Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Строение и структура костной ткани 10
1.2 Состав костного матрикса 12
1.3 Регуляторные белки костной ткани 18
1.5 Применение регуляторных белков костной ткани в ортопедии 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 31
2.1 Материалы исследования 31
2.2 Методы исследования 34
2.2.1 Способ получения низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных 34
2.2.2 Хроматографические методы исследования белков костной ткани 34
2.2.3 Способ моделирования перелома голени у лабораторных мышей 35
2.2.4 Методы исследования сыворотки крови экспериментальных животных 36
2.2.5 Методы исследования костной ткани экспериментальных животных 37
2.2.6 Метод оценки содержания гликогена в печени и мышечной ткани экспериментальных животных 37
2.2.7 Статистические методы исследования 37
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 38
3.1 Экспериментальный анализ условий проведения гель-проникающей хроматографии 38
3.2 Хроматографическое исследование кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных 43
3.2.1 Исследование состава препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани собаки, быка свиньи и кролика с помощью гель-проникающей хроматографии 44
3.2.2 Исследование состава препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани собаки, быка свиньи и кролика с помощью ионообменной хроматографии 51
3.3 Сравнение биологического действия фракций препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани свиньи и быка, обладающих сродством к катионообменнику 52
3.4 Изучение биологического действия фракций препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка 67
3.4.1 Получение фракций с рассчитанной молекулярной массой 6,5 и 1,3 кДа из препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка 67
3.4.2 Исследование биологического действия фракции белков костной ткани быка с рассчитанной молекулярной массой 6,5 кДа 70
3.4.3 Исследование биологического действия фракции белков костной ткани быка с рассчитанной молекулярной массой 1,3 кДа 80
Заключение 90
Выводы 95
Список литературы
- Регуляторные белки костной ткани
- Применение регуляторных белков костной ткани в ортопедии
- Способ моделирования перелома голени у лабораторных мышей
- Исследование состава препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани собаки, быка свиньи и кролика с помощью ионообменной хроматографии
Регуляторные белки костной ткани
Костная ткань, как и любая соединительная ткань, состоит из клеток и межклеточного вещества. В костной ткани выявлены две линии клеток – это клетки остеобластического ряда и остеокласты (Rauch F. 2006). Они принадлежат к разным клеточным линиям, не имеющим во взрослом организме общих клеток-предшественников, каждая из этих линий снабжена собственными стволовыми клетками (Франке Ю., Рунге Г. 1995; Liao X., et al. 2011). Стволовые стромальные клетки костного мозга являются родоначальниками дифферона клеток остеобластического ряда, который выглядит следующим образом: стволовые клетки, преостеобласты, остеобласты, остеоциты (Pittenger M.F., et al. 1999; Oranger A. , et al. 2014). Остеокласты являются разновидностью макрофагов и развиваются из стволовых клеток крови (Boyle W.J., et al. 2003; Boyce B.F., et al. 2009). В настоящее время принято выделять следующие основные функциональные свойства каждого вида клеток: преостеобласты или камбиальные клетки служат источником остеобластов; остеобласты синтезируют органический матрикс; остеоциты формируют единую транспортную сеть костного матрикса; остеокласты резорбируют костный матрикс (Лоренс Риггз Б., Джозеф Мелтон Л.III., 2000; Заварзин А.А., 2000; Vaananen, et al., 2000; Аврунин A.C. и др., 2002; Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А., 2002; Bonewald L.F., 2002; Caetano-Lopes J, et al., 2007; Аврунин А.С., 2012).
Взаимосвязанное функционирование остеокластов и остеобластов образуют сложный процесс, называемый костным ремоделированием. Благодаря этому процессу кость является динамической системой, активно участвующей в метаболических и регенерационных процессах в организме (Корж А.А., Дедух Н.В., 2006). Ежегодно в организме человека перестраивается до 10% общего объема костной ткани (Картамышева Н.Н., Чумакова О.В., 2004; Proff P., Rmer P., 2009; Базарный В.В. и др. 2010). Костное ремоделирование играет ключевую роль в поддержании параметров минерального гомеостаза (Аврунин А.С. и др., 2001).
Межклеточное вещество костной ткани называют костным матриксом, который составляет 90% массы кости (Post T.M. et al., 2010). Он состоит из неорганической, органической частей и воды (Robey G.P., 1999). Химический состав костного матрикса представлен в таблице 1 (Островский О.В., Храмов В.А., Попова Т.А., 2010). Таблица 1 – Количественный состав макроэлементов в минерализованных тканях
Неорганический компонент костной ткани определяет ее специфику и наделяет уникальными механическими свойствами. Благодаря своей структуре костный матрикс обладает огромной механической прочностью (Корнилов Н.В., Аврунин А.С., 2001). Неорганическая часть костного матрикса составляет около 65% массы костной ткани и содержит порядка 98% всех неорганических веществ организма (Boivin G., Meunier P.J., 2003). Она в основном состоит из двух химических элементов – кальция и фосфора, образующих кристаллы гидроксилапатита, а также входящих в состав других неорганических веществ (Улумбеков Э.Г., Челышева Ю.А., 2002; Bonucci E., 2007).
Гидроксиапатит – это преобладающая часть минерализованного матрикса, в меньших количествах костная ткань содержит аморфный фосфат кальция (Аврунин А.С., Корнилов Н.В., Иоффе И.Д., 2000).
Содержание аморфного фосфата кальция зависит от возраста, и может колебаться в широком диапазоне. Его содержание может преобладать в раннем возрасте, в зрелой же костной ткани преобладает кристаллический гидроксилапатит. Аморфный фосфат кальция является лабильным резервом ионов кальция и фосфата (Березов Т.Г. Коровкин Б.Ф., 1998). В состав неорганической части кости также входят бикарбонаты, цитраты, фториды, соли калия, магния, натрия, меди, цинка, железа, стронция, никеля и др. микроэлементы (Мухамеджанов Л.Р., Галиев И.М., 2004; Крымова Т.Г., Колкутин В.В., Добровольская М.В., 2007; Власов А.Ю., Апагуни А.Э., Воронков В.А., 2009). В кости содержится более 50% магния, 40% натрия и 19% микроэлементов всего организма (Bala Y., Farlay D., Boivin G., 2013).
Органическое вещество костей состоит примерно на 90% из коллагена I типа, от 3% до 8% массы приходятся на неколлагеновые белки кости и фосфолипиды, 1% составляют кислые и нейтральные гликозаминогликаны (Brodsky B., Persikov A.V., 2005; Лунева С.Н., Накоскин А.Н., 2004). Прочностные свойства костной ткани определяются совокупностью трех компонентов: коллаген – прочность, протеогликаны – эластичность, кристаллы гидроксиапатитов – жесткость. Подробный состав органического матрикса кости представлен в таблице 2 (Clarke B., 2008; Ригс Мелтон III Л. Дж., 2000; Tamma R., Carbone C., Colucci S., 2014; Grayna E.S., Deepak V., 2012).
Коллаген, помимо минерального компонента, является основным фактором, характеризующим механические свойства кости (Paschalis E.P.et al., 2004). Молекула коллагена является гетерополимером, состоящим из двух 1(I)- и одной 2(I)-цепей, первичная структура которых складывается из повторяющейся последовательности триплетов аминокислот глицин-Х-Y, где Х и Y позиции чаще заняты, соответственно, пролином и гидроксипролином (Viguet-Carrin S., Garnero P., Delmas P.D., 2006; Paschalis E.P.et al., 2003).
Костный матрикс образован коллагеном типа I, хотя были обнаружены в следовых количествах коллагены V, XI, XII типов, так называемые, минорные коллагены. Минорные коллагены принимают участие в регуляции диаметра образующихся фибрилл коллагена I типа (Niyibizi C., Eyre D.R.,1994; Niyibizi C., Eyre D.R., 1989).
Сухожилия и кожа также содержат в составе коллаген I типа. Но коллаген костной ткани обладает характерными особенностями. Он содержит больше оксипролина, чем коллаген сухожилий и кожи. Также отличительной чертой костного коллагена является наличие большого числа межцепочечных поперечных сшивок и, как следствие, меньшая растворимость. Характерной чертой костного коллагена является повышенное содержание фосфата, связанного с остатками серина (Лоренс Риггз Б., Джозеф Мелтон Л.III., 2000)
Применение регуляторных белков костной ткани в ортопедии
Костную ткань, выделенную из диафизарной части бедренной кости, освобожденную от мягких тканей и костного мозга замораживали с использованием жидкого азота и измельчали до частиц с диаметром менее 1 мм. Навеску массой 100 г измельченной костной ткани деминерализовали 1,5 М раствором соляной кислоты с добавлением йодацетата. Раствор соляной кислоты добавляли порциями по 100 - 200 мл до стабилизации pH, после чего отделяли осадок от раствора. Для получения белковой фракции 3,5 – 14 kDa фильтрованный через бумажный фильтр (белая лента) надосадочный раствор подвергался диализу с помощью установки с двойной диализной пленкой CelluSep (США). Внутренняя диализная пленка устройства пропускала белки с массами до 14 кДа, внешняя – до 3,5 кДа. Диализ проводили против дистиллированной воды. После диализа раствор, находившийся между диализными пленками, высушили с помощью низкотемпературной вакуумной лиофильной сушки Heto Liolab 3000 (Дания). Таким образом был получен препарат лиофилизированных низкомолекулярных неколлагеновых белков костной ткани с молекулярной массой менее 14 кДа.
При получении и исследовании образцов низкомолекулярных костных белков использовали хроматографическую систему LC-20 Prominence Shimadzu (Япония) для высокоэффективной жидкостной хроматографии, представленную насосом высокого давления серии LC-20 AP, блоком автоинжектора SIL-10 AP, ультрафиолетового детектора SPD-20 A, коллектора фракций FRC-10 A и колонки Shodex (США) Protein KW-2002.5 для гельпроникающей хроматографии, IEC QA-2825 для анионообменной хроматографии и IEC SP-2825 для катионообменной хроматографии. В качестве элюента использовали буферный раствор трис(гидроксиметил)аминометан - соляная кислота (Трис-HCl) концентрацией 100 ммоль/л и рН = 7,5. Для ионообменной хроматографии был использован фосфатный буфер концентрацией 20 ммоль/л. Буфер для катионообменной хроматографии имел рН = 6,8. Линейный градиент концентрации элюирующего раствора создавали использованием 0,00 – 1 М хлористого натрия в 20 мМ фосфатном буфере с соответствующим рН. В качестве калибровочных растворов для гельпроникающей хроматографии использовали набор маркеров молекулярной массы Sigma-Aldrich (США) MWGF 200-1KT. Закалываемый объем пробы не превышал 1 мл, а концентрация белковых препаратов 40 мг/мл. Скорость потока для гельпроникающей хроматографии – 2 мл/мин, для ионообменной – 3 - 5 мл/мин.
Перелом верхней трети голени осуществляли путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности под диэтиловым наркозом. В соответствии с Патентом РФ № 2456927 от 27 июля 2012 года предварительно наркотизированное животное укладывали на приборном столе на животе. Далее фиксировали голень медиальной стороной на краю приборного стола, находили точку перелома кости в верхней трети голени и затем проводили перелом костей голени путем механического воздействия, перпендикулярно прикладываемого на продольную ось большеберцовой кости, до появления характерного звука перелома, при наличии которого судят об осуществлении перелома. Отсутствие смещения отломков отмечают визуально по сохраненной после манипуляции продольной оси голени. Методы исследования сыворотки крови экспериментальных животных Для исследований собирали сыворотку крови, полученную центрифугированием цельной крови при 3000 об./мин. В сыворотке крови изучали содержание общего белка, глюкозы, неорганического фосфата, общего кальция, магния, активность щелочной фосфатазы, тартратрезистентной кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы. Содержание общего кальция, неорганического фосфата, магния определяли на автоматическом анализаторе Hitachi 902 (США), используя наборы реактивов фирмы «Vital Diagnostics Spb». Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом (Данилова Л.А., 2003). Для исследования активности щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы использовали наборы фирмы «Vital Diagnostics Spb» и анализатор «Stat Fax 1904 Plus» (США). Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозооксидазным методом наборами реагентов «Глюкоза – ФКД» ООО «Фармацевтика и клиническая диагностика».
В костной ткани оценивали изменение содержания воды, кальция и фосфора. У мышей экспериментальных и интактной групп выделяли большеберцовую кость обеих конечностей, очищали от остатков мышц и соединительной ткани, помещали в пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивали в течение суток на низкотемпературной вакуумной сушке Heto Lyolab-2000 (Дания). Высушенную костную ткань измельчали в фарфоровой ступке до гомогенного состояния. В гомогенате костной ткани определяли содержание минеральных компонентов – кальция и фосфатов. Минеральные компоненты определяли после сухого озоления навески кости в муфельной печи при температуре 800 С в течение 4 часов. Золу растворяли в 1 мл концентрированной хлороводородной кислоты, количественно переносили в мерные центрифужные пробирки, нейтрализовали раствором щелочи и доводили объем до 10 мл. В полученных растворах определяли концентрацию фосфатов с молибдатом аммония и кальция с о-крезолфталеином наборами реагентов фирмы «Vital Diagnostics SPb».
Способ моделирования перелома голени у лабораторных мышей
Биологическое действие фракции, полученной с помощью катионообменной хроматографии, было исследовано в эксперименте на лабораторных мышах линии СВА с переломом голени. В результате проведенного эксперимента были выявлены изменения биохимических показателей сыворотки крови и минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей на 3-и сутки после введения дозы 1 мг/кг массы животного полученной фракции. В таблице 14 представлены биохимические показатели сыворотки крови лабораторных мышей на 3-и сутки после внутрибрюшинного введения исследуемой фракции. В таблице 15 представлено содержание минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей линии СВА на 3-и сутки после внутрибрюшинного введения фракции белков костной ткани свиньи, полученной с помощью катионообменной хроматографии. Таблица 14 – Биохимические показатели сыворотки крови лабораторных мышей с моделью перелома голени на 3 сутки после внутрибрюшинного введения фракции белков костной ткани свиньи, полученной с помощью катионообменной хроматографии на колонке Shodex IEC SP-2825.
При введении фракции препарата КНБКТ свиньи, обладающей сродством к катионообменнику, животным опытной группы мы выявили достоверное понижение активности фермента остеокластов – ТрКФ, сопровождавшееся уменьшением содержания неорганического фосфата и общего кальция в сыворотке крови относительно контрольных значений, в то время как активность ЩФ оставалась в переделах значений контрольной группы. Относительно показателей интактных животных введение полученной фракции приводит к снижению активности ТрКФ, увеличению содержания общего кальция и ОБ. Увеличение содержания ОБ не вызвано введением препарата и является ответом организма на травму, так как нами не было обнаружено статистически достоверных отличий данного показателя опытной группы от контрольных значений. Таблица 15 – Содержание минеральных компонентов в костной ткани лабораторных мышей с моделью перелома голени на 3 сутки после внутрибрюшинного введения фракции белков костной ткани свиньи, полученной с помощью катионообменной хроматографии на колонке Shodex IEC SP-2825.
На 3-и сутки после перелома конечности у животных контрольной группы в костной ткани травмированной конечности наблюдалось увеличение содержания воды на 25% и снижение содержания кальция и неорганического фосфата в среднем на 16%. В опытной группе внутрибрюшинное введение фракции препарата КНБКТ свиньи, обладающей сродством к катионообменнику, на 3-и сутки после введения вызывало достоверное увеличение содержания компонентов гидроксилапатита – неорганического фосфата и кальция в костной ткани животных реципиентов по сравнению с контрольными значениями. По сравнению с интактной группой содержание кальция в костной ткани животных опытной группы было ниже, а содержание воды и неорганического фосфата возросло. Выделение фракции, обладающей сродством к катионообменнику, из препарата кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани быка С помощью катионообменной хроматографии из препарата белков костной ткани быка нами была получена фракция, элюирующаяся в интервале времени выхода 44 – 47 мин., что представлено на рисунке 13. Используя гель-проникающую хроматографию, был изучен состав этой фракции. Хроматографический профиль, полученный при гельпроникающей хроматографии фракции, выделенной с помощью катионообменной хроматографии, представлен на рисунке 14. Время выхода пиков и рассчитанная молекулярная масса компонентов фракции препарата КНБКТ быка, обладающей сродством к катионообменнику, полученные с помощью гельпроникающей хроматографии, представлены в таблице 16.
Исследование состава препаратов кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани собаки, быка свиньи и кролика с помощью ионообменной хроматографии
Для оценки остеоиндуктивных свойств мы использовали следующие биохимические показатели сыворотки крови и содержание минеральных компонентов костной ткани – активность ТрКФ и ЩФ, содержание общего кальция, неорганического фосфата в сыворотке крови и костной ткани травмированной конечности. Также мы изучали изменения показателей энергетического обмена – содержание гликогена в мышцах и печени, уровень глюкозы в сыворотки крови и активность ЛДГ. По данным критериям возможно получить информацию об интенсивности процессов, протекающих в области перелома и оценить общее биологическое действие фракций полученных препаратов костной ткани млекопитающих животных.
Исследование было проведено на 230 лабораторных мышах линии СВА. 195 мышам моделировали перелом костей голени, путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности.
Эксперимент был проведен в два этапа. На первом этапе было проведено сравнение биологического действия препаратов КНБКТ быка и свиньи. Костная ткань этих животных в настоящее время наиболее часто используется для получения остеопластических материалов (Панин А.М., 2004; Фарзин Н., 2005). Из препарата КНБКТ данных животных были получены фракции, сорбирующиеся на катионообменнике. Затем был проведен биохимический эксперимент на мышах с моделью перелома голени для сравнения остеоиндуктивных свойств полученных фракций. Забор биологического материала проводился на 3-и сутки после введения полученных препаратов костных белков.
Проведенные исследования показали, что внутрибрюшинное введение препарата костных белков свиньи вызывает значительное понижение активности ТрКФ, уменьшение содержания кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови лабораторных мышей с моделью перелома голени, сопровождающееся увеличением содержания компонентов гидроксиапатита в костной ткани. При введении препарата костных белков быка наблюдалось значительное понижение активности ТрКФ, уменьшение содержания кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови и увеличение содержания фосфата и кальция в костной ткани. Опираясь на полученные результаты, можно заключить, что данные препараты обладают подобным биологическим действием и способны оказывать стимулирующий эффект на процесс остеогенеза.
С помощью гель-проникающей хроматографии было установлено, что препараты костных белков свиньи и быка имеют идентичный состав. В составе препарата костных белков свиньи присутствует пептиды с молекулярными массами 14,248, 9,597, 2,528, 1,308, кДа. Состав препарата костных белков быка представлен пептидами с молекулярными массами 14,110, 7,913, 4,616, 2,319, 1,236 кДа.
Исходя из отсутствия значительных отличий в составе и биологическом действии полученных препаратов костных белков свиньи и быка, было принято решение более подробно изучить биологическое действие основных фракций препарата костных белков быка.
На втором этапе эксперимента было исследовано биологическое действие двух фракций препарата низкомолекулярных белков костной ткани быка обладающих молекулярными массами 6,5 и 1,3 кДа. Мы оценивали действие данных фракций на разные этапы сращения перелома голени у лабораторных мышей. Для этого забор биологического материала проводился на 3-и и 7-е сутки после разового введения полученной фракции дозой 1 мг/кг массы животного и при троекратном введении дозой 0,5 мг/кг с интервалом в 10 дней с момента первого введения.
Биохимические исследования биологического действия фракции с молекулярной массой 6,5 кДа показало следующий результат: препарат данной фракции на 3-и сутки после введения не приводит к значительным изменениям в репаративном процессе. На 7-е сутки после введения данного препарата наблюдается стимуляция процесса резорбции костной ткани. При хроническом воздействии он вызывает увеличение активности ЩФ, но значимого прироста минеральных компонентов в костной ткани не было обнаружено.
Остеоиндуктивная активность препарата фракции с молекулярной массой 1,3 кДа выше, чем у препарата с молекулярной массой 6,5 кДа. Он обладает стимулирующим действием на процесс остеогенеза. При его введении на всех этапах сращения перелома наблюдалось значительное снижение активности ТрКФ, при хроническом воздействии данный препарат вызывает максимальное увеличение активности ЩФ и значительный прирост кальция и неорганического фосфата в костной ткани.
При исследовании показателей энергетического обмена было установлено, что внутрибрюшинное введение полученных фракций КНБКТ быка не вызывает существенных изменений выбранных показателей. Таким образом, в результате проведенной исследовательской работы нами был разработан способ получения КНБКТ млекопитающих животных, были получены препараты белков костной ткани домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus). Используя хроматографические методы исследования, доказана идентичность их состава. В результате биохимического эксперимента при сращении перелома голени у лабораторных мышей линии СВА была доказана идентичность биологического действия на репаративный процесс и установлено, что данные препараты способны оказывать стимулирующее действие на процесс остеогенеза.