Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Болезнь Паркинсона: этиология и патогенез 13
1.1.1. Гипотезы механизмов патогенеза БП 19
1.2. Нервно-психические нарушения при БП 22
1.2.1. Особенности нарушений сна при БП 25
1.3. Патофизиология нарушений сна при БП 28
1.4. Современная терапия БП и ее недостатки 31
1.5. Экспериментальные модели паркинсонизма 36
1.6. БП и нейротрофические факторы 40
1.6.1. Терапия БП нейротрофическими факторами 48
1.7. HEK и GDNF 53
Глава 2. Методы исследований 57
2.1. Методика проведения двух этапов исследования 57
2.1.1. Схемы исследования 58
2.1.2. Ход операции 1 и 2 этапов 59
2.1.3. Методика введения пронейротоксина МФТП (1 этап исследования) 61
2.1.4. Ход операции по введению трансгенного белка GDNF и введение пронейротоксина МФТП (2 этап исследования)
2.1.5. Регистрация, визуализация и обработка полисомнографических 62
данных .
2.2. Методика проведения морфологического контроля 73
Глава 3. Результаты исследований 75
3.1. Влияние пронейротоксина МФТП на цикл сон-бодрствование и двигательную 75
активность
3.2. Влияние пронейротоксина МФТП и трансгенного белка GDNF на цикл сон- 79 бодрствование и двигательную активность .
3.3. Морфоконтроль: влияние пронейротоксина МФТП на количество ДА 83
нейронов .
Глава 4. Обсуждение результатов 87
Заключение 102
Выводы 104
Список цитируемой литературы
- Гипотезы механизмов патогенеза БП
- Терапия БП нейротрофическими факторами
- Ход операции по введению трансгенного белка GDNF и введение пронейротоксина МФТП (2 этап исследования)
- Влияние пронейротоксина МФТП и трансгенного белка GDNF на цикл сон- 79 бодрствование и двигательную активность
Введение к работе
Актуальность исследования. Болезнь Паркинсона (БП) - второе по распространенности нейродегенеративное заболевание, которое развивается в пожилом возрасте и характеризуется нарушениями двигательной активности -тремором, ригидностью, брадикинезией, а на поздней стадии - и когнитивными расстройствами (Крыжановский и др., 2002; Угрюмов, 2010, 2014). БП сопровождается потерей дофаминергических (ДА) нейронов в компактной части черной субстанции среднего мозга (substantia nigra/pars compacta, SNpc) (Seidl et al., 2014). Процесс дегенерации протекает без видимых клинических проявлений благодаря активации компенсаторных механизмов (Zigmond, 1997; Bezard, Gross, 1998; Bergstrom, Garris, 2003; Bezard et al., 2003); и лишь тогда, когда гибель ДА нейронов достигает критического порога в 50-60% от общей численности нейронов SNpc, а уровень дофамина, доставляемого в стриатум этими нейронами, падает в 4 раза, возникают двигательные, а в дальнейшем – и когнитивные нарушения (Bernheimer et al., 1973). Лечение на этой стадии уже неэффективно, возможно лишь медикаментозное облегчение симптомов и, в некоторых случаях, небольшое замедление развития заболевания (Kang et al., 2012; Chan et al., 2007), поэтому поиск ранних диагностических маркеров и разработка новых моделей БП являются сейчас первостепенными задачами (Ковальзон, Завалко, 2013; Ковальзон и др., 2014).
Большинство (от 60 до 98% по данным разных авторов) пациентов, страдающих БП, имеют нарушения цикла сон-бодрствование, причем ряд исследований показывает, что эти симптомы обычно возникают рано, в самом начале болезни (Lees et al., 1988; Nausieda et al., 1982; Tandberg et al., 1998; Гусев и др., 2010; Mehta et al., 2008; Zoccolella et al., 2011). Нарушения сна при БП многообразны и представлены инсомниями, парасомниями, а также дневной сонливостью (De Cock et al., 2008). Расстройства сна могут на много лет опережать появление первых моторных симптомов болезни и вследствие этого служить ранними предикторами БП (Abbott et al., 2005; Postuma et al., 2006). Эти данные указывают на необходимость более детального исследования изменений, связанных с нарушением структуры цикла сон-бодрствование при БП, их
физиологических и биохимических основ (Ковальзон, Завалко, 2013; Ковальзон и др., 2014).
В лаборатории акад. М.В. Угрюмова (ИБР РАН) разработаны
нейротоксические модели доклинической, переходной и ранней клинической стадий БП, в которых мышам линии С57 вводят подкожно специфический пронейротоксин ДА нейронов – метилфенилтетрагидропиридин (МФТП). При введении в малой дозе (12 мг/кг) двукратно с двухчасовым интервалом у животных в течение двух недель развивается так называемая «досимптомная» стадия БП. При 4-кратном введении той же дозы (с 2-часовыми интервалами) – переходная. При однократном в дозе 40 мг/кг – ранняя клиническая (Ugrumov et al., 2011). Однако возможные изменения в структуре цикла бодрствование-сон, как ранние маркеры БП, в этих моделях до настоящего времени не изучались. На первом этапе данной работы мы задались целью выявить изменения в цикле бодрствование-сон по показателям ЭЭГ и поведенческой активности на вышеперечисленных ранних стадиях БП при использовании нейротоксической модели на мышах.
На следующем этапе исследования мы решили проверить возможный
протекторный эффект от введения клеток линии НЕК293, трансгенных по GDNF,
непосредственно в стриатум экспериментальных мышей с моделью ранней
клинической стадии паркинсонизма (токсическая (МФТП) модель) по
показателям ЭЭГ в цикле бодрствование-сон и поведенческой активности. Этот
труд явился совместным с Институтом биологии гена РАН, лабораторией
нейрогенетики и генетики развития, возглавляемой д.б.н. Г.В.Павловой. В этой
лаборатории разработаны методы подготовки и применения клеточного
материала для трансплантации животным с экспериментальной
нейродегенерацией. С помощью вектора с плазмидной конструкцией можно внедрять глиальный нейротрофический фактор (ГНФ, GDNF) в мозг экспериментальной модели. Что и было сделано: клетки НЕК293 были транфицированы с помощью плазмидной конструкции, содержащей ген новой изоформы GDNF, ген устойчивости к гентамицину, а также ген зеленого флуоресцентного белка для контроля введения конструкции.
Известно, что глиальный нейротрофический фактор (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) был впервые выделен в 1993 г. из глиальных клеток
крыс (Lin et al., 1993). Для GDNF характерен ретроградный транспорт зрелых молекул по аксону. Его функция – сохранение различных популяций клеток центральной и периферической нервной системы, включая и ДА нейроны. Он влияет на рост аксонов, экспрессию генов функционально значимых белков.
Уровень GDNF, измеренного в материале больных БП, оказался существенно выше в нигростриатных ДА нейронах и их проекциях (черная субстанция, хвостатое ядро, скорлупа), нежели в мозжечке и фронтальной коре (Mogy et al, 2001). Поскольку GDNF не проходит через ГЭБ, его локальная доставка в стриатум рассматривается как способ терапии БП (Kirik et al, 2004). Несмотря на эффективность GDNF в модельных исследованиях на грызунах и приматах, было показано, что после прекращения кратковременной терапии GDNF состояние животного медленно ухудшалось вплоть до исходного уровня (Zhang, 1997). Таким образом, для поддержания дофаминотрофического эффекта необходимо длительное регулярное введение GDNF.
Продолженный в клинике больных БП этот подход (инфузия GDNF микронасосом в дорзальную часть скорлупы) в некоторых случаях улучшал моторные функции у пациентов (Grondin et al, 2003). Однако результаты клинических испытаний на людях в целом оказались противоречивыми вследствие до сих пор не решенной проблемы доставки GDNF в мозг. В данном исследовании мы впервые применили новый способ такой доставки – путем введения в стриатум эмбриональных клеток почки человека (HEK), содержащих усеченный ген GDNF и способных экспрессировать этот белок в течение, по крайней мере, нескольких суток после трансфекции модельным животным.
Цели работы: (1) проверить, можно ли считать нарушения цикла бодрствование-сон на токсической модели неспецифическими маркерами БП на ее ранних стадиях; (2) проверить, могут ли трансгенные клетки HEK293/mGDNF, экспрессирующие белок GDNF, при их инъекции в стриатум экспериментальных мышей с моделью ранней клинической стадии БП, повлиять на восстановление цикла сон-бодрствование и уровень двигательной активности животных.
Задачи исследования:
На мышах C57BL/6 с предварительным введением умеренных доз пронейротоксина МФТП (MPTP) исследовать динамику изменений цикла бодрствование-сон (по показателям ЭЭГ) и двигательной активности, которые могут быть индикаторами нарушений, сходных с симптомами развития БП.
Противодействовать этим нарушениям с помощью внутримозгового введения в область стриатума нового источника GDNF – трансгенных клеток HEK/GDNF.
Научная новизна результатов исследования.
В нашей работе впервые получены и проанализированы полисомнограммы мышей на МФТП-моделях ранних стадий БП, а также после введения трансгенных клеток HEK/GDNF.
Впервые обнаружены нарушения медленноволновой фазы сна на нейротоксических моделях ранних стадий БП, сходные с таковыми у пациентов, не проходящих лечение противопаркинсоническими препаратами.
Впервые выдвинуто предположение о связи нарушений структуры сна при ранних стадиях БП у людей и модельных животных по признаку выделения суточного мелатонина.
Впервые in vivo успешно протестирован новый метод доставки GDNF в мозг, разработанный в ИБГ РАН (Куст Н.Н., Павлова Г.В., Ревищин А.В.).
Впервые показана принципиальная возможность клеточной терапии БП на ранней стадии заболевания с помощью непосредственного введения суспензии клеток HEK293/GDNF в стриатум модельных животных с экспериментально вызванной нейродегенерацией.
Научно-практическая значимость работы.
Нейродегенеративные заболевания — БП, болезнь Альцгеймера, БАС и др. –
имеют огромное социальное значение, так как во многих случаях это одна из
основных причин инвалидности и смертности людей трудоспособного и
пожилого возраста. На данный момент не существует методов диагностики
ранних (доклинических) стадий заболевания. Основным «маркером»
доклинической стадии БП можно считать нарушения движений в фазе быстрого сна (Schenk et al., 1996).
Не существует и методов лечения, которые могли бы устранить причину
БП, затормозить патологические процессы в головном мозге. Современные
препараты лишь уменьшают тяжесть симптомов БП. Основным препаратом,
замедляющим развитие этого заболевания, в настоящее время является
леводопа, но его применение вызывает целый ряд побочных эффектов, и помимо
этого существует большая вероятность появления толерантности
(нечувствительности) к лекарству. Именно поэтому поиск новых подходов для лечения и профилактики болезни Паркинсона является одной из главных задач современной неврологии. Важнейшее значение при этом приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием стволовых и прогениторных стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к развитию в различных направлениях. Для повышения жизнеспособности и терапевтической эффективности клеточных препаратов осуществляется поиск генетических конструкций, способных экспрессироваться в трансплантированных клетках, продукты которых могут выделяться из этих клеток. Особенно перспективны в этом отношении конструкции, содержащие гены нейротрофических факторов, и, в частности, ген глиального нейротрофического фактора (GDNF). Показано, что GDNF оказывает дифференцирующее и протективное воздействие на многие виды нервных клеток. В центральной нервной системе GDNF способствует дифференцировке и выживанию ДА нейронов черной субстанции среднего мозга (Lin et.al., 1993).
В ИБГ РАН (лаборатория Г.В.Павловой) были получены генетические конструкции, содержащие новую модификацию гена GDNF. Было показано, что продукты данных модификаций гена GDNF активно выделяются из трансфицированных клеток и стимулируют рост нервных отростков нейронов спинального ганглия сильнее, чем обычный GDNF.
В настоящей работе нами исследовано, на первом этапе - влияние на общую поведенческую активность и структуру сна модельных животных малых и умеренных доз пронейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП), а на втором - влияние на те же параметры клеток HEK/GDNF после их
инъекции в стриатум и последующего подкожного введения пронейротоксина МФТП.
Результаты нашей работы позволяют говорить о том, что: 1) введения малых и умеренных доз пронейротоксина МФТП мышам линии С57BL/6, моделирующих ранние стадии БП, действительно вызывают нарушения общей двигательной активности и цикла бодрствование-сон; 2) внутримозговое введение (в стриатум) трансгенных клеток HEK/GDNF мышам с МФТП-моделью ранней стадии БП эффективно предотвращает эти нарушения. Эти данные в дальнейшем могут быть использованы при разработке доклинической диагностики и терапевтических средств против БП.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Системные введения малых и умеренных доз пронейротоксина МФТП мышам линии C57BL/6, моделирующие ранние стадии БП, вызывают нарушения общей двигательной активности и структуры цикла бодрствование-сон, регистрируемые методом ЭЭГ в сочетании с регистрацией двигательной активности.
-
Системное введение умеренных доз пронейротоксина МФТП приводит к уменьшению количества ДА нейронов в специфических отделах головного мозга мышей линии C57BL/6.
-
Предварительное внутримозговое (стриатум) введение трансгенных клеток HEK/GDNF/GFP эффективно препятствует развитию нарушений двигательной активности и цикла бодрствование-сон, вызванных токсическим действием МФТП.
Личный вклад автора. Выполнение экспериментов, анализ данных, подготовка материалов к публикации и написание статей проводилось при личном участии автора. Помощь в выполнение ряда экспериментов оказывали соавторы статей: сотрудник ИВНДиНФ РАН, к.б.н. Ю.В.Украинцева; сотрудник ИБР РАН, к.б.н. Т.С.Пронина; сотрудники ИБГ РАН, д.б.н. Г.В.Павлова, к.б.н. А.В.Ревищин, Н.Н. Куст, аспирант ИВНДиНФ РАН А.И.Манолов; студенты кафедры ВНД биологического факультета МГУ Н.С.Баженова, Д.Р.Галимова и Л.С.Моисеенко.
Достоверность полученных данных. Достоверность результатов
исследования основана на использовании современных и адекватных методов статистической обработки полученных данных и на достаточном объеме выборок.
Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации были
представлены на: 6-й (Москва, 2011), 7-й (Ростов-на-Дону, 2013) и 8-й (С.
Петербург, 2015) Российских (с международным участием) молодежных школах-
конференциях “Сон - окно в мир бодрствования”; 3-й научно-практической
конференции неврологов ФМБА России (Москва, 2013); 18-й Школе-конференции
молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и
нейрофизиологии (Москва, 2014); 9-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сомнологии» (Москва, 2014); XXI (Париж, 2012) и XXII (Таллин, 2014) съездах Европейского общества по изучению сна.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых три - в журналах из списка Scopus и Web of Science и три статьи -в журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 30 рисунков и 3 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик проведенного исследования, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 194 источника, из которых 35 - на русском и 159 -на английском языке.
Гипотезы механизмов патогенеза БП
БП является одним из самых распространенных социально значимых нейродегенеративных заболеваний. БП заболевает примерно каждый сотый человек, перешагнувший шестидесятилетний рубеж; на сегодняшний день, по данным ООН, им страдают около 6 млн. человек. Стоит также отметить, что у мужчин данное заболевание встречается чаще, чем у женщин. Эта болезнь вызывает дрожь в руках, общую скованность и, как следствие, проблемы с ходьбой и другими движениями, а также часто осложняется другими заболеваниями, которые рано или поздно приводят к смерти больного. Жертвами БП стали такие известные личности, как боксер Мохаммед Али, политик Ясер Арафат и Папа Римский Иоанн Павел II.
Своим названием БП обязана французскому неврологу Жану Шарко, который предложил назвать её в честь британского врача и автора «Эссе о дрожательном параличе» Джеймса Паркинсона, чей труд не был должным образом оценён при жизни. Таким образом, во второй половине XIX века официально было зарегистрировано нейродегенеративное заболевание, которое на сегодняшний день по распространённости занимает второе место после болезни Альцгеймера.
БП обусловлена, в основном, дегенерацией нейронов SNC и других пигментсодержащих ядер ствола головного мозга, и проявляется преимущественно двигательными нарушениями в виде гипокинезии, ригидности мышц, тремора покоя и постуральной неустойчивости, а также вегетативными, когнитивными и другими расстройствами.
БП характеризуется неуклонной дегенерацией ДА нейронов. Вследствие утраты нейронов SNC резко падает содержание дофамина в стриатуме и фермента тирозингидроксилазы (TH), а также уменьшение числа ДА рецепторов. Предположительно, истощение дофамина приводит к гиперактивности тормозного пути от стриатума (хвостатое ядро) к бледному шару (которые составляют экстрапирамидную систему), и соответствующим растормаживанием нейронов таламических паравентрикулярных и латеральных вентрикулярных ядер. В свою очередь, эти нейроны вызывают активацию нейронов двигательной коры и, следовательно, усиление разрядов мотонейронов, в том числе гамма-мотонейронов. В норме экстрапирамидная система посылает импульсы к периферическим двигательным нейронам. Эти сигналы играют важную роль в обеспечении миостатики путём готовности мышц к произвольным движениям. От деятельности данного отдела центральной нервной системы зависит способность человека принимать оптимальную для намеченного действия позу, достигается необходимое соотношение тонуса мышц-агонистов и антагонистов, а также плавность и соразмерность произвольных движений во времени и пространстве. Таким образом, при БП имеет место дефицит ДА влияний при усилении глутаматергических и холинергических влияний на тонус нейронов хвостатого ядра (Гусев и др., 2010).
Интересно, что при БП отмечается также снижение мелатониновых рецепторов MT1 и MT2 в черной субстанции и миндалине. Вопрос об этиологии таких нейродегенеративных заболеваний, как БП, до сих пор остается нерешённым, хотя считается, что важным фактором риска является генетическая предрасположенность, обусловленная мутациями генов. В конечном итоге это приводит либо к утрате белков, необходимых для нормального функционирования нейронов, либо к появлению и накоплению агрегированных белков, оказывающих токсическое влияние на нейроны. Так, мутации в генах -синуклеина, паркина и убиквитинкарбоксил-терминальной гидролазы могут приводить к развитию БП (Сломинский и др., 2003; Ross et al., 2008). При БП нейродегенеративный процесс в мозге запускается эндогенными токсическими факторами, причем одни из них неспецифичны и оказывают токсическое влияние на многие популяции нейронов, а другие — специфичны, т.е. обладают высоким сродством к ДА нейронам. К неспецифическим факторам относится агрегированный фибриллярный белок — -синуклеин, накапливающийся в тельцах Леви (McKeith et al., 2004; Petrucelli et al., 2008). К специфичным эндогенным нейротоксическим факторам относится N-метил(R)салсолинол, образующийся с помощью фермента N-метилтрансферазы из (R)салсолинола, а тот, в свою очередь, из дофамина и ацетальдегида (Levine et al., 2004). Обладая структурным сходством с дофамином, N метил(R)салсолинол захватывается в ДА нейроны с помощью мембранного переносчика дофамина и вызывает разобщение окислительного фосфорилирования, что приводит к гибели нейронов (Maruyama et al., 1992; Scheider et al., 2008). Одним из доказательств участия этого токсина в дегенерации нигростриатных ДА нейронов является его высокое содержание в ликворе и в нигростриатной системе у больных при БП.
На данный момент БП позиционируется как заболевание, характерное для старшей возрастной группы — чаще всего первые симптомы появляются в возрасте 55-60 лет. Характерной особенностью БП является то, что она развивается в течение длительного времени – до двадцати-тридцати лет — без проявления симптомов, т.е. в доклинической стадии. Только после гибели «порогового» числа ДА нейронов начинают появляться характерные симптомы, и заболевание переходит в клиническую стадию. Необходимо отметить, что под первыми симптомами имеются в виду моторные, а именно: тремор покоя, мышечная ригидность и гипокинезия, являющиеся своего рода «визитной карточкой» БП. Они появляются только после дегенерации большей части специфических нейронов, играющих ключевую роль в их регуляции. «Пороговой» является дегенерация 50–60% нейронов в черной субстанции и 70–80%
Терапия БП нейротрофическими факторами
В настоящее время неясно, как лишённые GDNF нейроны чёрной субстанции подвергаются нейродегенерации. Результаты, полученные на культуре эмбриональных ДА нейронов, лишённых GDNF, свидетельствуют о том, что гибель нейронов наступает вследствии активации рецептор-зависимого пути и каспазного пути, но не митохондриального пути. Существует предположение, что GDNF повышает выживаемость нейронов за счёт ингибирования рецепторов клеточной гибели. Молекулярные механизмы GDNF, лежащие в основе повышения жизнеспособности нейронов чёрной субстанции, трудны в изучении in vivo. В культуре нейронов - GDNF работает так же, как и другие нейротрофические факторы, активируя несколько путей, повышающих жизнеспособность клетки: фосфатидилинозитол-3-киназу, Ras/внеклеточную сигнальную регуляторную киназу, Src киназу и фосфолипазу С (Airaksinen, Saarma, 2002; Paratcha, Ledda, 2008).
Нейротрофические факторы на сегодняшний день являются самыми мощными медиаторами выживания нейронов, и не удивительно, что сейчас всё чаще их используют в качестве перспективных терапевтических агентов в борьбе с такими нейродегенеративными заболеваниями, как БП (Tomac et al., 1995).
Как уже упоминалось выше, нейротрофические факторы оказывают большое влияние на выживаемость и дифференцировку нейронов, а также на поддержание нормальной работы нервной системы. Фактор GDNF является одним из самых мощных защитных нейротрофических факторов ДА нейронов в экспериментальных моделях БП. Однако доставка в мозг таких нейротрофических факторов, как GDNF, весьма проблематична по следующим причинам: 1) неспособностью проникать через ГЭБ; 2) из-за фармакодинамических проблем, связанных с диффузией в мозгу; 3) из-за побочных эффектов, связанных с влиянием на нецелевые рецепторы. Вследствие этого на сегодняшний день вопрос о наиболее эффективном способе доставки нейротрофических факторов в мозг остаётся нерешённым. Все существующие на данный момент стратегии доставки нейротрофических факторов в мозг можно разделить на три категории (Рис. 5): интравентрикулярное введение нейротрофических факторов, интрапаренхимальное введение и системное введение агонистов. Наиболее старым способом является введение GDNF в область желудочков, этот способ позволяет решить проблему с преодолением ГЭБ, однако вследствие плохой диффузии GDNF из желудочков в паренхиму мозга и возникновения тяжёлых побочных эффектов - этот метод доставки нейротрофических факторов нельзя считать удачным. Наиболее новым и перспективным способом является использование небольших молекул лигандов, агонистов GDNF, которые могли бы пересекать ГЭБ. Это позволило бы решить многие проблемы, связанные с доставкой нейротрофических факторов в мозг, и, кроме того, обеспечило бы возможность системной доставки, что, несомненно, более удобно и безопасно для пациентов с БП, нежели нейрохирургическое вмешательство с введением нейротрофических факторов в желудочки или в конкретные области мозга. Однако на данный момент пока не существует проверенной модели введения GDNF в мозг с помощью миметиков, а лишь ведутся исследования по поиску наиболее подходящих агонистов (Bespalov, Saarma, 2007). Поэтому на сегодняшний день наиболее действенным и проверенным способом является локальное введение GDNF непосредственно в паренхиму структур мозга, нуждающихся в нейротрофической поддержке.
Как уже упоминалось выше, экспериментальные и клинические данные с использование нейротрофических факторов показали, что для получения положительного результата большое значение имеет точная локальная доставка нейротрофических факторов. Для достижения этого в настоящее время разрабатывается несколько стратегий для улучшения доставки нейротрофических факторов в мозг.
Вирусные и плазмидные векторы Одним из наиболее перспективных методов доставки нейротрофических факторов является генная терапия с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, лентивирусов и плазмид (Deierborg et al., 2008; Bjorklund, Kordower, 2010). Преклинические исследования показали, что доставка GDNF с использованием аденоассоциированных вирусов, лентивирусов или плазмид приводит к синтезу нейротрофических факторов и поддержанию его на высоком уровне. А благодаря высокой способности к диффузии доставка GDNF может осуществляться до значительного количества клеток-мишеней (Bjorklund, Kirik, 2009).
Неинкапсулированные и инкапсулированные клетки
Стратегия с использованием «голых», неинкапсулированных клеток заключается во внедрении в мозг клеток, сконструированных ex vivo и способных секретировать нейротрофические факторы (Behrstock, 2006). Благодаря своей способности к миграции такие клетки могут осуществлять эффективную доставку GDNF ко всем клеткам-мишеням, но существует риск, что эти клетки могут достичь других структур, и тем самым вызвать возможные нежелательные эффекты. В противовес стратегии с использованием «голых» клеток существует стратегия с использованием инкапсулированных клеток для доставки нейротрофических факторов до клеток-мишеней. Покрытие клетки защитной оболочкой необходимо для создания физического барьера и предотвращения иммунного отторжения, а также для образовния правильного контакта с клетками рецепиента; помимо этого, подобные клетки легче удалить при возникновении неблагоприятных эффектов. Данный метод основан на окружении клетки синтетической селективной мембраной, поры которой достаточно велики для диффузии питательных веществ и внешней диффузии, но достаточно малы, чтобы предотвратить взаимодействие с иммунной системой хозяина (Lindvall, Wahlberg, 2008).
Ход операции по введению трансгенного белка GDNF и введение пронейротоксина МФТП (2 этап исследования)
В 1 серии опытов вживляли еще 2 нихромовых электрода для регистрации электромиограммы (ЭМГ) заднешейных мышц. Для этого хирургическим пинцетом приподнимали кожу шеи с дорзальной стороны и вводили электрод в мышечную ткань на глубину около 1 см. ЭМГ электроды подпаивали с теплоотводом к отводящему кабелю непосредственно во время операции.
Разъёма на голове мыши не крепили, отводящий кабель был прикреплен непосредственно к электродам для ЭЭГ и ЭМГ. После фиксации всех электродов готовили смесь зубопротезного акрилата Vertex Self-Curing (Голландия) путем смешивания порошка и жидкости. Полученную смесь шпателем наносили на кости черепа вокруг каждого электрода. Образовывалась маленькая “шапочка” на черепе животного, способствующая окончательному прочному удерживанию электродов на своих местах. После полимеризации “шапочки” мышь вынимали из головодержателя стереотаксического прибора. Участок, подвергнутый хирургическому вмешательству, присыпали сухим стрептоцидом. Мышь помещали в камеру, гибкий кабель, идущий от головы наверх, подсоединяли к разъему поворотного токосъёмника («вертушки», Moog, США), используемого для предотвращения закручивания кабеля в условиях свободного перемещения животного по индивидуальной камере (рис. 7).
По истечении недельного периода послеоперационного отдыха выполняли фоновую 24-часовую запись ЭЭГ, ЭМГ, двигательной активности и видеорегистрацию поведения, после чего вводили МФТП – предшественник нейротоксина, разрушающий ДА систему, в объёме 0,3 мл физ. р-ра подкожно. Пронейротоксин вводили в трех дозах: 2х12 мг/кг (с 2-часовым интервалом), 4х12 мг/кг (с тремя интервалами по 2 часа каждый) и 1х40 мг/кг п/к. Контрольным животным производили аналогичные инъекции 0,3 мл физиологического раствора. 2.1.4. Ход опереации по введению трансгенного белка GDNF и введение пронейротоксина МФТП (2 этап исследования)
Перед установкой субдуральных электродов производили введение трансгенных клеток HEK/GDNF в стриатум мышей (группы животных №1 и №3). Суспензию около 200000 клеток в 2 микролитрах раствора Хенкса медленно вводили в течение 3 минут с правой, затем с левой стороны с помощью микрошприца. Для этого иглу микрошприца погружали в мозг через отверстия с координатами АР-0, ML-2.5 на глубину 2.5 мм. Затем иглу медленно поднимали до глубины 1,5 мм с одновременным вводом суспензии клеток. Аналогичным образом проводили введение клеток HEK/GFP животным 2-й группы. Затем, на третьи сутки, экспериментальным животным вводили подкожно 40 мг/кг пронейротоксина МФТП, избирательно разрушающего ДА клетки, растворенного в 0,3 мл физиологического раствора; контрольным животным вводили 0,3 мл физиологического раствора.
Первый этап Непрерывную регистрацию электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и электромиограммы (ЭМГ) проводили у 8 мышей одновременно с помощью двух 20-канальных программно-управляемых цифровых полисомнографов Leonardo-2000 (Германия), каждый из которых позволяет регистрировать до четырех параметров у 5 независимых объектов. Цифровые сигналы с выходов полисомнографов поступают на персональный компьютер через USB-входы, обрабатываются и накапливаются с помощью программного обеспечения полисомнографа. По окончании регистрации с помощью той же программы проводили визуальное стадирование полиграммы каждой мыши по 20-сек эпохам анализа. Характеристики записи представлены на рис. 8.
Идентифицировали состояния бодрствования, медленного и быстрого сна по стандартным критериям, применяемым для лабораторных грызунов: бодрствование – десинхронизация в лобной ЭКоГ, гиппокампальный тета ритм 5-7 Гц в теменно-латеральной ЭКоГ, высокий уровень амплитуды ЭМГ (рис. 9); медленный сон – высокоамплитудная дельта- и сигма активность в ЭКоГ, низкий уровень ЭМГ (рис. 10); быстрый сон – мощный высокоамлитудный и регулярный гиппокампальный тета-ритм 6-8 Гц в теменно-латеральной ЭКоГ, нулевой уровень ЭМГ (рис. 11). По завершении стадирования программа выдает в виде отчета количество стадий каждого из трех состояний за каждый час записи. Окончательная обработка, построение таблиц и графиков проводили в программе Excel. Статистический анализ проводится с помощью методов непараметрической статистики (дисперсионный анализ Фридмана и Крускал-Уоллиса, критерии Вилкоксона и Манна-Уитни).
Влияние пронейротоксина МФТП и трансгенного белка GDNF на цикл сон- 79 бодрствование и двигательную активность
Выявленные в 1 этапе исследовании изменения двигательной активности и цикла бодрствование-сон на МФТП-моделях доклинической, переходной и ранней клинической стадий БП у мышей позволяют прийти к следующему выводу. Очевидно, что подкожные введения 2х12, 4х12 и 1х40 мг/кг пронейротоксина, несмотря на умеренное (в первом случае) и значительное (во втором и третьем случаях) снижение количества ТН+ нейронов в области SNC, не вызывают ярко выраженных нарушений цикла бодрствование-сон. В светлый, преимущественно неактивный период суток, животные, получившие токсин, спали так же, как и контрольные особи. В активный, темный период суток животные, получившие токсин, становились более «суетливыми» (что характерно и для больных с БП3); что отчетливо прослеживается при просмотре видеозаписей. Это также отражалось в увеличении суммарной продолжительности бодрствования за счет уменьшения доли обеих фаз сна в темный период суток.
Полученные нами результаты представляется несколько неожиданным, если учесть важную роль восходящей дофаминергической системы в регуляции цикла бодрствование-сон (Ковальзон, 2013, 2016; Ковальзон, Завалко, 2013; Ковальзон и др., 2014; Lima, 2012). Исходя из этой роли, можно было ожидать, что частичное разрушение нейронов SNC приведет к снижению, а не повышению доли бодрствования в активный период суток (прямой эффект разрушения), а также к снижению доли быстрого сна – но не в темный, а в светлый, неактивный период (косвенный эффект) (Ковальзон, Завалко, 2013; Ковальзон и др., 2014). Показано, что МФТП в дозе 4х12 и, особенно, 1х40 мг/кг вызывает некоторые специфические моторные нарушения (снижение пробега и количества стоек в открытом поле, укорочение шага) (Ugrumov et al., 2011).
Таким образом, выраженные морфологические и специфические двигательные нарушения на этой модели БП сопровождаются выраженными изменениями цикла бодрствование сон. Следует предположить, что нисходящая дофаминергическая система функционально более уязвима по отношению к разрушительному действию нейротоксина МФТП, чем восходящая. Высокая функциональная устойчивость восходящих активирующих систем лиссэнцефалического мозга грызунов к нейротоксинам отмечена и в других работах (Ковальзон, 2013, 2016). Так, в работе (Blanco-Centurion et al., 2007) было показано, что локальные внутримозговые инъекции крысам сапорин-содержащих нейротоксинов, позволяющие «прицельно» разрушать химически специфичные нейронные тела, не приводят к значительным нарушениям цикла бодрствование–сон. Производимые этими авторами разрушения поражали до 75% гистаминергических нейронов туберомаммиллярных ядер заднего гипоталамуса, а также до 90% норадренергических клеток голубого пятна и холинергических клеток базальных ядер переднего мозга, почти не затрагивая окружающих клеток. При этом оказалось, что одновременное разрушение одной, двух и даже трех активирующих систем у одних и тех же животных приводит через 20 дней лишь к минимальным изменениям цикла сон–бодрствование.
Главным из этих изменений является двукратное снижение представленности бодрствования при переходе от светлого к темному периоду суток и быстрого сна - в светлое время суток. Предполагается, что другие восходящие активирующие системы (а их насчитывается уже не менее восьми, Ковальзон, 2011а,б, 2013а,б) принимают на себя выпадающие функции и компенсируют потерю разрушенных пронейротоксином клеток. Однако возможны и альтернативные точки зрения; так что, по сути, эти эффекты остаются пока неизученными (Ковальзон, 2016). В целом, разработка экспериментальных моделей паркинсонизма путем разрушения ДА нейронов SNC и VTA дала весьма противоречивые результаты в отношении сходства с симптомами нарушений цикла бодрствование-сон, характерными для больных БП. Так, частичное разрушение всех ДА систем мозга мышей С57BL/6, вызванное 5-дневной ежесуточной однократной системной инъекцией 25 мг/кг МФТП, приводило лишь к умеренному увеличению представленности быстрого сна в определенные часы регистрации (Monaca et al., 2004). Эффект возникал через 20 дней после интоксикации и исчезал через 40 дней, несмотря на необратимое 30% разрушение ДА нейронов SNC (Laloux et al., 2008). Интересно, что избирательное фармакологическое повышение синаптического содержания дофамина (путем системного введения ингибитора его обратного захвата) в этой модели приводило к подавлению быстрого сна, значительно более выраженному, чем у контрольных мышей. Аналогичный эффект вызывало и введение ингибитора обратного захвата норадреналина – антидепрессанта дезипрамина. В то же время другой антидепрессант - ингибитор обратного захвата серотонина циталопрам – подавлял быстрый сон и у подопытных, и у контрольных мышей в одинаковой степени. А агонист мускариновых рецепторов ареколин вызывал повышение представленности быстрого сна у подопытных, но не у контрольных мышей. В целом, мыши с разрушением ДА системы оказались гораздо более чувствительными к введению фармакологических препаратов, модулирующих аминергические и холинергические системы мозга, чем контрольные животные (Laloux et al., 2007).