Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Эффекты нонапептидов нейрогипофиза в целом организме (обзор литературы) 10
1.1. Гормоны нейрогипофиза у позвоночных 10
1.2. Регуляция синтеза и секреции аргинин-вазопрессина и окситоцина 14
1.3. Рецепторы нейрогипофизарных нонапептидов 19
1.4. Аналоги гормонов нейрогипофиза и агонисты рецепторов вазопрессина, используемые в клинической практике 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования 34
2.2. Формы физиологического эксперимента 34
2.3. Лабораторные методы исследования 37
2.4. Формулы и расчеты 39
2.5. Статистическая обработка данных 40
2.6. Химические реактивы 41
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Влияние аргинин-вазопрессина и аргинин-вазотоцина на экскрецию катионов почкой крыс 42
3.2. Выведение ионов и воды почкой in vivo при селективной стимуляции V-рецепторов 59
3.2.1. Изучение эффекта селективной стимуляции V1а-рецепторов на выведение ионов и воды почкой крыс 59
3.2.2. Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады каналов и транспортеров натрия в нефроне 64
3.2.2.1. Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады Na, Cl-котранспортера гипотиазидом 65
3.2.2.2. Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады эпителиальных натриевых каналов 68
3.2.2.3. Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады Na, K, 2Cl-котранспортера 68
3.2.2.4. Сравнительная оценка эффекта агониста V1a-рецепторов, дезамино вазотоцина и фуросемида на экскрецию ионов натрия почкой 71
3.2.3. Исследование экскреции катионов почкой крыс при селективной стимуляции V2-рецепторов 77
3.2.4. Исследование эффекта инъекции калийуретического нонапептида при блокаде V1b-рецепторов селективным антагонистом 82
3.3. Исследование роли различных подтипов V-рецепторов на осмо- и ионовыделительную функции почки при нагрузке гипертоническим раствором NaCl 83
3.3.1. Исследование изменения экскреции катионов и воды при гиперосмии, вызванной гипернатриемией 83
3.3.2. Изучение и оценка эффекта селективной блокады V1а- и V2-рецепторов на выведение катионов при гиперосмии, вызванной гипернатриемией 86
3.3.3. Изучение эффекта введения дезамино-вазотоцина, фуросемида и агониста V1a-рецепторов в поддержании водно-солевого баланса при гиперосмии, вызванной гипернатриемией 90
3.4. Подходы к оценке эффективности применения салуретических средств 94
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 98
Выводы 109
Список сокращений и условных обозначений 110
Список литературы
- Рецепторы нейрогипофизарных нонапептидов
- Лабораторные методы исследования
- Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады каналов и транспортеров натрия в нефроне
- Исследование экскреции катионов почкой крыс при селективной стимуляции V2-рецепторов
Рецепторы нейрогипофизарных нонапептидов
Синтез вазопрессина происходит в несколько этапов. У млекопитающих в нейросекреторных ядрах, помимо аргинин-вазопрессина, секретируется окситоцин [83, 232, 264]. Концепция нейросекреции была основана на открытии больших гранулярных клеток, которые впоследствии были названы крупноклеточными нейронами и были найдены в гипоталамусе костистых рыб Phoxinus laevis [208]. Процесс нейросекреции включает синтез гормонов и их накопление в нейросекреторных гранулах и перикарионе, движение гранул по нервным волокнам и их хранение в терминалях аксонов в нейрогипофизе до освобождения в сосудистое русло под влиянием соответствующих импульсов. В начале 70-х годов XX столетия стало известно, что синтез нонапептидов нейрогипофиза осуществляется в ядрах гипоталамуса [202] в виде молекул-предшественников [110, 172], транспортируемых со специфическими белками-переносчиками нейрофизинами по аксонам нейронов в заднюю долю гипофиза [45, 46, 47, 101], где гормоны депонируются и секретируются в кровь. У человека найдено 2 нейрофизина, у некоторых животных, в том числе у свиней – 3 [241, 266]. Cys в 1 и Tyr во 2 положении в молекуле окситоцина и аргинин-вазопрессина необходимы для связи с нейрофизинами. Предшественник окситоцина (препро-окситоцин) связывается с
нейрофизином-I. Предшественник аргинин-вазопрессина происходит из молекулы предшественника, который начинается с сигнальной части, отделяемой Aln от про-вазопрессина, состоит из 164 аминокислот и имеет массу 17423 кДa [94]. Он представляет собой сигнальный пептид, аргинин-вазопрессин, нейрофизин II и копептин (Рисунок 2). Копептин – гликопептид из 39 аминокислот, является С-концевой частью прогормона вазопрессина, секретируется в эквимолярном вазопрессину количестве, остается стабильным несколько суток [164].
Рисунок 2. Строение молекулы-предшественника аргинин-вазопрессина.
Пептид-предшественник синтезируется в крупноклеточных нейронах, поступает в эндоплазматический ретикулум, где удаляется сигнальный пептид и добавляется углеводородная цепь. Дополнительный пострансляционный процессинг происходит во время транспорта к терминали аксона в задней доле гипофиза, где ферментативно отщепляются аргинин-вазопрессин, копептин и нейрофизин II, которые сохраняются в нейросекреторных гранулах, пока не поступят специфические стимулы для секреции в кровь кальций-опросредованным экзоцитозом [4].
Окситоцин синтезируется в первую очередь крупноклеточными нейросекреторными клетками в гипоталамических паравентрикулярном и супраоптическом ядрах. Аксоны клеток поступают в заднюю долю гипофиза, где окситоцин высвобождается в системное циркуляторное русло таким же путем, как и аргинин-вазопрессин. Крупноклеточные нейроны секретируют нонапептиды из перикариона, дендритов и/или аксонных терминалей [140, 142]. Аргинин-вазопрессин секретируется в паравентрикулярном, дополнительном, супраоптическом ядрах, также его секреция выявлена в супрахиазматическом ядре [69, 70, 157, 223]. Нейроны супраоптического ядра дают проекции в паравентрикулярное ядро [213], обнаружено существование двусторонних связей между ними [48, 75]. В опытах на хомяках [166] и в экспериментах на крысах [69, 223] была отмечена проекция нейронов супрахиазматичекого ядра в паравентрикулярное. Окситоцин секретируется не только из окончаний аксонов в гипофизе, но он также высвобождается из дендритов или клеточных тел в гипоталамусе [146, 171].
Концентрация окситоцина и аргинин-вазопрессина во внеклеточной жидкости супраоптического ядра, вследствие соматодендрического высвобождения, может достигать увеличения в 100 и 1000 раз в сравнении с базальной концентрацией в плазме крови [137]. Высвобождение нонапептидов нейрогипофиза из ядер происходит в ответ на различные стимулы, включая прикладывание ребенка к груди после родов, кровопотерю, спаривание, лихорадку, введение гипертонических растворов. Определенные виды стресса: ограничение физической активности, боль, длительная дегидратация и др., могут стимулировать высвобождение нонапептидов нейрогипофиза [8, 29, 41, 147, 149, 196].
Различные нейротрансмиттеры и нейромодуляторы из циркумвентрикулярных органов, включая -аминомасляную кислоту, норадреналин, глутаминовую кислоту, натрийуретический пептид, ангиотензин II влияют на функции крупноклеточных нейронов. Прямая регуляция андрогенами и эстрогенами происходит в ложе ядер терминальной полоски и миндалины. Различные пептидные гормоны, такие как галанин, энкефалин, нейропептид Y, вазоактивный интерстинальный пептид, динорфин, также колокализованы в крупноклеточных нейронах и вовлечены в регуляцию высвобождения вазопрессина и окситоцина [116].
Образовавшиеся в перикарионах гипоталамических нейронов нейросекреторные гранулы мигрируют по отросткам с постоянным током аксоплазмы и накапливаются в терминалях в задней доле гипофиза. Полагают, что по мере продвижения нейросекрета от тел гипоталамических нейронов до окончаний их аксонов изменяется химический состав нейросекрета, происходит его созревание. Из нейросекреторных окончаний вазопрессин и окситоцин выделяются в кровоток задней доли гипофиза. В задней доле гипофиза имеются многочисленные расширения аксонов – тельца Герринга, в которых содержатся гранулы секретируемого вещества. Каждая нервная клетка синтезирует только один гормон. Гипоталамические секреторные нейроны, где синтезируются пептидные гормоны аргинин-вазопрессин и окситоцин, называют пептидергическими [285]. Секреция вазопрессина происходит по 3 путям: 1) из супраоптического гипофизарного тракта к задней доле гипофиза, откуда гормон поступает в кровь, 2) из внешней зоны срединного возвышения в гипофизарный портальный кровоток, 3) в спинномозговую жидкость III желудочка [268]. Гипофиз содержит нервные окончания крупноклеточных нейронов, чьи клеточные тела лежат в гипоталамусе, но вне гематоэнцефалического барьера. Нонапептиды, высвобождающиеся из этих клеток, попадают прямо в кровь [139].
Секреция окситоцина у бесчелюстных происходит в крупноклеточных нейросекреторных нейронах. Эти нейроны лежат в стенке III желудочка гипоталамуса, составляющего одну гипоталамическую структуру – преоптическое ядро. Это ядро в дальнейшем преобразовалось у позвоночных в паравентрикулярное и супраоптическое ядра с дополнительным ядром между ними. Гранулярного типа клетки, содержащие окситоцин- и вазопрессин-подобные вещества были визуализированы у различных позвоночных. Эти клетки развились в сенсорные, нейросекреторные и интернейроны. Индивидуальные крупноклеточные нейроны претерпели процесс трансформации от уни- или биполярных нейронов в высокодифференцированные нервные клетки. В связи с микроанатомическими и цитологическими изменениями нейронов, секреция окситоцина в цереброспинальную жидкость сменилась на его преимущественную секрецию в сосудистое русло. Тем не менее, наиболее существенным отличием в прогрессивной трансформации окситоциновой и вазопрессиновой систем стало расширение проекций аксонов в передние отделы головного мозга, что привело к усложнению строения гипоталамуса [67]. Существует ненейронные источники секреции окситоцина. Основные из них – клетки Лейдига в яичках, эпидидимис, предстательная железа, желтое тело яичника, матка, плацента и надпочечники [18].
Основным стимулом секреции вазопрессина является дегидратация и уменьшение объема рецепторных клеток [88, 152]. Основной локус секреции аргинин-вазопрессина в головном мозге млекопитающих при повышении осмоляльности сыворотки крови – сосудистый орган терминальной пластинки (OVLT), но крупноклеточные нейросекреторные клетки супраоптического ядра также имеют собственные осморецепторы [59]. Дегидратация воспринимается каналами транзиторного рецептора ванилоидного типа, которые встроены в плазматическую мембрану крупноклеточных нейронов, а также в осмочувствительные клетки OVLT [43]. Клетки OVLT – идеальные осморецепторы [58]. Сокращение клетки во время дегидратации приводит к образованию потенциала действия в крупноклеточных нейронах на клеточном теле OVLT, который распространяется по аксонам. Деполяризация терминалей нерва запускает экзоцитоз крупных плотных везикул, которые высвобождают аргинин вазопрессин в кровоток [244]. Нейроны OVLT проецируются в переднюю зубчатую извилину и островковую часть коры и через таламические пути способствуют наступлению ощущения жажды [43]. Секреция аргинин-вазопрессина также стимулируются афферентными путями, поднимающимися по языкоглоточному и блуждающему нервам, вследствие снижения эффективного объема циркулирующей крови, которое воспринимается рецепторами, реагирующими на изменение давления (волюморецепторы внутригрудных вен и предсердий и барорецепторы каротидного синуса). Гипоксемия и ацидоз стимулируют хеморецепторы каротидного тельца и также вызывают высвобождение аргинин-вазопрессина. Стимуляция катехоламинами центральных адренергических рецепторов оказывает различные эффекты на высвобождение аргинин-вазопрессина. В высоких концентрациях их действие на 2- и рецепторы подавляют высвобождение аргинин-вазопрессина [34]. Наиболее сильным стимулятором для высвобождения аргинин-вазопрессина остается гиперосмия. Центральные осморецепторы ядер субфорникального органа, которые расположены за гематоэнцефалическим барьером, реагируют на повышение осмоляльности плазмы крови. Периферические осморецепторы находятся в портальных венах и сигнализируют об изменении осмоляльности крови. Сигналы передаются блуждающим нервом в ядро солитарного тракта, область пострема и вентролатеральную часть продолговатого мозга, и далее в паравентрикулярное и супраоптическое ядра, где аргинин-вазопрессин образуется в телах крупноклеточных нейронах. У человека осмоляльность крови поддерживается в пределах 275– 290 мОсм/кг Н2О [43].
Лабораторные методы исследования
Эксперименты выполнены на животных, которые находились на стандартном водном режиме, на фоне водной нагрузки и на фоне введения гипертонического раствора NaCl. Утром предыдущего дня крысы получали корм и в течение последующего времени до проведения эксперимента их лишали пищи при свободном доступе к воде.
Для исследования эффекта нонапептидов нейрогипофиза и их аналогов на функции почек представляло интерес оценить диапазон доз препаратов, при введении которых усиливается по отношению к контрольному уровню и достигается максимум выведения ионов натрия – основного внеклеточного катиона. Дозы всех препаратов были выбраны в соответствии с целью и задачами диссертационной работы.
Функции почки крыс исследовали в следующих сериях экспериментов: внутримышечная инъекция аргинин-вазопрессина (АВП) в дозах 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 и 2 нмоль на 100 г массы тела, аргинин-вазотоцина (АВТ) в дозах 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 и 0.5 нмоль на 100 г массы тела, дезамино-аргинин-вазотоцина (дААВТ) в дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела, дезамино-вазотоцин (дАВТ) в дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела. В отдельных экспериментах крысам вводили селективные агонисты V1a-рецепторов [Phe2-Ile3-Orn8]-вазопрессин, V2-рецепторов, десмопрессин (дДАВП). V1a-агонист инъецировали в дозах 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.15 и 0.2 нмоль на 100 г массы тела, дДАВП – в дозах 0.001, 0.01, 0.025, 0.05 и 0.1 нмоль на 100 г массы тела. Препараты растворяли в 0.9% растворе NaCl до необходимой концентрации и вводили в объеме 0.1 мл на 100 г массы тела внутримышечно. Контролем служили животные, которым инъецировали физиологический раствор в аналогичном объеме.
Антагонист V1a-рецепторов [Pmp1yr(Me)2]-вазопрессин, растворяли в 0.9% растворе NaCl и вводили крысам в внутрибрюшинно в дозах 1 и 2 нмоль на 100 г массы тела. Пептидный V2-антагонист [Pmp1-DIle2-Ile4]-вазопрессин вводили в дозах 1.5 и 5 нмоль на 100 г массы тела крысам внутрибрюшинно. Непептидный антагонист V2-рецепторов ОРС-31260 растворяли в 5% растворе крахмала. Полученную смесь с антагонистом в концентрации 4 мг/мл вводили из расчета 0.5 мл раствора на 100 г массы тела через резиновый зонд перорально. Животным группы контроля вводили тот же объем растворителя.
Антагонист V1b-рецепторов, неливаптан, разводили в 60% растворе DMSO (0.5 мг на 100 г массы тела в 0.25 мл) и вводили внутрибрюшинно. Контролем служила группа животных с введением раствора DMSO в аналогичном объеме. дААВТ вводили внутримышечно и одновременно инъецировали DMSO внутрибрюшинно.
Проведен ряд экспериментов с использованием блокаторов каналов и котраснспортеров в канальцах нефрона на фоне действия V1a-агониста.
Гипотиазид в таблетках измельчали в ступке, размешивали в 5% растворе крахмала и вводили суспензию перорально крысам в объеме 0.5 мл на 100 г массы тела. Концентрация гипотиазида в растворе крахмала составила 5 мг/мл. Контролем выступала группа с пероральным введением киселя. V1a-агонист 0.1 нмоль на 100 г массы тела крысам инъецировали внутримышечно и вводили растворитель перорально. В группе с введением двух препаратов гипотиазид вводили за 60 минут до инъекции V1a-агониста.
Амилорид растворяли в теплой дистиллированной воде (20–25 С) и вводили внутрибрюшинно в дозе 0.5 мг на 100 г массы тела в 0.1 мл. Группа крыс с внутрибрюшинным введением дистиллированной воды в объеме 0.1 мл на 100 г массы тела служила контролем. V1a-агонист в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела вводили через 60 мин после внутрибрюшинной инъекции дистиллированной воды. При совместном введении амилорид вводили за 60 минут до инъекции V1a-агониста. Фуросемид
Готовый препарат (10 мг/мл) вводили в объеме 0.1 мл на 100 г массы тела внутримышечно. Контролем служила группа крыс с введением аналогичного объема 0.9% раствора NaCl. Via-агонист в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела вводили совместно с внутримышечной инъекцией 0.1 мл на 100 г массы тела 0.9% раствора NaCl. В группе с введением двух препаратов крысам в разные лапы инъецировали внутримышечно диуретик и Via-агонист.
Другая группа экспериментов выполнена на крысах, которые получали 5% водную нагрузку (ВН). Воду в объеме 5 мл на 100 г массы тела вводили крысам через гибкий зонд перорально в желудок одновременно с инъекцией изучаемых препаратов. Проведены следующие серии экспериментов: инъекция АВТ в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела; инъекция АВП в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела; инъекция агониста Via-рецепторов в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела; инъекция дДАВП в дозе 0.001 нмоль на 100 г массы тела; 0.9% раствор NaCl 0.1 мл на 100 г массы тела внутримышечно (контроль). Группу контроля составили животные, получившие воду в объеме 5 мл на 100 г массы тела перорально и инъекцию физиологического раствора 0.1 мл на 100 г массы тела внутримышечно. Для достижения гиперосмии крысам внутрибрюшинно вводили 2.5% раствор NaCl в объеме 1.8 мл на 100 г массы тела. На этом фоне проведены следующие серии экспериментов с инъекцией: дАВТ 0.05 нмоль на 100 г массы тела; фуросемида 1 мг на 100 г массы тела; Via-агониста 0.1 нмоль на 100 г массы тела; антагониста Уг-рецепторов в дозах 1.5 и 5 нмоль на 100 г массы тела; антагониста Via-рецепторов в дозах 1 и 2 нмоль на 100 г массы тела; 0.9% раствор NaCl 0.1 мл на 100 г массы тела внутримышечно (контроль). Забор крови для измерения концентрации катионов, общего белка и креатинина в сыворотке крови осуществляли из сонной артерии в остром эксперименте под золетиловым наркозом (золетил, 5 мг на 100 г массы тела). После свертывания кровь центрифугировали при 8000 оборотах в минуту на микроцентрифуге “Hettich Micro 20” (Andreas Hettich GmbH, Германия) в течение 10 мин при комнатной температуре, собирали сыворотку.
Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады каналов и транспортеров натрия в нефроне
Агонист V1a-рецепторов (0.1 нмоль на 100 г массы тела) при сравнении с действием гипотиазида (2.5 мг на 100 г массы тела) обладает более выраженными натрийуретическими свойствами (Таблица 12), что согласуется с данными литературы [106]. На фоне блокады NCC гипотиазидом введение V1a-агониста привело к увеличению экскреции ионов натрия в 4 раза, экскреции калия – в 2 раза, мочеотделения – в 3 раза. При этом введение гипотиазида на фоне инъекции V1a-агониста дало статистически значимый прирост к эффекту V1a-агониста только для экскреции осмотически активных веществ, ионов калия и клиренса осмотически связанной воды. Введение гипотиазида на фоне действия V1a-агониста приводит к тенденции к увеличению натрийуреза, однако величина прироста невелика ввиду невысокой экскретируемой фракции ионов натрия при действии гипотиазида.
Кумулятивный эффект введения 0.1 нмоль на 100 г массы тела агониста V1a-рецепторов и гипотиазида на экскрецию катионов и воды почкой крыс за 2 ч. Параметры функции почки Серии экспериментов контроль (n=10) Via-агонист (n=10) Гипотиазид (n=10) Уіа-агонист+гипотиазид(n=9) V, млUоsmV, мкОсм UNaV, мкмоль UKV, мкмоль UMgV, мкмоль UCaV, мкмольСоsm, млCН2О, мл 0.19±0.03 257±1510±215±3 4.88±0.56 0.12±0.06 0.86±0.05 -0.67±0.05 1.35±0.16 918±56 258±27 90±8 7.27±0.97 ns1.52±0.25 3.08±0.19 -1.73±0.11 0.52±0.06 $479±27 $84±11 $55±5 $6.12±0.59 ns NS0.28±0.05 ns $1.61±0.09 $-1.09±0.08 $ 1.55±0.19 NS1208±66 &314±21 NS127±6 &8.36±0.30 NS1.50±0.23 NS4.05±0.22 &-2.51±0.12 &
Примечание. ns p 0.05, p 0.05 – достоверность отличий при сравнении с контрольной группой; NS p 0.05, & p 0.05 – достоверность отличий при сравнении с эффектом агониста V1a-рецепторов. Все расчеты проведены на 100 г массы тела за 2 ч с момента введения агониста V1a-рецепторов
Введение амилорида (0.5 мг на 100 г массы тела) полностью подавляет экскрецию ионов калия с мочой у крыс, увеличивает выведение ионов натрия в 8 раз, снижает выведение магния в 2 раза, не оказывает эффекта на экскрецию ионов кальция и реабсорбцию осмотически свободной воды (Таблица 13). На фоне блокады эпителиальных натриевых каналов натрийуретический эффект V1a-агониста (0.1 нмоль на 100 г массы тела) увеличивается в 1.4 раза, калийуретическое действие снижается в 14 раз. Инъекция амилорида и V1a-агониста приводит к суммации натрийуретического действия препаратов (Таблица 13). Оценка динамики экскреции ионов натрия показала, что введение амилорида на фоне инъекции агониста V1a-рецепторов усиливает выведение натрия (Рисунок 18) и приводит к подавлению экскреции ионов калия у крыс (Рисунок 19). Препятствие росту экскреции калия при действии V1a-агониста на фоне действия амилорида указывает на зависимость калийуреза при действии нонапептида от секреции калия в конечных отделах нефрона и собирательных трубках.
Параметры функции почки Серии экспериментов контроль (n=10) Via-агонист (n=10) амилорид (n=10) Уіа-агонист+амилорид(n=10) V, млUоsmV, мкОсм UNaV, мкмоль UKV, мкмоль UMgV, мкмоль UCaV, мкмольСоsm, мл СH2O, мл o.mo.oi207±17 7±2 13±3 3.87±0.54 0.13±0.03 0.70±0.06 -0.58±0.05 0.92±0.06 708±37 192±13 71±7 5.75±0.75 1.30±0.32 2.37±0.12 -1.46±0.08 0.38±0.03 $255±15 ns $53±4 $1±0.1 $1.99±0.45 $0.19±0.10 ns $0.86±0.05 ns $-0.47±0.04 ns $ 1.09±0.08 NS270±18 NS 270±18 & 5±1 & 4.45±0.54 ns NS 1.53±0.23 NS 2.41±0.13 NS -1.32±0.09 NS Примечание. ns p 0.05, p 0.05 – достоверность отличий при сравнении с контрольной группой; NS p 0.05, & p 0.05 – при сравнении c эффектом агониста V1a-рецепторов. Все расчеты проведены на 100 г массы тела за 2 ч с момента введения агониста V1a-рецепторов.
Динамика экскреции ионов натрия (UNaV) при введении амилорида и V1a-агониста. Обозначения: p 0.05 – достоверность отличий при сравнении с эффектом V1a-агониста. Стрелка – момент введения V1a-агониста (черная), амилорида (белая).
Динамика экскреции ионов калия (UKV) при введении амилорида и V1a-агониста. Обозначения: p 0.05 – достоверность отличий при сравнении с эффектом V1a-агониста. Стрелка – момент введения V1a-агониста (черная), амилорида (белая). 3.2.2.3. Изучение экскреции ионов натрия при стимуляции V1а-рецепторов на фоне блокады Na, K, 2Cl-котранспортера
Для исследования блокады Na, K, 2Cl-котранспортера использовали фуросемид в максимальной эффективной дозе – 1 мг на 100 г массы тела [275]. Инъекция фуросемида усиливает диурез за счет экскреции осмотически активных веществ, ионов натрия, калия, магния, кальция и увеличивает клиренс осмотически свободной воды. При сравнении с эффектом инъекции агониста V1a-рецепторов фуросемид увеличивает диурез, экскрецию кальция и реабсорбцию осмотически свободной воды. Совместное введение фуросемида и агониста V1a-рецепторов приводит к усилению диуреза, экскреции натрия, калия, магния, кальция, клиренса осмотически связанной воды при сравнении с контролем (Таблица 14). Оба препарата усиливают выведение ионов натрия, но при одновременном введении проявляют аддитивный натрийуретический эффект и снижают реабсорбцию осмотически свободной воды при сравнении с инъекцией агониста V1a-рецепторов. При сопоставимой величине экскреции осмотически активных веществ представляло интерес оценить различия в эффекте фуросемида на диурез и клиренс осмотически свободной воды.
Исследование экскреции катионов почкой крыс при селективной стимуляции V2-рецепторов
Эффективность водно-солевого гомеостаза зависит преимущественно от функции почки и системы ее регуляции. Центральное значение в этом процессе принадлежит гормонам нейрогипофиза, которые вовлекаются в регуляцию водного баланса и играют определенную роль в выведении катионов почкой.
Вазопрессин участвует в регуляции водно-солевого баланса организма [165]. Установлена молекулярная организация и выявлена локализация в почке различных подтипов рецепторов вазопрессина [30, 61, 153, 251]. Эксперименты с микропункцией нефрона позволили установить изменение реабсорбции и секреции ионов в отдельных частях канальцев при стимуляции V-рецепторов [97, 112, 192]. Обнаружено пусковое и модулирующее влияние активации V-рецепторов на транспорт ионов и воды в нефроне [111, 113, 251]. Особое значение в деятельности почки имеет транспорт ионов натрия, на его реабсорбцию оказывает действие ряд веществ, в том числе аналоги вазопрессина, вызывающие натрийурез [153, 271].
Данные об участии вазопрессина в регуляции экскреции ионов почкой диктуют необходимость изучения in vivo роли различных подтипов его рецепторов в обеспечении водно-солевого гомеостаза [230, 250]. Задача настоящего исследования заключалась в анализе эффекта максимальной селективной стимуляции V1a-, V2-, V1b-рецепторов в изменении экскреции катионов натрия, калия, магния и кальция почкой крыс при разном состоянии водно-солевого баланса (нагрузка NaCl, водная нагрузка).
В нейрогипофизе млекопитающих, у человека, секретируются вазопрессин, который выполняет осмо- и ионорегулирующую функции и поддерживает осмотический гомеостаз. Вазопрессин способствует реабсорбции ионов натрия [294], но в бльшей концентрации усиливает натрийурез [218]. В нашей работе был показан дозозависимый эффект вазопрессина на экскрецию ионов почкой крыс. При введении 0.25–2 нмоль отмечена прямая зависимость экскреции ионов натрия и вазопрессина с мочой. Было показано, что вазопрессин усиливает натрийурез, калийурез и приводит к реабсорбции ионов магния (Таблица 2). Введение аргинин-вазопрессина в дозе, превышающей антидиуретическую на 2 порядка, приводит к усиленной экскреции ионов натрия у крыс на стандартном водном режиме (Таблица 2).
В экспериментах данного исследования был показан высокий натрийуретический эффект аргинин-вазотоцина (0.01–0.1 нмоль на 100 г массы тела). Действие аргинин-вазотоцина на экскрецию ионов натрия опосредовано стимуляцией V1a-рецепторов. При селективной блокаде V1a-рецепторов снижается натрийуретический ответ почки на инъекцию аргинин-вазотоцина. (Таблица 10). Помимо усиленного натрийуретического эффекта, аргинин-вазотоцин через эти рецепторы, вероятно, способствует спазму приносящей артериолы, что приводит к усилению скорости потока в клубочке и в результате – увеличению скорости клубочковой фильтрации (Рисунок 16).
Известно, что аргинин-вазопрессин влияет на транспорт не только натрия, но и магния [79, 189, 190]. В наших исследованиях инъекция вазопрессина приводила к усилению реабсорбции ионов магния (Таблица 2). У человека основная часть профильтровавшегося магния реабсорбируется путем пассивной парацеллюлярной диффузии по электрохимическому градиенту в проксимальном извитом канальце (10–15%) и в толстом восходящем колене петли Генле (до 60%) [267]. В дистальном канальце происходит обратное всасывание 10–15% профильтровавшегося магния, реабсорбция осуществляется против электрохимического и концентрационного градиента с помощью переносчика TRPM6 [189]. Нами было показано, что аргинин-вазотоцин на максимуме натрийуреза и дезамино-вазотоцин (Таблица 15) могут усиливать магнийурез. Этот эффект также проявлялся при введении нонапептидов в высоких дозах 0.025–0.1 нмоль на 100 г массы тела и коррелировал с увеличением выведения натрия [273]. Введение V2-антагониста не влияло на повышенную экскрецию ионов магния при действии дезамино-вазотоцина, а инъекция V1а-антагониста полностью устранила магнийурез [273]. Данные указывают на факультативный, а не на облигатный характер зависимости усиления экскреции ионов магния от ионов натрия при действии гормонов нейрогипофиза и их аналогов. Эксперименты с введением V1а- и V2-антагонистов продемонстрировали, что изменение выведения магния почкой не всегда происходит пропорционально изменению реабсорбции натрия, что свидетельствует о существовании самостоятельной системы обеспечения селективности регуляции баланса ионов магния в организме. Аргинин-вазопрессин в дозе 0.5 нмоль на 100 г массы тела уменьшает выведение магния с мочой, но не влияет на выведение ионов натрия (Таблица 2).
Эффект, вероятно, зависит от дозы действующего нонапептида: стимуляция при меньшей концентрации V2-рецепторов, а при большей – V1a-рецепторов. Разнонаправленные эффекты аргинин-вазопрессина, аргинин-вазотоцина и дезамино-вазотоцина на транспорт магния в почке, вероятно, обусловлены разным соотношением активации V1a- и V2-рецепторов при действии нонапептидов. В настоящей работе указано, что инъекция антагониста V2-рецепторов крысам с гипернатриемией усиливает выведение ионов магния почкой (Рисунок 29), а введении агониста V2-рецепторов десмопрессина в дозе 0.1 нмоль на 100 г массы тела привело к снижению выделения магния почками крыс (Таблица 19). Таким образом, полученные данные показывают, что V2-рецепторы участвуют в регуляции транспорта магния почкой.
Полученные результаты выявили, что экскреция ионов кальция сопровождает интенсивный натрийурез. Инъекция нонапептидных регуляторов в натрийуретических дозах приводит к усилению выведения ионов натрия и кальция (Таблица 2, 3). Известно, что реабсорбция кальция в дистальном канальце нефрона строго регулируема люминальной и перитубулярной концентрацией ионов натрия [42]. Соответственно, его концентрация в моче будет различной при усиленном или сниженном натрийурезе. При инъекции антагониста V1а-рецепторов на фоне действия АВТ снижается экскреция ионов натрия и кальция (Таблица 6). Таким образом, текущее исследование показало, что инъекция натрийуретических препаратов значительно усиливает выведение ионов кальция с мочой. Учитывая такую разницу в величине экскреции ионов натрия, представляло интерес оценить степень, с которой введенные нонапептиды подвергаются деградации. Для этого на фоне водной нагрузки, когда снижалась секреция эндогенного гормона (Таблица 5), вводили одинаковые дозы вазопрессина и вазотоцина. Полученные результаты показали, что вазотоцина сохраняется в пробах мочи 16.48 %, а вазопрессина – 0.18 % . Вероятно, вазотоцин в меньшей степени подвергается эффекту аминопептидаз, что также способствует реализации его натрийуретического действия. Натрийуретический эффект аргинин-вазотоцина сопровождается реабсорбцией воды наряду с увеличением диуреза. В основе этого явления лежит перераспределение жидкости в нефроне – уменьшение реабсорбции ионов натрия в толстом восходящем отделе петли Генле и увеличением реабсорбции осмотически свободной воды в собирательных трубках. Больший объем осмотически связанной воды, которая притекает к собирательным трубкам, создает условия для усиленной реабсорбции осмотически свободной воды. Ранее было показано, что аргинин-вазотоцин имеет способность соединяться с различными V-рецепторами и его эффект на осмотически свободную воду связан со стимуляцией V2-рецепторов. [162]. В связи с выходом на сушу позвоночных, замена вазотоцина на вазопрессин у млекопитающих была обусловлена необходимостью осмотического концентрирования мочи без потери ионов натрия.
В данной работе был показан высокий натрийуретический эффект селективной стимуляции V1a-рецепторов. Экскретируемая фракция ионов натрия на максимуме диуреза соответствует эффекту инъекции максимальной дозы фуросемида – одного из самых сильных диуретиков (Таблица 16). При оценке показателей сыворотки крови, несмотря на выраженный натрийурез при действии фуросемида, мы наблюдаем повышение осмоляльности на 60 мин эксперимента, а к 90 мин – повышение уровеня натрия. При введении V1a-агониста, наоборот, снижается уровень натрия в сыворотке крови и осмоляльность. Для достижения сопоставимого эффекта на натрийурез необходимо разное количество вводимого препарата, что определяется различием механизма действия. Участие вторичных посредников при действии V-агонистов [153] является причиной существенного отличия дозы действующего начала: максимальный эффект агониста V1a-рецепторов достигается при инъекции 0.1 нмоль, а фуросемида – 3 мкмоль (1 мг) на 100 г массы тела. Полученные данные впервые показывают возможность достичь столь большого увеличения количества выделяемого натрия не с помощью классических диуретиков, а с применением селективного агониста V1a-рецепторов.
Представляло интерес определить локус действия агониста V1a-рецепторов. Инъекция нонапептидного регулятора приводит к усиленной экскреции ионов натрия, калия, магния и кальция, что свидетельствует о том, что место приложения его действия может лежать в дистальном отделе нефрона [40, 165, 190, 195]. Для подтверждения данной гипотезы были использованы различные ингибиторы и блокаторы каналов и транспортеров натрия – гипотиазид, фуросемид и амилорид, которые блокируют реабсорбцию ионов натрия в различных местах канальцев нефрона.