Содержание к диссертации
Введение 5
Глава 1. Электрофизиологические характеристики эпителия различных сегментов кишки крысы
Обзор литературы 9
Специфические методические особенности экспериментов 20
1.3. Электрофизиологические характеристики различных сегментов
кишки крысы 28
Изменение трансэпителиального сопротивления и тока короткого замыкания при длительной инкубации 34
Обсуждение 37
Глава 2. Исследование экспрессии клаудинов в эпителии кишки крысы с помощью Вестерн-блот анализа
Обзор литературы 41
Специфические методические особенности экспериментов 67
Экспрессия клаудинов в эпителии кишки крысы 70
Обсуждение 77
Глава 3. Локализация белков плотных контактов в эпителии кишки крысы
Обзор литературы 89
Специфические методические особенности экспериментов 91
Распределение клаудинов по оси ворсинка — крипта или люминальная поверхность - крипта в эпителии кишки крысы 93
Субклеточная локализация клаудинов в эпителиоцитах кишки крысы 97
3.5. Обсуждение Г 106
Глава 4. Влияние холерного токсина на проницаемость эпителия и структуру плотных контактов различных отделов кишки крысы
Обзор литературы 112
Специфические методические особенности экспериментов 123
Изменение электрофизиологических показателей в различных отделах кишки под действием холерного токсина, теофиллина и буметанида 125
Изменение уровня экспрессии клаудинов в эпителии толстой кишки крысы под воздействием холерного токсина и
теофиллина 134
4.5.Обсуждение 134
Заключение 140
Выводы 141
Список литературы 142
Список сокращений:
30-1 - зонула окклюденс-1
30-2 — зонула окклюденс-2
ЗО-З - зонула окклюденс-3
ИЛ-6 — интерлейкин-6
ИЛ-13 — интерлейкин-13
ИФН-у - интерферон у
Клдн — клаудин
Оккл - окклюдин
ТЭС — трансэпителиальное электрическое сопротивление
ФНО-а - фактор некроза опухоли а
ENaC - эпителиальный натриевый канал
ПКА - протеинкиназа А
CFTR — муковисцидозный трансмембранный регулятор
ГЭБ — гематоэнцефалический барьер
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение процессов транспорта веществ, ионов и воды через эпителий кишки является актуальной проблемой современной физиологии висцеральных систем. Транспорт ионов через эпителий может осуществляться по трансцеллюлярному и по парацеллюлярному пути. Механизмы трансцеллюлярного транспорта изучены подробно (Ugolev et al., 1985; Тимофеева и др., 2000; Marples, 2001; Drozdowski et al., 2006; Gilbert et al., 2008). В случае парацеллюлярного транспорта веществ важная роль принадлежит комплексам плотных контактов, разделяющих апикальный и базолатеральный домены плазматических мембран и объединяющих эпителиоциты в единый пласт. Долгое время вопрос о существовании селективной межклеточной диффузии оставался неясным. Изучение данной проблемы стало возможным после выявления различных молекулярных компонентов плотных контактов. Трансмембранный белок окклюдин является их структурной основой (Furuse, 1993). Представители семейства клаудина, в котором насчитывают 24 белка (Furuse, 1998), обеспечивают барьерные свойства эпителия и участвуют в осуществлении селективной межклеточной диффузии. Показано, что клаудины -2, -7, -12, -15 и -16 могут формировать селективные ионные поры (Amasheh, 2002; Alexandre, 2005; Fujita, 2008) и таким образом осуществляют селективную межклеточную диффузию. Некоторые белки (клаудины -1, -3, -4, -5, -8 ,-14, -18, -19) снижают проницаемость эпителия (Van Itallie, 2006; Furuse, 2002; Wolburg, 2003; Angelow, 2007; Amasheh, 2008).
Вклад белков плотных контактов представляется важным аспектом в изучении проницаемости эпителия. Кроме этого эпителий кишки является удобной моделью для уточнения роли отдельных белков плотных контактов в осуществлении парацеллюлярного транспорта, так как эпителий разных отделов кишки имеет морфофункциональные отличия. К настоящему времени известны фрагментарные сведения об экспрессии клаудинов в
кишечном эпителии (Rahner, 2001; Amasheh, 2005; Fujita, 2006; Chiba, 2008). Однако до сих пор комплексного изучения роли белков семейства клаудина в реализации межклеточного транспорта в кишечном эпителии не проводилось.
Для анализа вклада отдельных клаудинов в межклеточный транспорт представлялось целесообразным использование теофиллина и холерного токсина, усиливающих, как известно, поток электролитов в полость кишки крысы.
Целью данной работы являлось изучение экспрессии белков плотных контактов и их функциональной роли в эпителии различных отделов кишки.
Задачи исследования:
1. Сопоставить электрофизиологические характеристики сегментов
различных отделов кишки.
2. Провести сравнительный анализ экспрессии белков плотных контактов
в эпителии двенадцатиперстной, тощей, подвздошной и толстой кишки.
3. Изучить локализацию белков плотных контактов в эпителии кишки.
4. Исследовать проницаемость эпителия и экспрессию клаудинов при
действии холерного токсина и теофиллина.
Научная новизна. Впервые на основе электрофизиологических, молекулярных, иммуноцитохимических методов было проведено комплексное исследование белков плотных контактов в эпителии кишки крысы. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что экспрессия этих белков коррелирует с электрофизиологическими показателями, отражающими интенсивность ионного транспорта в различных отделах кишки. Показано, что в разных отделах кишки существуют отличия в пространственном распределении клаудинов в эпителиоцитах и в различных участках эпителиального пласта. Определено влияние теофиллина и холерного токсина, повышающих концентрацию цАМФ в клетке и обеспечивающих транспорт электролитов в просвет кишки, на
изменение проницаемости эпителия различных отделов кишки и на экспрессию белков семейства клаудина.
Научно-практическая значимость работы. В результате проведенного исследования получены данные, которые позволяют расширить теоретическое представление о парацеллюлярном транспорте электролитов через эпителий в различных отделах кишки. Результаты, полученные в ходе комплексного исследования белков плотных контактов, позволяют уточнить их роль в осуществлении межклеточного транспорта через кишечный эпителий. Данная работа имеет фундаментальное значение для физиологии висцеральных систем. Результаты диссертации используются в курсах лекций по физиологии, читаемых на биолого-почвенном факультете Санкт-Петербургского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту.
1. Ионопроницаемость эпителия различных отделов кишки определяется
комплексом показателей: электрофизиологическими характеристиками,
уровнем экспрессии белков семейства клаудина и их распределением в
пределах эпителиоцита и в различных участках эпителиального пласта.
В проницаемом эпителии тонкой кишки обеспечение селективной межклеточной диффузии может быть связано с экспрессией клаудинов -2, -7 и -12. В непроницаемом (плотном) эпителии толстой кишки барьерные свойства эпителия обеспечиваются экспрессией клаудинов -1, -3, -4, -5, -8 и -18.
Холерный токсин влияет на ионопроницаемость эпителия через изменение экспрессии белков плотных контактов.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на XX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007 г.), на VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008 г.), на 18-й и 19-й Международных Студенческих
конференциях (Берлин, 2007 и 2008 гг.), на Конференции Европейского общества по изучению эпителиального транспорта (Памплона, Испания, 2008 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, каждая из которых включает в себя обзор литературы, методические особенности экспериментов, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источника. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 33 рисунками.
Работа поддержана грантом РФФИ 06-04-49054а и грантом немецкого фонда научных исследований (DFG) Fr 652/8-1.
