Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы
2.1. Морфологическая организация стриатума 12
2.1.1. Место стриатума в системе подкорковых структур переднего мозга.. 12
2.1.2. Структура неостриатума и прилежащего ядра 14
2.1.3. Деление стриатума на дорсальный и вентральный отделы 16
2.1.4. Мозаичная организация стриатума 17
2.1.5. Афферентные проекции дорсального и вентрального стриатума 18
2.1.6. Эфферентные проекции дорсального и вентрального стриатума 23
2.2. Нейрохимическая организация стриатума 26
2.2.1. Парвальбумин-содержащие ГАМК-ергические интернейроны 28
2.2.2. Калретинин-содержащие ГАМК-ергические интернейроны 29
2.2.3. Холинергические интернейроны 29
2.2.4. NO-синтаза-содержащие интернейроны 31
2.3. Роль оксида азота в построении функций ЦНС 33
2.3.1. Общая характеристика оксида азота 33
2.3.2. Функциональная роль оксида азота в построении функций ЦНС 42
2.4. взаимодействие NO-ергической системы стриатума с другими нейромедиаторными Системами 44
2.4.1. Глутамат-МЭ-ергическое взаимодействие 44
2.4.2. Ацетилхолин-ЫО-ергическое взаимодействие 47
2.4.3. Дофамин-КО-ергическое взаимодействие 48
2.5. Участие no-ергической системы вентрального стриатума в организации поведения 51
2.5.1. Функциональная роль прилежащего ядра в организации поведения...51
2.5.2. Вклад Shell и Core отделов прилежащего ядра в реализацию
различных форм поведения 54
2.5.3. Участие NO-ергической системы в организации поведения 56
3.Материалы и методы
3.1. Характеристика прижизненного внутримозгового микродиализа 61
3.2. Схема проведения диализных экспериментов 64
3.2.1. Изготовление диализных канюль 64
3.2.2. Операция по имплантации диализной канюли в вентральный или дорсальный отдел стриатума 65
3.2.3. Диализный эксперимент 67
3.2.4. Морфологический контроль 67
3.3. Качественный и количественный анализ диализата на содержание аминокислот 68
3.3.1. Хроматографический анализ диализата 68
3.3.2. Модификация метода ВЭЖХ с электрохимической детекцией для хроматографического разделения и электрохимического определения цитруллина и аргинина 72
3.4. Статистическая обработка полученных результатов 73
3.5. Исследования влияния введений фармакологических препаратов на уровень внеклеточного цитруллина и аргинина 75
3.6. Исследования изменений уровня внеклеточного цитруллина в прилежащем ядре в ходе поведенческого тестирования 76
3.6.1. Выработка и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением 76
3.6.2. Выработка и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением на фоне блокады NO-ергической системы прилежащего ядра 78
Обсуждение полученных результатов 109
Выводы 121
Список литературы 123
Список сокращений
- Афферентные проекции дорсального и вентрального стриатума
- Глутамат-МЭ-ергическое взаимодействие
- Статистическая обработка полученных результатов
- Выработка и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением
Афферентные проекции дорсального и вентрального стриатума
Среди прочих подкорковых структур стриатум занимает "стратегически" важное место, являясь своеобразным коллектором афферентных входов, идущих к базальным ганглиям. Главными источниками этих входов служат неокортекс (преимущественно сенсомоторная кора), с которым стриатум связан функционально и морфологически, а также черная субстанция и неспецифические ядра таламуса, которые обеспечивают стриатум "сырой" сенсорной информацией еще до того, как она поступает для переработки в кору. Считается, что стриатум участвует в выборе из нескольких конкурирующих программ, запущенных корой, доминирующей, необходимой организму в данный конкретный момент, и переключает ее на конечный моторный путь для реализации наиболее адекватного поведенческого акта [Redgrave et al., 1999; Саульская и др., 2005]. Информация при этом через выходные структуры стриатума - черную субстанцию и паллидум по восходящим проекциям, пройдя ряд переключений, достигает моторной коры, обуславливая многозвенную петлеобразную связь между сенсомоторными и двигательными корковыми областями. Примечательно, что в данном случае по отношению к моторным областям коры стриатум выполняет роль афферентного звена.
Ранее базальные ганглии и, в частности, стриатум рассматривали в основном в связи с участием в контроле произвольных и непроизвольных движений. Это мнение опиралось, во-первых, на особенности организации афферентно-эфферентых проекций стриатума, а именно, на наличие связей этой структуры с моторными областями мозга. Кроме того, оно базировалось на том, что дисфункция структур базальных ганглиев приводит в первую очередь к двигательным патологиям: гиперкинезам, атетозу, гемибаллизму, тикам, тремору, торсионной дистонии и др. Нейродегенеративные процессы, развивающиеся в ткани стриатума, приводят к развитию ряда тяжелых патологий, таких как болезнь Парки неона, хорея Хантингтона, некроз стриатума.
В настоящее время стриатуму отводится важная роль в обеспечении целого ряда разнообразных функций: когнитивных, мнемонических, сенсомоторных [Суворов, 1980; Шаповалова и др., 1992; Шаповалова, 1997; Шуваев, 2001], а наиболее вентральные его отделы могут вовлекаться в регуляцию вегетативных функций и эмоционального реагирования. В организации различных форм условнорефлекторной деятельности стриатуму принадлежит особое место, что обусловлено взаимодействием на его уровне импульсацией двух качественно различных систем: кортикальной, несущей информацию о программах целостного поведения, и субкортикальной из ядер таламуса и лимбических структур, несущих информацию об изменениях в окружающей среде, мотивационно-эмоциональном состоянии центральной нервной системы и готовности организма к выполнению двигательной реакции в текущий момент времени [Суворов и др., 1978; Шаповалова, 1978; Толкунов, 1978; Чивилева, 1994, 1997; Суворов, 1997; Шуваев, 2001]. Более того, признана его причастность к механизмам внимания, восприятия, обучения, формирования привычек и эмоциональных состояний, памяти, мышления [Суворов, 1980; 1997; Шаповалова и др., 1992; Шаповалова, 1997; Шуваев, 2001], а также организации планирования и инициации движения [Heimer et al., 1982].
Неостриатум - подкорковое образование, составными частями которого выступают анатомически связанные между собой хвостатое ядро и скорлупа, характеризующиеся чередованием белого и серого вещества. По происхождению, нейронному составу, ходологии проводящих путей и нейрохимическому составу обе эти структуры сходны [Отеллин, 1973; Горбачевская, 1994; Горбачевская, Чивилева, 1994; 1998; Леонтович, Михальченко, 1997; Чивилева, 1997]. В эмбриональном периоде скорлупа и хвостатое ядро возникают как единое образование конечного мозга, которое разделяется на две структуры лишь в процессе индивидуального развития, но у некоторых групп животных, в частности у крыс, они остаются неразделенными в течение всего периода онтогенеза [Parent, 1986].
Топографическая организация прилежащего ядра.
Прилежащее ядро, на основании данных по цитоархитектонике, топографической организации афферентно-эфферентных проекций, нейрохимического состава, подразделяется на три основных отдела [Zahm, Heimer, 1990; Heimer et al., 1991; Шаповалова и др., 1992]: центральную часть составляет Core, располагающуюся по периферии Shell и ростральный пул прилежащего ядра [Zahm, Heimer 1993; Usuda et al., 1998]. С функциональной точки зрения прилежащее ядро делится на медиальный (преимущественно состоящий из медиального Shell), латеральный (включающий Shell и Core компоненты) и ростральный отдел прилежащего ядра [Zahm, 1998]. Медиальный отдел Shell является "переходной зоной" между стриатумом и "расширенной миндалиной" (функциональная группа ядер переднего мозга), включающей в себя черты обеих структур [Zahm, 1998].
Клеточный состав и внутренние связи неостриатума и прилежащего ядра Прилежащее ядро и неостриатум имеют довольно много общих черт строения из-за сходства этих структур по цитоархитектоническим, нейрофизическим и другим признакам. Это в первую очередь касается их клеточного состава, о практически полной идентичности которых сообщалось разными авторами [Chronister et al., 1981; Domesick, 1981; Hedereen, 1981; Rueda etal., 1986].
Стриатум является гетерогенной по клеточному составу структурой. Размеры его клеток варьируют от 10 до 50 мкм [Carpenter, 1984]. Однако основную массу нейронов стриатума млекопитающих составляют мелкие и средние клетки (10-18 мкм) [Kemp, Powell, 1971; Леонтович, Михальченко, 1997]. Цитологически нейроны стриатума можно подразделить на несколько типов [Kemp, Powell, 1971; Леонтович, Михальченко, 1997]. Среди них 3 типа короткоаксонных бесшипиковых нейронов (это интернейроны стриатума), на дендритах которых имеются варикозные утолщения, два типа шипиковых нейронов с длинными аксонами и дендритами (SI и SII) и один тип бесшипиковых нейронов крупных размеров, имеющих много дендритов и короткий аксон.
Глутамат-МЭ-ергическое взаимодействие
По мнению большинства авторов, одним из основных путей регуляции продукции оксида азота в ЦНС является активация глутаматергических рецепторов, расположенных на NO-ергических нейронах [Kuriyama, Ohkuma, 1995; West et al., 2002]. Предпосылкой глутамат-ЫО-ергического взаимодействия является физическая сопряженность НМДА рецептора глутамата с NO-синтазой через белки постсинаптической плотности PSD-95, PSD-93 [Brenman et al., 1996; Aoki et al., 1997]. Показано, что на NO-синтаза-содержащих интернейронах дорсального и вентрального стриатума оканчивается большое количество глутаматергических волокон из кортикальных областей [West et al., 2002; French, 2005]. Причем кортикальные глутаматергические проекции образуют синапсы не только на теле NO-ергических клеток, но и на их проксимальных дендритах [Vuillet et al., 1989; Salin et al., 1990], где имеются синаптические бутоны, также содержащие NO-синтазу [French et al., 2005]. За счет таких прямых морфологических связей глутаматергические кортико-стриатные входы могут играть важную роль в стимуляции NO-синтаза-содержащих нейронов и активации нитроергической передачи в стриатуме [West et al., 2002]. Данные, полученные в микродиализных экспериментах, подтверждают это предположение. Так, в дорсальном стриатуме локальная глутаматергическая стимуляция увеличивает образование NO (по показателям образования ко-продукта NO цитруллина и его метаболитов - нитритов и нитратов) с использованием НМДА и АМПА/каинатных рецепторов глутамата [Kendrick et al., 1996; Ohta et al., 1996; Centonze et al., 1999]. А, по последним данным нашей лаборатории, введения в вентральный стриатум НМДА приводят к увеличению продукции внеклеточного цитруллина в этой структуре, которое полностью блокируется антагонистами НМДА рецепторов и ингибиторами NO-синтазы [Соловьева и др., 2005].
Механизм стимулирующего действия глутамата на продукцию оксида азота заключается во взаимодействии этого медиатора с НМДА рецепторами постсинаптической мембраны NO-ергических нейронов. Благодаря структурной связи НМДА рецептора с NO-синтазой [Brenman et al., 1996; Aoki et al., 1997], его активация немедленно ведет к активации NO-синтазы через увеличение внутриклеточного кальция [Bhardwaj et al., 1998; Martinelly et al., 2002; рис.6]. Показана важная роль в этом процессе АМПА/каинатных рецепторов, поскольку они ответственны за перевод мембраны постсинапса в состояние деполяризации - необходимого условия активирования сопряженных с НМДА-рецепторами кальциевых каналов.
Выбрасываясь в межклеточное пространство, глутамат связывается со своими рецепторами, расположенными не только на постсинаптическом нейроне, но и на астроцитах [Ohta et al., 1996], на мембране которых обнаружены практически все рецепторы глутамата, преимущественно метаботропные рецепторы I типа и II типа [Petralia et al., 1996], а также АМПА/каинатные [Martin et al., 1993] и, по некоторым данным, НМДА рецепторы [Grace, Pickel, 1996]. Связываясь с этими рецепторами, глутамат способствует выходу кальция из внутриклеточных депо и выбросу аргинина (предшественника N0) в межклеточное пространство [Silva et al., 2001]. Кроме того, захват аргинина глиальными клетками также регулируется посредством активации глутаматергических рецепторов [Do et al., 1996]. В астроцитах, к тому же, обнаружено небольшое количество NO-синтазы, как индуцируемой, так и конститутивной форм [Galea et al., 1992; Simmons, Murphy, 1992; Murphy et al., 1993; Demerle-Pallardy et al., 1993].
Глутамат-ЫО-ергическое взаимодействие носит реципрокный характер, поскольку NO может стимулировать кальций-зависимый выброс глутамата из синаптических везикул в гиппокампальных синаптосомах [Meffert et al., 1994] и оказывать ингибирующее модулирующее воздействие на НМДА-рецепторный комплекс [Garthwaite, Boulton, 1995], что представляет собой еще один путь регуляции этих рецепторов по типу отрицательной обратной связи, наблюдаемой в физиологических условиях.
Статистическая обработка полученных результатов
Для исследования нейрохимических механизмов, регулирующих внеклеточное содержание цитруллина и аргинина в дорсальном и вентральном стриатуме, был проведен ряд фармакологических экспериментов, в ходе которых в перфузионную жидкость, прокачиваемую через диализную канюлю, добавляли следующие фармакологические агенты: для дорсального стриатума: 1) тетродотоксин (1 мкМ, Sigma, США) (п=6); 2) КС1 (калиевая деполяризация, ЗОмМ, Реахим, Россия) (п=11); 3) апоморфин (ЮОмкМ, Sigma,CLLIA) (п=8); 4) раклопрайд (ЮмкМ, RBI, США) (п=8); 5) SCH-23390 (50мкМ, RBI, США) (п=6); 6) смесь апоморфина (ЮОмкМ) и SCH-23390 (50мкМ) (п=5); 7) смесь апоморфина (ЮОмкМ) и раклопрайда (ЮмкМ) (п=9); 8) N-нитро-Ь-аргинин (1мМ, ICN, США) (п=8); 9) смесь N-нитро-Ь-аргинина (1мМ) и апоморфина (ЮОмкМ) (п=7); для вентрального стриатума: 1) аргинин (50мкМ, Реахим, Россия) (п=6); 2) аргинин (500мкМ, Реахим, Россия) (п=6); 3) N-нитро-Ь-аргинин (1мМ)(п= 12); 4) смесь N-нитро-Ь-аргинина (1мМ) и аргинина (50мкМ) (п=6); 5) смесь N-нитро-Ь-аргинина (1мМ) и аргинина (500мкМ) (п=6). Раствор фармакологического препарата в ИСМЖ помещали в один из каналов многоканального диализного насоса. Через другой канал осуществляли подачу к вживленной в мозг канюле ИСМЖ. После сбора фоновых проб производили быстрое переключение потока жидкости от одного канала к другому, содержащему раствор вводимого вещества. Длительность процедуры переключения была не более 1-2 сек. После этого отменяли действие фармакологических препаратов и делали отмывку, снова прокачивая через канюлю ИСМЖ. Эксперименты с применением микродиализа проводили на второй и третий день после имплантации диализных канюль в медиальную часть правого прилежащего ядра.
Установка для выработки эмоционального условного ответа представляла собой квадратную камеру (25 x25см) высотой 38см с проволочным покрытием пола, разбитого на 4 квадрата для регистрации перемещений крысы. Одна из стен установки была из полупрозрачного материала, позволяющего наблюдать за поведением крысы. За задней стенкой установки был закреплен динамик для подачи звукового условного сигнала - тона частотой 1000Гц. Рядом с камерой находилась дневная домашняя клетка, имеющая те же размеры.
Перед началом экспериментов животных делили на две группы: контрольную и опытную. В первый день экспериментов каждую крысу помещали в дневную домашнюю клетку и начинали диализную перфузию прилежащего ядра. После периода стабилизации (через час) собирали 6 фоновых порций диализата (по 5 мин). Затем у животных опытной группы (п=8) проводили выработку классического (Павловского) условного рефлекса с болевым подкреплением (другие названия - реакция условнорефлекторного страха [Phillips, Le Douxe, 1992], эмоциональный условный ответ [Saulskaya, Marsden, 1995]). В ходе выработки такого рефлекса животное ассоциирует условнорефлекторные звуковые (тон) и обстановочные (условнорефлекторная камера) стимулы с неизбегаемым болевым раздражением [Phillips, Le Douxe, 1992; Saulskaya, Mikhailova, 2002]. Мерой выработанное такого рефлекса является замирание животного в ответ на предъявление условных стимулов (обстановочных и звуковых), ранее сочетавшихся с ударами тока, что отражается в удлинении периодов отсутствия движений. Каждую крысу помещали на 5 мин в условнорефлекторную камеру, где ей предъявляли условный стимул -тон (1000Гц, 10с), сочетаемый на последней секунде своего звучания с электрокожным раздражением лап (0.5мА, 1с). Процедуру обусловливания повторяли 5 раз с интервалом 1 мин (обучение 1), после чего крысу возвращали в дневную домашнюю клетку. Через час выработку рефлекса повторяли (обучение 2). Через час после обучения 2 начинали процедуру угашения рефлекса: проводили две угасательных сессии (угашение 1 и угашение 2) тоже с интервалом в 60 мин. Каждую крысу помещали в условнорефлекторную камеру на 10 мин, где ей раз в минуту предъявляли тон (1000Гц, Юс), не сочетавшийся с ударами тока, после чего животное возвращали в дневную домашнюю клетку. Через 20 мин после окончания угасательной сессии 2 диализный эксперимент прекращали и крысу помещали в ночную домашнюю клетку со свободным доступом к воде и пище до утра. С животными контрольной группы 1 (п=7) проделывали те же процедуры, но без электрокожного раздражения лап во время двух первых поведенческих сессий (контроль к обучению 1 и 2). Утром диализные эксперименты возобновляли на тех же крысах: после стабилизационного периода (час) и сбора 6-ти фоновых порций диализата с каждым животным опытной группы проводили две угасательных сессии (по 10 мин) с интервалом в 1 час (угашение 3, угашение 4), как описано выше. Через 50 мин после окончания угасательной сессии 4 осуществляли восстановление рефлекса: крысу помещали на 5 мин в экспериментальную камеру, где ей предъявляли тон в сочетании с ударами тока в таком же стереотипе, как во время обучения 1 и 2. Через 25 мин эксперимент завершали. С животными контрольной группы проделывали те же процедуры (помещали в камеру и предъявляли звуковые условные сигналы в том же временном стереотипе, что и животным опытной группы), но во время последней сессии (контроль к восстановлению рефлекса) тока не предъявляли. Пятиминутные порции диализата собирали непрерывно в ходе эксперимента.
Во время пребывания животных в условнорефлекторной камере с помощью электронного секундомера, имеющего функцию накопления показаний (Kadio, Китай), регистрировали время периодов неподвижности на условные (звук) и обстановочные (камера) стимулы (отсутствие всех движений, кроме дыхательных), характеризующее выработанность классического условного рефлекса на болевом подкреплении [Phillips, Le Douxe, 1992]. Критерием угашения рефлекса было уменьшение периодов неподвижности в ходе угасательных сессий.
Выработка и угашение классического условного рефлекса на звук с болевым подкреплением
Введения селективного блокатора нейронной изоформы NO-синтазы - 7-нитроиндазола (0.5мМ) и необратимого и неселективного блокатора NO-синтазы - N-нитро-Ь-аргинина (0.5мМ) в прилежащее ядро в ходе выработки классического условного рефлекса с болевым подкреплением не приводили к достоверным изменениям длительности замирания на тон и звук относительно соответствующих параметров животных, у которых выработка рефлекса осуществлялась без введения блокаторов (табл. 1 и 2). Более того, введения 7-нитроиндазола в ходе выработки рефлекса не приводили к достоверным изменениям периодов замирания в ходе реализации этого рефлекса по сравнению с крысами без введений данного блокатора (табл. 1 и 2), что свидетельствует об отсутствии влияний введений блокаторов NO-синтазы в прилежащее ядро на процесс выработки данного рефлекса.
В отличие от этого, введения 7-нитроиндазола (0.5мМ) в ходе реализации рефлекса (угасательные сессии 1 и 2) сопровождались существенным укорочением периодов замирания на тон (t=5.6, рО.001 и t=4.4, рО.001, соответственно для угасательной сессии 1 и 2) и камеру (t=2.3, р=0.03 и t=2.5, р=0.03, соответственно для угасательной сессии 1 и 2) по сравнению с животными, не подвергавшимися введению блокаторов в ходе реализации рефлекса (табл.1 и 2), что возможно отражает ухудшение реализации данного рефлекса. В ходе угасательной сессии 3, проводимой без введений блокатора через сутки после введения 7-нитроиндазола в ходе угасательных сессий 1 и 2 также наблюдалось укорочение периодов замирания на звук (t=2.5, р=0.03), но не на камеру (t=1.5, р=0.15) по сравнению с данным параметром животных, не подвергавшихся введениям блокатора в ходе выработки и реализации рефлекса.
Введения необратимого и неселективного блокатора NO-синтазы - N-нитро-L-аргинина (0.5мМ) в прилежащее ядро в ходе реализации классического условного рефлекса с болевым подкреплением (угасательные сессии 1 и 2) также сопровождалось укорочением периодов замирания на звук в ходе угасательных сессий 1 и 2 (табл. 1; t=2.6, р=0.03 и t=2.5, р=0.03, соответственно).
У животных контрольных групп 2 и 3, которым вводился 7-нитроиндазол, либо Ы-нитро-Ь-аргинин во время угасательных сессий 1 и 2 (рис.21), не зарегистрировано достоверных различий в длительности периодов замирания на предъявление звуковых и обстановочных стимулов при сравнении с данными параметрами крыс контрольной группы 1, не подвергавшихся фармакологическому вмешательству.
Влияние N-Humpo-L-аргиншш на изменения уровня внеклеточного ицтруллина в прилежащем ядре при выработке и угашений классического условного рефлекса с болевым подкреплением
Выработка классического условного рефлекса с болевым подкреплением на фоне введений №нитро-Ь-аргинина (0.5мМ) в прилежащее ядро не сопровождалась изменениями уровня внеклеточного цитруллина в этой структуре в ходе обеих поведенческих сессий относительного собственного фонового уровня перед поведенческим тестированием (рис.22; F(i і,зб)=0.78, р=0.7 для обучения 1 и F(n(36)=l,0, р=0.5 для обучения 2). Межгрупповое сравнение показало, что у животных без введений блокатора в ходе выработки рефлекса наблюдались достоверно более высокие изменения уровня цитруллина в прилежащем ядре как в ходе обучения 1 (t=2.7, р=0.02) так и в ходе обучения 2 (t от 2.1 до 2.4, р от 0.05 до 0.03) по сравнению с крысами, подвергавшимися введениям N-нитро-Ь-аргинина (рис.22).
Реализация классического условного рефлекса с болевым подкреплением (угашение 1 и 2), проводимая на фоне введения К-нитро-Ь-аргинина (0.5мМ), также не сопровождалась изменениями уровня цитруллина в прилежащем ядре в ходе обеих угасательных сессий (рис.23; F(iі,зб)=1 -4, р=0.24 для угашения 1 и F(ii,36)=l-6, р=0.13 для угашения 2). Межгрупповое сравнение выявило достоверные отличия по уровню цитруллина в ходе угасательных сессий l(t от 2.3 до 3.7, р от 0.04 до 0.004) и угасательной сессии 2 (t от 2.8 до 4.1, р от 0.02 до 0.002) между животными с введениями и без введений N-нитро-Ь-аргинина (рис.23).
