Введение к работе
Актуальность проблемы. Как известно, важным регулятором концентрации моноаминов в различных органах и тканях служат - моноаминоксидазы (МАО). Отклонения концентраций моноаминов от нормальных значений в значительной мере определяют ряд патологий, в том числе такие психические болезни как депрессивные и маниакальные психозы, болезнь Паркинсона, шизофрению. Одной из причин развития этих заболеваний являются нарушения в механизме функционирования МАО мозга. На основе раскрытия механизмов дезаминирования нейротрансмиттеров разработан обширный класс психотропных препаратов, широко использующихся в медицине. Наиболее изучены митохондриальные формы МАО: А и В. Это мембранно-связанные формы фермента, которые осуществляют непосредственное расщепление биогенных аминов не только в пресинаптических окончаниях нейронов ЦНС, но и в различных органах и тканях на периферии: в почках, в сердце, в легких, в соединительной ткани, в тромбоцитах и др. В плазме крови, в свободном состоянии, имеется аминоксидаза (АО) и/или растворимая форма МАО. (Горкин, 1981, Mondovi В., Riccio Р., 1990 и др.). Физиологическая роль этого энзима не выяснена с достаточной определенностью. Вероятнее всего он регулирует соотношение концентраций биогенных моноаминов в крови. Есть лишь косвенные указания на функции АО плазмы. Заведомо ограничена также информативность возможных попыток оценить ее роль путем введения в кровоток очищенных препаратов фермента и наблюдения физиологических эффектов, т.к. продолжительность циркуляции вводимых извне энзимов обычно весьма ограничена. Было бы весьма полезным выявление ее специфических фармакологических ингибиторов, но и это может лишь не намного приблизить решение задачи в силу кратковременности действия такого рода агентов и наличия ряда побочных эффектов.
Здесь особое значение приобретает метод активной иммунизации, который позволяет вызывать длительные специфические изменения активности энзима (Ашмзрин И.П., Гомазков О.А., 1989) и тем самым влиять на функционирование соответствующих систем организма. Такую возможность открывает иммунизация к препаратам гетерологичного энзима животных, входящих в те же крупные таксоны, что и реципиент. При этом родство структуры и наличие некоторых сходных энзимов ведет к образованию аутоантител к энзиму реципиента. В то же время выбор умеренного по интенсивности режима иммунизации позволяет избежать развития состояния, которое можно квалифицировать как аутоиммунное заболевание. (Ашмарин И.П., Гомазков О.А., 1989, Pshezhetsky A.V., Danilova R.A., et at.
2 1993). Этот подход обеспечивает длительную модуляцию активности энзима, что в свою очередь оказывает определенное влияние на физиологические параметры состояния организма. Во-первых, образуя с энзимом в плазме крови прочный комплекс, они могут его инактивировать и способствовать его элиминации (Ашмарин И.П., Данилова РА, Машковский М.Д. и др., 1989). Во-вторых, не исключена возможность проникновения небольшой доли аутоантител к аминоксидазе плазмы через гематоэнцефалический барьер и далее внутрь клеток. Если имеется хотя бы частичное родство структур аминоксидазы плазмы с митохондриальными МАО А и В, то возможно воздействие таких антител и на процессы контролируемые этими энзимами. Современные данные допускают возможность таких миграций антител при условии их длительной циркуляции в крови, даже если на пути мишени стоит гематоэнцефалический барьер (Passaro Е. et all., 1982, Bates I., 1985).
Цель исследования: изучить возможные влияния уровня аминоксидазы плазмы на некоторые общие характеристики активности ЦНС и на мнестические процессы у белых крыс при прямом системном введении, а главное, при использовании метода активной иммунизации к ферменту из филогенетически родственного источника - плазмы быка. В работе решались следующие задачи;
1. Изучить влияние АО плазмы при прямом системном введении:
а) на двигательную активность крыс в открытом поле
б) на уровень тревожности животных в тесте крестообразный приподнятый лабиринт.
-
Оценить влияние активной иммунизации к аминоксидазе плазмы быка на аминоксидазную активность плазмы крови крыс.
-
Выяснить возможные изменения активности МАО типов А и В в мозге крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы.
-
Используя метод активной иммунизации, как способ длительно действующей специфической модуляции активности энзима, исследовать влияние АО плазмы на двигательную активность, эмоциональное состояние и на мнестические процессы у белых крыс с помощью формирования условно-рефлекторных реакций активного и пассивного избегания.
-
Изучить возможные влияния иммунизации к АО плазмы на состояние моноаминергических систем мозга.
Научная новизна работы. Впервые проведена серия работ по изучению возможного участия аминоксидазы плазмы в регуляции поведения. Показано угнетение двигательной активности при системном введении фермента, не связанное с появлением чувства тревожности и страха.
Впервые использован метод иммуносупрессии для подавления активности аминоксидазы плазмы крови у крыс и регуляции мнестических функций на примере формирования условно-рефлекторных реакций активного и пассивного избегания. В нейрохимических исследованиях показана гетерогенность влияния иммунизации к аминоксидазе плазмы крови на активность мопоаминергических систем мозга, выражающаяся в значительном угнетении активности митохондриальной МАО А в структурах мозга, тогда как активность МАО В практически не изменялась.
Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований позволяют использовать метод активной иммунизации к гетерологичным энзимам для длительного изменения активности эндогенных регуляторов. В принципе возможно использование иммунизации к легко выделяемой аминоксидазе плазмы для подавления активности митохондриальной МАО А аналогично антидепрессантам-ингибиторам МАО А, что может представлять интерес для медицинской практики при лечении заболеваний, связанных с нарушениями психических функций. Преимущества этого метода заключаются в длительном действии препарата, достигаемом всего лить двукратным введением антигена.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 2-ом Всероссийском съезде Биохимического общества (Москва, 1997), на XXXI11 Международном конгрессе по физиологическим наукам (С.Петербург, 1997), на Всероссийской конференции Изменчивость и поведеіше животных (Борок, 1997), на заседании Московского отделения Нейрохимического общества России (ноябрь, 1997). Материалы диссертации вошли в 3 научные публикации.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 167 наименований, в том числе 94 на иностранных языках, иллюстрирована 29 рисунками и 9 таблицами.
Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах (питомник «Крюково», по характеристикам близкие к крысам линии Вистар) с начальным весом 120-150 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Использовался препарат аминоксидазы плазмы крови быка (monoamine oxidase from bovine plasma, substrate - benzylamine) фирмы SIGMA - EC 1.4.3.4; № M4636 (активность препарата: 0.002 UNITS/ мг).
Введение препарата. Внутривенное введение. Раствор аминоксидазы плазмы вводили в хвостовую вену в дозе 40 мкг из расчета 0,2 мл на животное. Животные контрольной
4 группы получали эквивалентное количество физраствора. Иммунизация крыс к аминоксидазе плазмы быка. Первичная иммунизация к аминоксидазе плазмы проводилась с помощью внутривенного введения раствора фермента в хвостовую вену крыс в дозе 40 мкг. Животные контрольных групп получали эквивалентное количество физраствора. Вторичная иммунизация: через 14 дней после первого введения антигена животным опытных групп вводилось по 0.4 мл смеси равных объемов раствора аминоксидазы плазмы и полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) из расчёта 800 мкг фермента на 1 кг веса. В качестве контроля использовалось 2 группы животных: 1-ой вводили эквивалентное количество смеси ПАФ и физиологического раствора; 2-ой - только физиологический раствор. Смесь вводилась подкожно в 4 точки спины. Через 2 недели проводилась реиммунизация. Поведенческие эксперименты начинались не ранее, чем через 2 недели после реиммунизации.
Измерение веса животных и ректальной температуры. В ходе работы контролировался вес экспериментальных животных; вес измерялся непосредственно перед началом экспериментов и далее раз в месяц до их окончания. Измерение ректальной температуры поводилось через 2 месяца после первичной иммунизации.
Двигательная активность крыс в открытом поле исследовалась с помощью автоматической камеры РОДЭО-2, где регистрировались: уровень вертикальной активности (число заглядываний в верхние норки), уровень горизонтальной активности (число пересечений квадратов на полу камеры), количество центральных стоек и уровень норковой активности (число заглядываний в норки, расположенные в полу камеры). Эксперимент проводился в течении 10 минут с поминутной и суммарной регистрацией. В открытом поле тестировались все животные как после внутривенного введения препарата МАО (через 7 часов после введения и через 1,3,5 - 21 суток), так и после иммунизации.
Уровень тревожности животных исследовался с помощью крестообразного приподнятого лабиринта (КПЛ). КГОІ представляет собой крестообразную платформу, приподнятую над полом на расстоянии 80 см с четырьмя радиальными лучами шириной 10 см и длиной - 45 см, расположенными под углом 90 относительно друг друга. Одна пара несоединенных лучей имеет боковые стенки высотой 10 см, в другой паре лучи полностью открыты. Через сутки после внутривенного введения препарата аминоксидазы плазмы и через два месяца после первичной иммунизации проводили эксперимент. Во время опыта каждое животное помещали индивидуально в центральную часть платформы головой в сторону открытого луча и в течении 5 минут регистрировали следующие показатели: количество посещений открытых и закрытых лучей, количество заходов в открытые лучи, количество заглядываний в открытые лучи, время нахождения на открытых лучах, время
5 замирания, суммарное время и количество актов груминга, количество стоек, количество дефекаций, количество переходов из луча в луч, число нереализованных попыток выхода в открытые лучи, суммарное время пассивного поведения. Во время тестирования два наблюдателя находились на расстоянии не менее полуметра от лабиринта.
Выработка условного рефлекса активного избегания (УРАЮ проводилась по стандартной методике в челночной камере через 2 месяца после первичной иммунизации. Выработка условного рефлекса происходила в течении 21 дня по 20 предъявлений в опыт. Между 6-ым и 17-ым днями эксперимента был сделан 10-ти дневный перерыв. В каждом предъявлении включался условный раздражитель - звук (800 Га), через 10 сек на фоне звука включался безусловный раздражитель - ток (U=220v, 1=1-2 mA, 10 сек), переход животного на звук приводил к невключению тока в данном предъявлении. Ток выключался либо вместе со звуком (в момент перехода крысы в другую половину камеры), либо через 10 секунд после начала его подачи. После выключения обеих раздражителей следовал межсигнальный интервал длительностью 15 сек. В ходе опыта регистрировалось: число реакций избегания (на звук), число реакций избавления (на ток), количество непереходов, число межсигнальных реакций и латентный период. Критерием обученности служило достижение 80% положительных реакций в опыт.
Выработка условной реакции пассивного избегания (УРГПТ) проводилась через 2 месяца после первичной иммунизации по стандартной методике. Экспериментальная камера была разделена на два отсека - тёмный и светлый. Животное помещалось в светлый отсек камеры. В силу своей биологической склонности животное переходило в тёмный отсек камеры, где получало удар током (U=220 v., 1=2 mA). Затем крыса вынималась из камеры. На следующий день проверяли сформированный навык. Животное помещали в светлый отсек камеры и засекали время до захода в темный отсек. Максимальное время нахождения в светлом отсеке равнялось 300 сек. В качестве проверки сохранности полученного навыка, через 45 дней крыс повторно тестировали в камере для выработки УГОН
Титр антител к аминоксидазе плазмы быка в сыворотке крови экспериментальных животных определялся с помощью иммуноферментного метода (ELISA). Для получения сыворотки использовался 1 мл крови, взятой из яремной вены, у 5 крыс из каждой группы. Кровь центрифугировалась в течении 10 минут при 3500 об/мин. Сыворотки хранились в замороженном виде при температуре -18 С. Иммуноферментный анализ сывороток был произведен K.6.H. М.Ф.Обуховой.
Определение аминоксидазной активности плазмы крови крыс. Для определения аминоксидазной активности плазмы крови крыс, типовым субстратом для которой является
бешиламин, основываясь на методе радиометрического определения активностя моноаминоксидазы (Пеккель, Киркель, 1985), были подобраны оптимальные условия определения бензиламиноксидазной активности плазмы контрольных животных. Для анализа использовано по 5 мл гепаринизированной крови 10 крыс, иммунизированных к аминоксидазе плазмы быка, и по 5 контрольных, получавших смесь ПАФ и ФР и чистый ФР. Выделение плазмы из экспериментальных проб проводилось в центрифуге К-24 при 0 "С (7500 об/мин, 40 мин). Работа проводилась в лаборатории «Биохимии аминов я других азотистых оснований» института Биомедицинской химии РАМН под руководством и при участии д.б.н. Т.А. Москвитиной.
Определение активности МАО-А и МАО-В в мозге. После окончания формирования реакции активного избегания у экспериментальных животных проводилось исследование активности моноаминоксидазы А и В в митохоидриальных фракциях сенеомоторішй области коры и хвостатого ядра мозга крыс, выделенных путем дифференциального центрифугирования гомогенатов ткани в 10% градиенте сахарозы, в лаборатории Цитохимии Института Мозга РАМН под руководством и при участии д.б.н. Е.Л.Доведовой по следующим методикам: активность МАО типа А определялась по методике V. Popov et al., 1971, активності. МАО типа В определялась по методике В.З.Горкина и соавт., 1967. Определение содержания дофамина (ДА), норадреналина (НА), ееротонина (5'-НТ) и продукта конечного обмена ееротонина - 5'-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) проводилось флуометрически в гомогенатах указанных отделов мозга по методике Когана Б.М., Нечаева Н.В., 1979.
Статистическая обработка результатов. Результаты всех серий экспериментов обрабатывались с помощью пакета статистических программ STADIA, разработанном на кафедре физиологии высшей нервной деятельности, с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни-Вилкоксона и Ван-дер-Вардена, Графическая обработка данных проводилась с использованием графического редактора Microsoft Excel.