 Современное экологическое состояние речных водных ресурсов (на примере водоемов Днепропетровской области) 18
2.1.1.2 Современное экологическое состояние морских водных ресурсов (на примере акватории Керченского пролива) 20
2.1.2 Особенности биотоксичности промышленных ксенобиотиков 23
2.1.2.1 Молекулярные механизмы интоксикации органическими растворителями 25
2.1.2.2 Молекулярные механизмы интоксикации полициклическими ароматическими гидрокарбонами 28
2.1.2.3 Молекулярные механизмы интоксикации ионами алюминия 30
2.1.2.4 Молекулярные механизмы интоксикации ионами свинца 34
2.1.2.5 Молекулярные механизмы интоксикации ионами кадмия 38
2.1.3 Характеристика молекулярных индикаторов физиологического состояния организма 39
2.1.3.1 Использование белков нервной ткани в качестве маркеров нарушений метаболизма животных 44
2.1.3.2 Использование про– и антиоксидантных процессов для характеристики состояния животных 55
2.1.3.3 Использование показателей энергетического обмена для определения молекулярных и клеточных повреждений призагрязнении ксенобиотиками 68
2.2 Собственные исследования 72
2.2.1 Материалы и методы исследования 72
2.2.1.1 Материалы исследования и экспериментальные модели 73
3 2.2. 1.2 Методы получения фракций, выявления и идентификации нейроспецифических белков 83
2.2.1.3 Метод определения ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов 97
2.2.1.4 Методы определения активности ферментов 100
2.2.1.5 Цитологические методы исследования 105
2.2.1.6 Методы статистической обработки данных 106
2.3 Результаты собственных исследований 107
2.3.1 Использование показателей оксидативного стресса в качестве индикатора повреждений в условиях воздействия промышленных поллютантов 107
2.3.1.1 Влияние ионов кадмия на развитие оксидативного стресса в головном мозге крыс в экспериментальных моделях 108
2.3.1.2 Влияние ионов свинца на развитие оксидативного стресса в головном мозге крыс в экспериментальных моделях 110
2.3.1.3 Влияние ионов свинца на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях 112
2.3.1.4 Влияние ионов алюминия на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях 120
2.3.1.5 Влияние суммарного действия ионов металлов на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в природной среде (участки р. Самара Днепровская) 131
2.3.1.6 Влияние хлорбензола на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях 136
2.3.1.7 Влияние полициклических ароматических гидрокарбонов на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях 139
2.3.1.8 Влияние продуктов нефтепереработки на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях 147
2.3.1.9 Влияние продуктов нефтепереработки на разитие оксидативного стресса в тканях рыб, обитающих в зоне катастрофы судов в Керченском проливе 153
2.3.1.10 Влияние продуктов нефтепереработки на развитие оксидативного стресса в гепатопанкреасе и жабрах моллюсков 156
2.3.1.11 Влияние промышленных органических растворителей на развитие оксидативного стресса в головном мозге крыс в экспериментальных моделях 161
2.3.2 Использование цитоскелетного ГФКБ в качестве индикатора повреждений в условиях воздействия промышленных поллютантов 163
2.3.2.1 Влияние ионов кадмия на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга крыс в экспериментальных моделях 164
2.3.2.2 Влияние ионов свинца на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга крыс и рыб в экспериментальных моделях 172
2.3.2.3 Влияние ионов алюминия на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга рыб в экспериментальных моделях 178
2.3.2.4 Влияние повышенной концентрации ионов металлов на
содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга рыб
в природной среде обитания (участки р. Самара Днепровская) 182
2.3.2.5 Использование цитоскелетного ГФКБ в качестве индикатора повреждений в головном мозге крыс под действием промышленных органических растворителей 184
2.3.2.6 Влияние полициклических ароматических гидрокарбонов и хлорбензола на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга рыб в экспериментальных моделях 190
2.3.2.7 Влияние продуктов переработанной нефти на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга рыб в экспериментальных моделях и зоне катастрофы судов в Керченском проливе 194
2.3.3 Использование цитоплазматического протеина S100 нейроглии животных в качестве индикатора повреждений в условиях воздействия промышленных поллютантов 197
2.3.3.1 Влияние ионов алюминия на содержание и полипептидный состав протеина S100 головного мозга рыб в экспериментальных моделях 198
2.3.3.2 Влияние ионов свинца на содержание и полипептидный состав протеина S100 головного мозга рыб в экспериментальных моделях 200
2.3.3.3 Влияние повышенных концентраций ионов металлов на содержание и полипептидный состав протеина S100 головного мозга рыб в природной среде обитания (участки р. Самара Днепровская) 202
2.3.3.4 Влияние полициклических ароматических гидрокарбонов и хлорбензола на содержание и полипептидный состав протеина S100 головного мозга рыб в экспериментальных моделях 204
2.3.3.5 Влияние продуктов переработанной нефти на содержание и полипептидный состав протеина S100 головного мозга рыб в экспериментальных моделях и зоне катастрофы судов в Керченском проливе 208
2.3.3.6 Использование протеина S100 в качестве индикатора повреждений в головном мозге крыс под действиемпромышленных органических растворителей 211
2.3.4 Иммуногистохимическая оценка влияния промышленных поллютантов на развитие астроглиальной реактивации в головном мозге рыб 214
2.3.5 Эффекты иммуномодулятора при формировании зрелой иммунной системы поросят в условиях влияния промышленных
поллютантов 221
2.4 Обсуждение результатов 236
2.4.1 Молекулярные механизмы, природа и валидность биомаркеров животных разных таксонов в определении биологических эффектов антропогенного загрязнения 236
2.4.1.1 Характеристика индивидуального влияния техногенных
загрязнителей 237
2.4.1.2 Характеристика эффектов суммарного действия техногенных загрязнителей 246
2.4.2 Анализ корреляционных связей между маркерами оксидативных повреждений и состоянием глиальных клеток 251
2.4.3 Влияние природного иммуномодулятора на гематологические показатели и иммунологическую резистентность поросят 254
3 Заключение 258
3.1 Практические предложения 274
Список использованных источников
- Современное экологическое состояние речных водных ресурсов (на примере водоемов Днепропетровской области)
- Использование показателей оксидативного стресса в качестве индикатора повреждений в условиях воздействия промышленных поллютантов
- Влияние хлорбензола на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях
- Влияние продуктов переработанной нефти на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга рыб в экспериментальных моделях и зоне катастрофы судов в Керченском проливе
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Характерной чертой развития
современных технологий является расширение разнообразия токсичных
веществ, приводящее к значительной трансформации экосистем.
Интенсивность воздействия на биоэнергетические процессы, антиоксидантную,
пищеварительную и нервную систему животных во многом зависит не только
от количества, но и от различных сочетаний типичных в современном мире
загрязнителей – ионов металлов и органических ксенобиотиков [Алешко С.А.,
2007; Нефедова С.А., 2011; Gourlay-Francе C., 2012]. Среди токсичных
факторов окружающей среды наиболее значимыми являются: алюминий,
содержащийся практически в любом водоеме [Белоусов Ю. Б., 2005; Grant W. et
al., 2002; Hichem N., 2014; Maranho L., 2015]; тяжелые металлы – свинец и
кадмий, существенно увеличивающие риски токсичности [Zurich M-G., 2002;
Белолюбская Д. С., 2008; Gerspacher C., 2009; Rai N.K., 2013; Ferlemi A.V., 2014;
Souid G., 2015; Lee J., 2014]; органические растворители, широко применяемые
в современном промышленном производстве [Аргучинцева А.В., 206;
Parasuraman S., 2014; Ozdol C., 2015; Tatum-Gibbs K.R, 2015]; полициклические
ароматические гидрокарбоны, углеводороды, асфальтены – основные
представители загрязнителей мирового океана [Rumney H., 2011, Ануфриева
B.B., 2002; Maranho L.A., 2014]. В условиях воздействия поллютантов особую
важность имеют исследования молекулярных и клеточных механизмов
токсичности [Григорьев В.С., 2010; Федорова Е.Ю., 2015]. Нервная ткань
наиболее чувствительна к действию повреждающих факторов. Известные
данные о нарушениях в клетках нервной ткани при действии экотоксикантов во
многом относятся к наземным животным [Manzo L., 2001; Максимов В.И.,
2005; Mariussen E., 2012; Garman R.H., 2015]. Значительно меньше работ в этой
области посвящено гидробионтам [Hylland K., 2007; Недзвецкий В.С., 2008;
Rumney H.S., 2011; Basu N., 2015]. Практически отсутствуют данные о
сравнительном анализе возрастных нарушений метаболизма нервной ткани
животных разных таксонов при загрязнении среды обитания промышленными
поллютантами. В последние десятилетия технический прогресс и
совершенствование методологии в изучении молекулярных механизмов,
межклеточных взаимодействий, регуляции клеточного ответа в нервной ткани
позволяет пересмотреть некоторые традиционные физиолого-биохимические
положения, касающиеся роли глиальных клеток и пластичности нервной
системы как в период раннего онтогенеза, так и в зрелой ЦНС. Однако работы,
посвященные изучению функций тканеспецифических биомаркеров нейроглии
в постнатальном развитии животных при действии экотоксикантов,
практически отсутствуют. Клеточные элементы глии, в первую очередь,
астроциты отличаются уникальными белками, которые характеризуются
определенной субклеточной локализацией и особенностями синтеза на разных
этапах онтогенеза [Verkhratsky A., 2015]. Представителями таких
гистоспецифических белков структурно-функциональных единиц ЦНС являются глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) и кальций-
связывающий цитозольный астроглиальный протеин S100, рост экспрессии
которых служит индикатором повреждений во взрослом мозге человека и
животных [Ellis E.F., 2007; Nedzvetskii V., 2012; Sotelo M., 2014; Goyal R, 2015].
Данные молекулярные маркеры глии не обладают видоспецифичностью
[Eng L., 2000], что позволяет использовать различные биологические виды
животных в экотоксикологических исследованиях. Принимая во внимание, что
процессы раннего онтогенеза сопровождаются активной пролиферацией и
дифференциацией определенных субпопуляций клеток ЦНС, отличающихся
чрезвычайной чувствительностью к действию токсикантов, понимание
особенностей ответных молекулярных и клеточных реакций в процессе
развития организма может быть важным звеном в стратегии нейропротекции и
сохранении жизнеспособности организмов. Учитывая то, что оксидативный
стресс является наиболее распространенным повреждающим фактором [Sureda
A., 2011; Sundt R.C., 2012; Silva C.A., 2014], изучение механизмов
оксидативных и антиоксидантных процессов в сочетании с особенностями
экспрессии тканеспецифических маркеров на различных стадиях
постнатального онтогенеза животных позволит повысить достоверность определения метаболических нарушений ЦНС на всех, в том числе и ранних, стадиях интоксикации. Понимание того, насколько необратимы повреждения при действии тех или иных поллютантов, чрезвычайно значимо для поиска препаратов повышающих нейропластичность, стратегии развития современных технологий нейропротекции и выбора тех способов производства, которые не представляют опасности для всех биологических систем, в том числе и человека.
Связь работы с научными программами, планами, темами.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическими планами
кафедры биофизики и биохимии Днепропетровского национального
университета (ДНУ), выполнялась в рамках договора о научно-техническом
сотрудничестве ДНУ с Керченским государственным морским
технологическим университетом (№ 1145, 2000-2003 гг.), целевых грантов TUBITAK и FUBAP правительства Турции, 2009-2012 гг., (грант FUBAP-1811) по теме: "Исследование нейропротекторного действия мелатонина в условиях СТЗ-индуцированного диабета" и 2007-2012 гг., (грант FUBAP-1235) по теме: "Влияние липоевой кислоты на нейроны и глиальные клетки в условиях окислительных повреждений ЦНС", госбюджетной теме: “Использование природных антиоксидантов и продуктов нанотехнологий в качестве нейропротекторов в условиях влияния неблагоприятных факторов окружающей среды и метаболических нарушений” (№ 0113U003041, 2013-2014 гг.). Диссертация соответствует основному плану темы: "Исследование механизмов нарушений метаболизма с целью диагностики и коррекции" (№ 4-075-04) научно-исследовательских работ кафедры биофизики и биохимии ДНУ и темы: «Адаптационные механизмы животных в реакциях нервной, эндокринной и сердечно-сосудистой систем» научно-исследовательских работ кафедры физиологии, фармакологии и токсикологии имени А.Н. Голикова и И.Е. Мозгова ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.
Цель исследования – обоснование валидности молекулярных
биомаркеров нервной ткани животных разных таксонов в постнатальном онтогенезе – ГФКБ, протеина S100, показателей оксидативного стресса для оценки степени биологической опасности промышленных загрязнителей.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:
-
Определить содержание и состав полипептидных фрагментов ГФКБ и протеина S100, указывающих на интенсивность астроглиоза, при действии ионов алюминия в головном мозге рыб различных видов в процессе постнатального развития.
-
Изучить динамику экспрессии ГФКБ и протеина S100 при действии ионов свинца в мозге рыб и крыс на различных стадиях постнатального онтогенеза.
-
Оценить возрастные особенности экспрессии ГФКБ – основного маркера астроцитов, в различных отделах головного мозга крыс при интоксикации ионами тяжелых металлов (свинца и кадмия).
-
Исследовать действие промышленного загрязнения на изменение состава и содержания цитоскелетного ГФКБ и цитоплазматического белка S100 нейроглии у половозрелых особей рыб бухты Керченская.
-
Изучить действие отходов металлургического производства на состояние глиальных промежуточных филаментов и кальций-связывающего протеина S100 астроцитов половозрелых особей рыб.
6. Исследовать особенности токсических эффектов органических
ксенобиотиков (хлорбензола, полициклических ароматических гидрокарбонов,
мазута, промышленных органических растворителей) на нервную ткань рыб и
крыс в различные сроки онтогенеза.
-
Определить показатели оксидативного стресса и активности антиоксидантной системы тканей животных (крыс, рыб, моллюсков) в различные сроки онтогенеза при действии ионов металлов и органических ксенобиотиков.
-
Провести сравнительный анализ токсических эффектов загрязнителей на состояние цитоскелетного ГФКБ и цитоплазматического протеина S100 нейроглии рыб.
-
Оценить валидность комплексной оценки молекулярных биомаркеров ГФКБ, протеина S100 и показателей оксидативного стресса для оценки степени биологической опасности промышленных загрязнителей.
-
Изучить эффективность применения иммуномодулятора для поддержания иммунной резистентности продуктивных животных в условиях загрязнения окружающей среды.
Методология и методы диссертационного исследования.
Методологической основой исследования явились труды специалистов в области биохимии и физиологии ЦНС, необходимость научного обоснования закономерностей формирования молекулярных и клеточных ответных механизмов нервной ткани животных на различных стадиях постнатального онтогенеза в модельных и природных условиях загрязнения окружающей среды современными промышленными экотоксикантами. Методология исследования
определяет целесообразность использования комплексного методического
подхода, включающего следующие физико-химические методы:
дифференциального центрифугирования, фотоколориметрические методы
определения содержания белка (метод Лоури, метод Брэдфорд) и содержания
тиобарбитурат-активных соединений; определение активности ферментов
(каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы, глутатион-S-
трансферазы, глутатионпероксидазы), электрофорез в градиентном
полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия
(ДСН), ион-обменная и адсорбционная хроматографии; иммунохимические
методы (иммуноэлектрофорез, иммуноблотинг, иммунодиффузия,
иммуногистохимия); цитологические методы (бактерицидная активность,
активность лизоцима, количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула,
фагоцитарная активность лейкоцитов, фагоцитарное число, индекс
завершенности фагоцитоза); экспериментальные модели с использованием рыб, моллюсков, крыс, свиней; статистические методы обработки данных.
Научная новизна результатов исследования. Предложено
использование молекулярных биомаркеров ГФКБ, протеина S100 и показателей оксидативного стресса для характеристики состояния животных различных таксонов, вызванных реакцией организма на загрязнение среды обитания промышленными поллютантами. Впервые показатели астроглиоза и оксидативного стресса используется в качестве биомаркера клеток головного мозга рыб в условиях неблагоприятного влияния ксенобиотиков. Впервые предложен способ биоиндикации состояния двухстворчатых моллюсков в условиях воздействия промышленных поллютантов, базирующийся на определении уровня окислительных повреждений липидов гепатопанкреаса, вызванных нарушением окислительно-восстановительного баланса клеток.
Предложено использование показателей оксидативного стресса,
цитоскелетных и цитоплазматических нейроспецифических белков в качестве прогностических маркеров состояния животных различных таксонов в условиях техногенного загрязнения. Впервые ГФКБ применяется в качестве молекулярного маркера астроглии рыб как для характеристики метаболических нарушений на ранних стадиях интоксикации, так и дифференциации степени неблагоприятного влияния ионов металлов и органических ксенобиотиков. До настоящего времени изменения содержания и состава полипептидных фрагментов глиального фибриллярного кислого белка в мозге рыб не использовалось в качестве индикатора состояния популяций рыб в условиях загрязнения водной среды.
Впервые молекулярный маркер астроглии – белок S100 используется в
ихтиологических исследованиях, что позволяет расширить спектр
молекулярных маркеров нейроглии и повысить достоверность определения метаболических нарушений в головном мозге рыб на различных стадиях интоксикации, а также дифференцировать меру неблагоприятного влияния ионов металлов и органических соединений. Изменения содержания цитозольного кальций-связывающего белка S100 в мозге рыб не
использовались для характеристики состояния гидробионтов в условиях хронического загрязнения водной среды органическими ксенобиотиками.
Впервые установлены особенности влияния неблагоприятных факторов различной химической природы (ионы алюминия, ионы свинца, хлорбензол, полициклические гидрокарбоны, мазут) на содержание и состав цитоскелетного (ГФКБ) и цитоплазматического (протеин S100) нейроспецифических белков рыб в процессе постнатального онтогенеза.
Выявлены общие закономерности реактивного астроглиального ответа на
воздействие неблагоприятных факторов – повышение экспрессии ГФКБ и
фибриллогенеза сопровождается ростом содержания деградированных
полипептидных фрагментов. Показано, что астроглиальный ответ на
интоксикацию ионами металлов и органическими ксенобиотиками,
характеризуется не только увеличением содержания ГФКБ и фибриллогенезом,
но и активной реконструкцией стабильной при нормальных физиологических
условиях сети промежуточных филаментов цитоскелета астроцитов.
Установлено существование прямой зависимости между развитием
астроглиального ответа и оксидативным стрессом в нервной ткани животных при хроническом воздействии неблагоприятных факторов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые данные, дополняющие физиологические и биохимические представления о роли нейроглии животных. Результаты работы позволяют пересмотреть известные для цитоскелета астроцитов функции пассивного механического интегратора внутриклеточного пространства. Комплексный подход с использованием иммунохимических методов значительно расширяет границы прикладного применения нейроспецифических белков (цитоскелетного ГФКБ и цитозольного кальций-связывающего протеина S100) в качестве маркеров патологических состояний ЦНС животных.
Особенности экспрессии молекулярных маркеров животных,
используемые при выявлении интенсивности биологического воздействия
современных промышленных загрязнителей, позволяют не только
охарактеризовать динамику процессов, ведущих к повреждениям клеточных структур на базовых уровнях организации биосистем, но и получить информацию о степени повреждений на ранних стадиях интоксикации, оценить способность организма к репарации органических повреждений, разработать меры эффективного восстановления жизненных функций животных, а также определить состояние промысловых видов рыб, являющихся сырьем для изготовления продуктов питания.
Результаты исследований включены в программы курсов лекций и лабораторных работ по биохимии для студентов технологического и морского факультетов Керченского государственного технического университета, ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту.
- Комплексная характеристика и возрастные особенности физиолого-биохимических, молекулярных и клеточных нарушений в нервной ткани
животных разных таксонов при действии ионов металлов и органических ксенобиотиков.
- Обоснование возможностей использования молекулярных биомаркеров
нейроглии животных для оценки степени физиологической и биохимической
опасности промышленных загрязнителей;
- Обоснование эффективности применения иммуномодулятора для
поддержания иммунной резистентности продуктивных животных в условиях
загрязнения окружающей среды.
Личный вклад соискателя. Диссертация является личной научной
работой. Основные идеи исследования, рабочая гипотеза научной проблемы
выдвинуты автором самостоятельно. Диссертантом самостоятельно проведен
анализ литературных данных, статистическая обработка результатов,
информационно-патентный поиск, большая часть экспериментальных
исследований, обобщение полученных результатов. Обсуждение методологии, исследований, разработка программы и задач исследования проведены совместно с научными консультантами – проф., д.б.н. Недзвецким В.С. и проф., д.б.н. Максимовым В.И. Диссертант непосредственно принимал участие в выполнении всех задач работы. В диссертации не использовались идеи или разработки, принадлежащие соавторам публикаций.
Апробация результатов исследования. Основные результаты
исследований обсуждены на научных семинарах кафедры биофизики и
биохимии ДНУ (Днепропетровск, 2006-2015), ежегодных научных
конференциях КГМТУ (Керчь, 2006-2015), а также на научных форумах: II междунар. науч.-практ. конф. «Экологическая безопасность: проблемы и пути решения» (Алушта, 2006); науч.-практ. конф. «Окружающая среда и здоровье» (Тернополь, 2007); междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Днепропетровск, 2008); междунар. науч.-практ. конф. «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2010); расширенный науч. семинар «Экологическая и пищевая безопасность в Юго-Восточной Европе и Украине» (Днепропетровск, 2011); междунар. науч.-практ. конф. «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2011); III междунар. науч.-практ. конф. «Современные проблемы биологии, экологии и химии» (Запорожье, 2012); науч.-практ. конф. «Морские технологии: проблемы и решения» (Керчь, 2012), VII междунар. науч.-практ. конф. «Экология речных бассейнов» (Владимир, 2013); II междунар. науч. конф. «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Днепропетровск, 2013); . междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы общества, науки и образования: современное состояние и перспективы развития» (Курск, 2013); междунар. науч.-практ. конф. «Современная наука: проблемы, инновации, решения» (Курск, 2013); науч.-практ. конф. «Современные проблемы преподавания и научных исследований биологии (Днепропетровск, 2014), междунар. науч.-практ. конф. «Социальная работа в современном мире: взаимодействие науки, образования и практики» (Белгород, 2014); междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы общества, науки и образования:
современное состояние и перспективы развития» (Курск, 2015); междунар. научной конф. «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Днепропетровск, 2015), расширенном заседании кафедры физиологии, фармакологии и токсикологии имени А.Н. Голиков и И.Е. Мозгова ФГБОУ ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина (Москва, 2015); междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы общества, науки и образования: современное состояние и перспективы развития» (Курск, 2016); расширенном заседании кафедры физиологии, фармакологии и токсикологии имени А.Н. Голиков и И.Е. Мозгова ФГБОУ ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина (Москва, 2016).
Публикации. Результаты исследований представлены в 47 печатных работах, из них: 13 статей в профессиональных изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 4 статьи в профессиональных изданиях, рекомендованных ВАК Украины, 3 патента на изобретение, 1 заявка на патент, 1 монография, 2 учебных пособия, а также тезисы докладов в материалах конгрессов, научных конференций, симпозиумов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 341 странице
печатного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора
литературы, описаний материалов и методов исследований, результатов
собственных исследований, обсуждения полученных результатов
исследований, выводов и списка использованных источников. Работа содержит 103 рисунка и 9 таблиц. Перечень цитируемой литературы включает 591 источник, в том числе 157 отечественных и 434 иностранных.
Современное экологическое состояние речных водных ресурсов (на примере водоемов Днепропетровской области)
Водный сток рек Днепровского бассейна составляет почти 60% общего речного стока Украины. Сброс стоков в поверхностные воды Днепровского бассейна осуществляют более 800 водопользователей, среди которых основные загрязнители – Днепропетровская, Запорожская области и г. Киев. Крайне опасными для экологии водного бассейна являются предприятия черной и цветной металлургии, коксохимическое производство, машиностроение, горнодобывающие комплексы региона. Именно промышленное химическое загрязнение определено программой ПРООН– ГЭФ «Экологическое оздоровление бассейна Днепра» приоритетной экологической проблемой [43].
Прогрессивная деградация экосистемы бассейна р. Днепр стала очевидной еще в начале 90-х годов XX столетия. Процессы деградации природных комплексов на территории бассейна сопровождаются значительными, а в некоторых случаях и необратимыми, изменениями. Все чаще на формирование стока рек Днепровского бассейна влияют антропогенные загрязнители, о чем свидетельствует значительное повышение содержания растворенных солей, показателя химического потребления кислорода (ХПК), синтетических поверхностно-активных веществ (СПАВ), фенолов, нефтепродуктов. Так при предельно-допустимых концентрациях (ПДК) для поверхностных вод 1000 мг/л, минерализация вод некоторых рек бассейна (Волчья, Самара, Соленная) составляет более 3000 мг/л. Стабильно высокое среднегодовое содержание органических веществ и СПАВ наблюдается в водах Днепродзержинского водохранилища (г. Верхнеднепровск), все чаще встречаются случаи повышенных концентраций СПАВ в реках Ингулец (г. Кривой Рог), Самара (г. Новомосковск), Волчья (п.г.т. Васильковка). В воде Днепровских водохранилищ содержание фенолов может достигать 7 ПДК. Наиболее значительные среднегодовые концентрации фенолов зафиксированы в водах р. Самара и Днепродзержинском водохранилище – от 5 до 7 ПДК [44–47]. Повышение среднегодовых концентраций тяжелых металлов в водоемах бассейна Днепра также прямопропорционально росту темпов развития современных технологий. По данным наблюдений Государственной гидрометеорологической службы Министерства экологии и природных ресурсов Украины со стоками, дождевыми и талыми водами в р. Днепр ежегодно попадает около 1 тыс. т железа, 40 т никеля, 2 т цинка, 1 т меди, 0,5 т хрома [48]. Наиболее загрязнены соединениями меди и цинка воды Каховского водохранилища (г. Никополь), где среднегодовые концентрации этих металлов достигают 10 ПДК. Среднегодовые концентрации меди в водах р. Волчья находятся в пределах 5–10 ПДК, а содержание цинка в некоторых пробах из этого водоема достигает значений равных 13 ПДК. Превышение содержания цинка и меди, составляющее 2 и 5 ПДК соответственно, зафиксировано в водах Запорожского водохранилища (район с. Военное). В водах этого водохранилища и его притоков не единичны случаи сверхнормативного содержания кадмия, марганца, никеля, железа [49, 50]. Из анализа современного гидрохимического состояния Днепровского бассейна следует, что уровень техногенного давления на водоемы является опасным. Достаточно полную информацию о химическом составе поверхностных вод бассейна Днепра обеспечивают специально созданные пункты наблюдения, общее количество которых составляет 219 единиц, т.е. в среднем на каждую реку, не считая р. Днепр, приходится по 1–2 пункта [51]. Однако применение метода сравнения показателей фактического содержания ксенобиотиков и их ПДК не позволяет объективно оценить величину антропогенной нагрузки, комплексную оценку степени загрязнения бассейна можно получить только на основе экосистемного подхода, руководствуясь концепцией безопасности функционирования экосистемы в целом.
Хозяйственная деятельность в течение последних десятилетий неуклонно отражается и на экологическом состоянии Керченского пролива. Повышение уровня техногенного загрязнения акватории обусловлено рядом причин. Так, в период 2000–2005 гг. значительно, с 10 до 30 тысяч, возросло количество судов, проходивших по Керчь–Еникальскому каналу [52]. Интенсификация судоходства способствовала росту эрозионных процессов и прогрессирующей реседиментации донных отложений [53, 54].
Большая часть перегрузок, являющихся неотъемлемой составляющей работы рейдово–перегрузочных комплексов Керченского пролива, состоит из угля, кокса, кальцинированной соды, ферросплавов, минеральных удобрений, которые в условиях попадания в морскую среду значительно ухудшают экологическое состояние акватории [55]. Действие этих экотоксикантов усиливают береговое строительство, дампинг грунтов, добыча гравия, нефти и газа, деятельность морских портов [56]. Повышению уровня техногенного загрязнения вод Керченского пролива способствовала авария 6 российских судов во время шторма 11 ноября 2007. По разным оценкам, в морскую среду попало от 1300 до 1600 тонн горюче– смазочных материалов и от 2000 до 2500 тонн технической серы. После такой глобальной катастрофы район Керченского пролива был официально объявлен зоной чрезвычайной ситуации [57].
Использование показателей оксидативного стресса в качестве индикатора повреждений в условиях воздействия промышленных поллютантов
Негативным последствием интенсивного развития современных технологий является неуклонное расширение спектра токсичных веществ техногенного происхождения. При всем многообразии таких поллютантов ионы металлов и промышленные органические ксенобиотики рассматриваются как наиболее опасные факторы риска, обусловливающие антропогенный прессинг в ходе трансформации экосистем.
Использование показателей оксидативного стресса в качестве индикатора повреждений в условиях воздействия промышленных поллютантов
В условиях техногенного загрязнения гидросферы исследование закономерностей токсического воздействия промышленных поллютантов на организм животных разных таксонов является наиболее актуальным. Интенсивность воздействия на биоэнергетические процессы, антиоксидантную, пищеварительную и нервную систему животных во многом зависит не только от количества, но и от различных сочетаний типичных в современном мире загрязнителей – ионов металлов и органических ксенобиотиков. Такие изменения в тканях животных, обитающих в условиях загрязнения окружающей среды, могут быть использованы как для выявления нарушений на ранних стадиях патологии, так и при мониторинге состояния популяций различных биологических видов.
Наиболее распространенным метаболическим нарушением, возникающим в клетках под действием неблагоприятных факторов, является оксидативный стресс – один из главных индукторов структурно-функциональных изменений организма. В зависимости от интенсивности воздействия, оксидативный стресс может быть как локальным, умеренным, так и сильным, приводящим не только к структурно-функциональным нарушениям, но и к гибели клеток.
Влияние ионов кадмия на развитие оксидативного стресса в головном мозге крыс в экспериментальных моделях Результаты исследований дают основания утверждать, что механизмы токсических эффектов промышленных поллютантов тесно связаны с изменением окислительно-восстановительного баланса и увеличением количества оксидативных повреждений клеток. Наличие оксидативного стресса – одного из центральных механизмов нейротоксичности, подтверждают данные о содержании конечных продуктов перекисного окисления липидов в различных отделах головного мозга крыс (гиппокамп, мозжечок, кора больших полушарий), получавших хлорид кадмия с питьевой водой. Во всех исследованных отделах особей экспериментальных групп животных обнаружено достоверное однотипное повышение (по сравнению с контролем) содержания ТБК-активных продуктов на 28-70-ые сутки постнатального развития. Рост синтеза продуктов ПОЛ в гиппокампе животных экспериментальных групп относительно особей контрольных групп этого же возраста составил в среднем 102% (СПР-28, Р 0,01), 72% (СПР-42, Р 0,01), 46% (СПР-56, Р 0,05) и 47% (СПР-70, Р 0,05). Динамика показателей оксидативного стресса в головном мозге крыс в процессе постнатального развития при интоксикации кадмием представлена на рис. 2.10. Выявленные различия свидетельствует об устойчивом нарушении нормального метаболизма клеток нервной ткани животных. Из исследованных фаз постнатального развития наиболее чувствительным к действию токсикантов является период непосредственно после рождения. Наиболее вероятно, что это связано с особенностями постнатального развития ЦНС грызунов, у которых в первые 2-3 недели жизни происходит завершение миграции нервных клеток и формирование зрелых морфологических образований мозга. Такой процесс требует существенных энергетических затрат, ассоциирован с высокой функциональной нагрузкой митохондрий и, соответственно, значительной степенью риска генерации оксидативного стресса при действии повреждающих токсичных факторов.
Влияние хлорбензола на развитие оксидативного стресса в тканях рыб в экспериментальных моделях
В спектре природных загрязнителей многочисленную группу составляют промышленные синтетические органические соединения (производные ароматических и диеновых углеводородов, циклопарафинов, терпенов и пр.). Наиболее весомым источником токсичных поллютантов в промышленном органическом синтезе является производство растворителей. В частности, известно, что интоксикация одним из наиболее распространенных компонентов синтетических промышленных растворителей – толуеном индуцирует снижение динамики синтеза регуляторного белка сборки микротрубочек MAP2, угнетает синтез глиальными клетками нейротрофических факторов, таких как GDNF (нейрональный фактор глии) и BDNF (мозговой нейрональный фактор) [534].
Химически индуцированное нейротоксическое действие отдельных компонентов промышленных органических растворителей подтверждено не только для человека и экспериментальных животных, но и в моделях клеточных культур [88]. Известно, что они способны индуцировать окислительные повреждения высокомолекулярных соединений, оказывая существенное влияние на активность ключевых ферментных систем многих метаболических процессов [79]. Выявление особенностей таких нарушений в сочетании с изучением тканеспецифических маркеров, может быть наиболее чувствительным и информативным компонентом комплексной характеристики адаптивного потенциала животных в условиях интоксикации органическими поллютантами.
Так результаты определения содержания конечных продуктов ПОЛ тканей головного мозга крыс указывают на достоверные различия между соответствующими возрастными экспериментальными и контрольными группами во всех отделах головного мозга крыс. Динамика изменений этого показателя генерации оксидативного стресса в гиппокампе головного мозга животных на 28, 42, 56 и 70 сутки постнатального развития (СПР) представлена на рис. 2.46.
Возрастные особенности содержания конечных продуктов ПОЛ в гиппокампе головного мозга крыс на 28, 42, 56 и 70 сутки постнатального развития (СПР) при интоксикации многокомпонентным органическим растворителем (ОР) по сравнению с контрольными группами животных (К); – P 0,05; – P 0,01 – достоверность разницы в сравнении с контролем.
При анализе полученных экспериментальных данных установлено, что наиболее значительный рост этого показателя выявлен у животных группы 163 СПР-28. Содержание ТБК-активных продуктов в этой возрастной группе в среднем на 101% (Р 0,05) превышало аналогичные показатели контрольной группы. Выявленный устойчивый рост генерации реактивных соединений кислорода, возможно, связан как с особенностями экспрессии ферментов антиоксидантной защиты, так с повышенной чувствительностью к изменениям динамического равновесия между повреждениями и репарацией митохондриальных мембран на ранних этапах развития головного мозга животных. Нарушения окислительно-восстановительного баланса могут являться одной из возможных причин дальнейших каскадных изменений молекулярных и клеточных механизмов, ведущих к нарушению нормального процесса образования нейрональных ансамблей, вплоть до апоптоза зрелых клеток.
При поиске адекватных маркеров, позволяющих оценить состояние популяций животных в условиях антропогенного прессинга, особое внимание следует обратить на белки нервной ткани, среди которых наиболее надежным маркером нейротоксичности признан специфический белок астроглии – ГФКБ. Использование уникальных маркерных свойств этого белка глиальных ПФ имеет чрезвычайную практическую значимость как в нейробиологии, так и нейропатологии [204].
Известно, что астроциты необычайно чувствительны к изменениям микроокружения, а быстрые модификации их морфологии происходят за счет перестройки цитоскелетного аппарата, что необходимо для функционирования этих клеток после различных повреждений. Поэтому состояние ПФ можно рассматривать как показатель функциональной активности астроглии, играющий ключевую роль в регуляции клеточных событий, сопровождающих поражения ЦНС. Реакция клеток астроглии на действие повреждающих факторов сопровождается усиленным синтезом ГФКБ и интенсивным фибриллогенезом [36, 355]. На таких чувствительных ответных молекулярных процессах, лежащих в основе реакций организма на изменения окружающей среды, и может базироваться оценка состояния популяций животных. Выявление содержания и состава цитоскелетного ГФКБ астроцитов, может служить достоверным показателем, характеризующим степень патогенетических нарушений нервной системы на клеточном уровне – чем больше повреждающее действие ионов металлов, тем более интенсивный астроглиальный реактивный ответ и более значительные изменения экспрессии ГФКБ.
Влияние ионов кадмия на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга крыс в экспериментальных моделях
Сравнительный анализ содержания общего белка в цитозольных фракциях коры больших полушарий головного мозга, гиппокампа и мозжечка контрольной и экспериментальной групп животных, показал прогрессивную положительную динамику на протяжение 6 недель исследования. Так уровень цитозольных белков в отделах головного мозга контрольной группы крыс увеличился в среднем на 37,8% (кора), 39,2% (мозжечок) и 41,0% (гиппокамп), а экспериментальной группы – на 31,7% (мозжечок), 39,0% (гиппокамп) и 39,8% (кора). Результаты количественного определения общего белка в цитозольных фракциях мозга крыс экспериментальной и контрольной групп представлены на рис. 2.47 и 2.48. При определении содержания белков цитоскелетных фракций в тех же отделах головного мозга выявлена несколько иная зависимость (рис. 2.49, 2.50).
Влияние продуктов переработанной нефти на содержание и полипептидный состав ГФКБ головного мозга рыб в экспериментальных моделях и зоне катастрофы судов в Керченском проливе
Неонатальное развитие характеризуется изначально низким количеством общего числа лейкоцитов в периферической крови у поросят до сосания молозива и постепенным их повышением в первую неделю жизни, с незначительным снижением к концу второй недели после рождения. Также в этот период происходит перераспределение содержания фракций гранулоцитов и агранулоцитов. Введение свиноматкам иммуномодулирующего препарата "Иммунолак" индуцировало повышение содержания общего количества лейкоцитов крови неонатальных поросят, в первую очередь, за счет роста представительства фракции лимфоцитов. Выявленные возрастные изменения в лейкоцитарной формуле имели характерные особенности преобладания фракции нейтрофилов до сосания молозива и в первые часы жизни. В этот же период в крови у поросят показан низкий уровень эозинофилов и моноцитов. Такие различия могут быть связаны с особенностями генерации и развития клеток иммунной системы у колостральных животных. На протяжение первых 23 суток жизни у поросят происходит перераспределение фракций лейкоцитов, а именно, повышение количества моноцитов и эозинофилов в среднем в 2,2 раза, лимфоцитов в 1,6 раза, на фоне снижения фракции нейтрофилов в 1,5 раза (относительно их количества у новорожденных поросят в первый день жизни). Введение супоросным свиноматкам препарата ферментативного гидролизата клеточной стенки Lactobacillus Delbrueckii способствует достоверному (Р0,05) росту в крови рожденных от них поросят фракции лимфоцитов в первые 4 часа, на 7 и 14 сутки жизни на 29,7%; 21,1% и 20,2% соответственно на фоне снижения фракции сегментоядерных нейтрофилов на 10,6%, 24,7% и 17,3% соответственно.
Таким образом, в ранней неонатальной фазе развития у поросят происходит прогрессивный рост генерации лейкоцитов с одновременным перераспределением их фракций в сторону увеличения лимфоцитов, эозинофилов, моноцитов и снижения сегментоядерных нейтрофилов. Применение препарата «Иммунолак» способствует повышению в крови поросят количества лейкоцитов на протяжении первой недели жизни в среднем более чем на 56%, а также в первые две недели – увеличение фракции лимфоцитов на 24%. Представительство фагоцитов в крови поросят обеих групп также изменялось в течение первых недель жизни (таблица 2.8).
Степень фагоцитирующей активности лейкоцитов и состояние их переваривающей способности увеличивалось с момента рождения. Следует отметить, что агрессивность лейкоцитов постепенно повышается на протяжении всего времени опыта, о чем свидетельствует изменения фагоцитарного числа (ФЧ). Показатель перевариваемой способности (ИЗФ) постепенно повышается в течение первой недели жизни на 15,7% и на второй на 26,5% относительно 7-ми и 14-ти суточных поросят контрольной группы соответственно. На 23 сутки жизни животных ИЗФ снизился на 17,7%, (относительно 14 суточных поросят), что соответствует значению животных 233 недельного возраста. Следует отметить, что в крови у новорожденных поросят содержится в среднем около 19% нейтрофилов с активированным кислородзависимым механизмом бактерицидной активности, о чем свидетельствует значение показателя НСТ (рис. 2.101). К концу первой недели жизни поросят содержание гранулоцитов в крови снижается на 16%, относительно новорожденных животных, а к 14 суткам жизни уровень гранулоцитов восстанавливается. Второе, более выраженное, снижение показателя НСТ у неонатальных поросят отмечается на 23 сутки жизни. В этом возрасте функциональная активность нейтрофилов уменьшается на 31% относительно поросят двух недельного возраста. Выявленная модальность временных колебаний функциональной активности нейтрофилов полностью совпадает у особей контрольной и экспериментальной групп, что свидетельствует о природном иммуномодулирующем эффекте данного препарата.
Достоверных изменений уровня агрессивности фагоцитирующих лейкоцитов и состояния их перевариваемой способности между экспериментальной и контрольной группой не выявлено. Введение супоросным свиноматкам препарата "Иммунолак" способствует повышению в крови рожденных от них поросят количества активированных фагоцитов в течение первых 23 суток жизни – на 12% (относительно первых суток жизни) и нейтрофилов с активированным кислородзависимым механизмом бактерицидной активности на 17% в первую неделю жизни. Исследование лимфоцитов показывают, что в крови новорожденных поросят до сосания молозива преобладают недифференцированные их формы. Представленные данные указывают на выраженный иммуномодулирующий эффект у поросят, полученных от свиноматок, которым вводили препарат "Иммунолак".