Введение к работе
- I -Актуальность темы.
"..."В последние десятилетия в изучении механизмов межнейрон-пого ^взаимодействия достигнуты значительные успехи (Ессіев, 1986*;""Шаповалов, Ширяев, 1987; Shapovalov, 1988). Однако многие важные вопросы, касающиеся синаптической передачи в ЦНС позвоночных, остаются невыясненными. Двже на таком классической объекте, как спинальный мотонейрон, до сих пор есть ряд неясных моментов в трактовке ионных механизмов возбуждающих постсинапти-ческих потенциалов (ВПСП), идентификации возбуждающих передатчиков и модуляторов,' не говоря уже о роли отдельных ионных каналов и взаимодействии передатчиков с рецепторами. В частности, на препарате изолированного спинного мозга лягушки показано, что синаптическая передача осуществляется посредством химического и электрического механизмов (Shapovalov et al., 1978). Однако недоставало необходимого звена в доказательстве химической передачи -реверсии ВПСП под влиянием деполяризации. На основании опытов с изменением ионного состава среды было сделано" предположение о тон, что ВПСП генерируется преимущественно .натриевым током, однако из-за методических трудностей не был измерен потенциал реверсии ВПСП, являющийся важной количественной характеристикой, отражающей ионный состав генерирующего его тока.
В настоящее время одним из вероятных возбуждающих медиаторов в ЦНС считается глутаиат (Watkins, EvanB, 1981; Fagg, Footer, 1983; Fonnum, 1984). Однако строгое доказательство ыедиатсркоЗ функции глутаматэ получено только для насекомых (Anwyl, 1977; UBhenrood, 1977, 1978; Ueherwood et al., 1984; Cull-Candy et al., 1981, 1982, 1987). В ЦНС позвоночных такое доказательство долгое время было затруднено из-за отсутствия мощных избирательных антагонистов возбуждающих аминокислот. Не была получена и реверсия возбуждающего ответа, вызываемого аппликацией глутамата к мембране ыотонейрона спинного мозга, что являлось пробелом в доказательстве, основанном на критерии идентичности действия (STerman, 1980).
В последние годы появились многочисленные данные, подтверждающие глутвматергичеокую природу передачи в головном мозгу млекопитающих, где найдены разные типы глутаыатких рецепторов (Watkins, EvanB, 1981; Foster, Fagg, 1984; Monagham et al., 1989; Дамбинова, 1989). Однако для спинного мозга подобного рода данные весьиа отрывочны и разноречивы (Evans et al., 1979;
-2-Corradettl et al., 1985; Fletcher et al., 1988).
Важность интегративной функции мотонейрона не вызывает сомнения, однако иеханизмы его активации через разные возбуждающие входы почти не изучены. Практически ничего не известно относительно различия или сходства между супраспинальныц и сенсомо-торныы входами с точки зрения ионного механизма генерации постси-наптических потенциалов и участвующих в синаптической передаче медиаторов.
Учитывая все это, представлялось необходимым исследовать ноіший механизм генерации ВПСП и возиоануш медиаторную функцию глутамата в различных аозОуздающих входах нотонейрона лягушки. .
Модель для подобного рода исследований - мотонейрон изолированного спинного иозга лягупки с разными скнаптическими входа-121 - Сила разработано а нашей лаборатории (Ширяев, 1972). Относительно цехи данной работы предстояло расширить бозікшюєти этой модели, приманив иетод одноэлектродной транздшмбрашюй поляризации с помощью прерывистого поляризующего тока и дискретного измерения урош'ш иеибрглшого потенциала (Щ) в паузах этого тока (НІІБОП, Goldner, 1975; Курчавый, Рябов, 1984). Этот иетод позволяет непосредственно измерить потенциалы реверсии, что до сих пор иа цотонейронах лягуыки сделать не удавалось. .
В наыих экспериментах фармакологическое исследование было начато с изучения действия недавно открытого вещества - ергиопи-на, ннзкоцолекулярного компонента яда паука , известного как блокатор глутаиат-актнвпруеиых каналов у насекомых (Магазаник и др., 1986; Jackson, Uehenvood, 1988). Аргиогаш и другие известные антагонисты глутамата была использованы для анализа природа химического иедиатора и типов рецепторов, опосредующих передачу в исследуемых входах мотонейрона. Такой комплексный подход дает возможность решать вопросы, которые не только имеют теоретическое значение, но и позволяют приблизиться к разработке целенаправленного фармакологического воздействия на определенные механизмы нервной системы, что мохет иметь практическое значение в клинической практике. Цель работы.
. Целью настоящей работы являлось изучение механизма генерации возбуждающих постсинаптических потенциалов в мотонейроне лягушки, исследование предполагаемой медиаторной роли глутамата, а также сравнение разных синаптических возбуждающих входов.
.-3-
Основные задачи.
-
Исследовать зависимость моносинаптических ВПСП, полученных в мотонейроне при активации разниг. возбулдащих входов и ответов, вызываемых никроаппликацией глутаматп к меїлбране от уровня мембранного потенциала. Проверить, реверскруэт ли эти ответы при деполяризукцеи сыецепии неубранного потенциала, о такте непосредственно измерить их потенциалы реверсіп! в одной п той Tie клетке.
-
Для этого освоить применительно к нотонейрону лягуилга методику , позволясап/D с помоцъп одного и того пе микроэлектрода смещать неубранный потенциал путей пропускания прэривпстого трансмембранного тока и измерять непосредствеїшо уровень мембранного потенциала и физиологический ответ клетки а паузах этого поляразукзего тока.
-
Изучить из иотонейронэ хпгушсі действие вргиопинз - нового Избирательного антагониста глутсішта.
' 4. Исследовать постсинаптнчзскиа реакции, возникавшие в мотонейроне в ответ на аппликация глутамата и его агошетов, а твіезе влияшіе на них антагонистов возбуздазггда аминокислот.
-
Исследовать влияние антагонистов возбуяданцях аминокислот па ВПСП, генерируете при актнвзцяи разных синаптнческих входов.
-
Сопоставить результата исследования потенциалов ревєрсіш и исследования еффектов антагоїшстоз, попитаться реігить вспрос о зкютеской природе гладиатора и типах рецепторов, которые опосредуют синаптическую передачу в разных возбуздзгецих входах кото-нейрона лягугкн.
Научная новизна.
Впервые получено такое ванное доказательство химического' механизма передачи з разных возбуддвкцих сииэптических входах иотонейронэ лягушки как истинная реверсия возбуждающих постсинап-тнчэских потенциалов под вліяниеіл трансмеыбрашгой деполяризации. Впервые получена пстнтшя реверсия постскнаптнческого ответа, вызываемого иикроаплликацией глутамата к разным участкам мембраны уотсиейрона. Непосредственно измерены потенциалы реверсии ВПСП п глутанатшх ответов. Потенциалы реверсии ВПСП п глутаматкнх ответов, измеренные в одной и той re клетке, близки по величине. Полученные значеіглп потенциалов реверсии соответствует представлению о слабоселективных иенннх каналах н участші в возбуждающей токе ионов натрия и калия. Измеренные во время глутаматного от-
-4-вета изменения проводимости мембраны оказались незначительными, что свидетельствует против участия ионов хлора в генерации данного ответа. . Установлено, что аргиопин, блокатор глутамат-активируешх каналов у насекомых, у лягушек также является избирательный блокаторои не-НМДА рецепторов, скорее всего квисква-латиых. Показано (влектрофизиологически и фариакологически), что супраспинальный (ретикулоспинальный) и сенсоиоторный входы ыото-нейрона имеют глутаматергическую природу и опосредуются рецепторами не-НМДА типа. В то же время фармакологически обнаружена гетерогенность гтих возбуждающих ионосинаптических входов в отношении влияния на них аргиопина. Ретикулоспинальный вход, по-видимому, опосредуется преимущественно квисквалатными рецепторами, сенсоиоторный вход - каинатными. Научно-практическое значение.
Результаты проведенного исследования имеют значение для общей нейрофизиологии, нейрофариакологии и физиологии нервной клетки.
Полученные факты значительно уточняют и расширяют имеющиеся представления об общих принципах, функциональной организации иежнейрокных синоптических связей в центральной нервной системе Позвоночных, в частности, о механизмах генерации. возбуждающих синаптических потенциалов, о природе и действии возбуждающих иедиаторов, о типах постсинаптических рецепторов, опосредующих синаптическую передачу. Результаты настоящей работы вносят существенный вклад в решение вопросов, связанных с разработкой целенаправленного фармакологического воздействия на определенные механизмы нервной системы, что имеет большое значение в клинической практике.
В- работе содержатся также сведения, важные для изучения функциональной организации и'эволюции глутаматных рецепторов.
Апробация работы, публикации.
Материалы диссертации были доложены на IX Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986), на смотре-конкурсе работ молодых ученых и специалистов Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР (Ленинград, 1986, 1988), на XV. съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987), на Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах'' (ІІущино,- 1989), на XII ежегодной совещании Европейской Ассоциации по Нейронаукаи
(Турин, Италия, 1989). По материалам диссертации опубликовано II работ.
Структура и объем диссертации.