Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика эритроцитов и их участие в реакциях организма при изменении параметров среды 12
1.1. Функциональная морфология эритроцитов и их участие в адаптивных гомеостатических реакциях организма 12
1.1.1. Особенности морфологии 12
1.1.2. Функциональная активность эритроцитов 16
1.1.2.1. Реологические свойства 16
1.1.2.2. Резистентность и реактивность 18
1.2. Метаболизм эритроцита. Метаболизация глюкозы 26
1.3. Жизненный цикл эритроцита. Кинетика эритропоэза 32
1.4. Особенности эритрона птиц 35
1.5. Проблема стресса и адаптации 40
1.5.1. Стресс у сельскохозяйственной птицы 44
1.5.1.1. Характеристика стрессорных состояний 44
1.5.1.2. Стрессиндуцированные поведение и гемопоэз 51
1.6. Физиологические аспекты использования минералосорбентов в птицеводстве 55
1.6.1. Общая характеристика сорбционно-активных веществ и их роль в кормлении птицы 55
1.6.2. Характеристика минеральной добавки «Экое» 58
Резюме 60
Глава 2. Материалы и методы исследования 63
2.1. Организация эксперимента 63
2.2. Обоснование методик исследования 75.
2.2.1. Методы тестирования стресса 75
2.2.2. Методы исследования морфологии эритроцитов 77
2.2.3. Методы изучения функциональных свойств эритроцитов 82
2.2.4. Методы исследования кинетики эритропоэза 87
2.2.5. Методы биохимического исследования тканей 91
2.3. Методы статистической обработки 93
Глава.3. Исследование физиологических особенностей эритроцитарного гомеостаза у птиц при функциональных нарушениях организма 94
3.1. Состояние эритроцитарного гомеостаза у птиц (фоновое исследование) 94
3.1.1. Функциональная морфология эритроцитов. Возрастной состав циркулирующего эритроцитарного пула 95
3.1.2. Процессы кинетики в эритроне 107
3.2. Влияние инверсии светотемнового цикла на состояние эритроцитарного гомеостаза (острый стресс) 111
3.2.1. Гематологический профиль и функциональная морфология эритроцитов в динамике адаптации к инверсии фотопериода 114
3.2.2. Костно-мозговое кроветворение в динамике адаптации к фотовоздействию 132
3.3. Влияние плотности посадки птицы на состояние эритроцитарного гомеостаза (хронический стресс) 141
3.3.1. Гематологический профиль и структурная лабильность эритроцитов 143
3.3.2. Физиологические свойства эритроцитов 149
3.3.3. Проницаемость и сорбционная ёмкость мембран эритроцитов в динамике длительного стрессирования 166
3.4. Влияние экспериментально изменённого гликемического гомеостаза на картину красной крови 175
Глава 4. Влияние природной полиминеральной добавки статус эритроцитов крови сельскохозяйственной птицы 190
4.1. Влияние на метаболизм, рост, продуктивность и резистентность... 190
4.1.1. Влияние на метаболизм (баланс и конверсия веществ корма) 190
4.1.2. Влияние на рост и продуктивность 195
4.2. Общая резистентность птицы при включении в рацион полиминеральной добавки 206
4.3. Дыхательная функция крови при включении в рацион полиминеральной добавки 219
4.3.1. Дыхательная функция крови утят 220
4.3.2. Дыхательная функция крови цыплят-бройлеров 229
4.3.3. Дыхательная функция крови кур-несушек 234
4.4. Влияние «Экое» на кислотно-основной гомеостаз 238
Глава 5. Обсуждение результатов 245
Выводы 266
Практические предложения 270
Список сокращений 271
Приложения 273
Список литературы 279
- Стрессиндуцированные поведение и гемопоэз
- Методы исследования морфологии эритроцитов
- Функциональная морфология эритроцитов. Возрастной состав циркулирующего эритроцитарного пула
- Влияние на метаболизм (баланс и конверсия веществ корма)
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Современный подход к раскрытию механизмов адаптации к изменённой среде жизнедеятельности организма требует знания физиологических функций на молекулярно-генетическом и клеточном уровнях (Меерсон Ф.З., 1981; Репин В.С., Сухих Г.Т.,1998; Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., 2002; Озернюк Н.Д., Нечаев С.К., 2002; Шахламов В.А., 2002; Агаджанян Н.А., Губин Д.Г., 2004; Lee E. et al., 2001).
Для комплексной оценки уровней и напряжённости протекания процессов адаптации и компенсации в качестве естественной и доступной модели перспективно использовать эритроциты (Сыроешкин А.В. и соавт., 2002; Матюшичев В.Б., Шамратова В.Г., 2005; Погорелов В.М., Козинец Г.И., 2005), их мембраны адекватно отражают состояние и свойства цитомембран других тканей (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981; Кагава Я., 1985; Постнов Ю.В., Орлов С.Н., 1987; Kamani G. et al., 1998). Известна ключевая роль эритроцитов в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций и обеспечение гомеостаза на уровне всего организма (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983; 1984; Кассиль Г.Н., 1981, 1987; Фок М.В. и соавт., 1999; Судаков К.В., Захаров Ю.М., 2002; Рязанцева Н.В. и соавт., 2005; Игнатьев В.В. и соавт., 2006; Sprandel V., 1985). Эритроциты крови нашли применение в доклинических испытаниях лекарственных препаратов (Соминский В.Н и соавт., 1989; Ройтман Е.В., 2005; Муравьев А.В и соавт., 2007), в качестве носителей для органоспецифической и контролируемой адресной доставки лекарственных средств в очаг поражения (Генинг Т.П. и соавт., 1988), при оценке действия эндо- и экзотоксинов на живые системы (Леонтьева О.А., Семенов Д.В., 1997; Манских В.Н., 2007).
C возросшим антропогенным прессингом для профилактики нарушений обмена веществ у сельскохозяйственной птицы, предупреждения токсикозов, элиминации токсичных веществ, повышения продуктивности, комплексной регуляции минерального обмена широко внедряются природные минералы (Фисинин В.И., 1986, 1990, 2004; Кузнецов С.Г., 1993, 2001; Шапошников А.А., 1998; Тугемский Л.И., 1999; Воронков М.Г., Барышок В.П., 2005), благодаря присущим им свойствам – селективный ионообмен и энтеродоноросорбция (Брек Д., 1976; Энтеросорбция, 1991). Поскольку эритроцитарная система функционирует в соответствии с текущим состоянием организма (Горожанин Л.С., 1979), в качестве индикатора безопасности и эффективности применения природных минералов и препаратов на их основе в птицеводстве может быть применён эритроцит – в динамике его структурно-функциональных и кинетических преобразований в процессе выращивания птицы.
Исследования крови птиц, судя по результатам анализа научной литературы, имеют преимущественно прикладной характер, при этом слабо учитывается своеобразие крови у этой группы животных. Существующие знания по функциональной морфологии эритроцитов недостаточны, слабо систематизированы, что не позволяет эффективно использовать их при разработке методов экспресс-анализа физиологического благополучия птицы. Морфологический метод исследования крови не нашел должного практического применения. До настоящего времени отсутствовали комплексные работы, отражающие физиологические особенности эритроцитарного гомеостаза у сельскохозяйственной птицы в естественных условиях жизнедеятельности и при адаптации к стрессорам. Исследование их позволит решать широкий круг перспективных прогностических задач.
Цель и задачи исследования. Цель работы - установить закономер-ности адаптации системы красной крови в динамике развития измененных состояний организма, вызванных стрессорами различной природы, а также возможность стабилизации ее параметров без ущерба физиологическому состоянию птицы путем применения природной сорбционно-активной полиминеральной кормовой добавки «Экос», полученной из гидроалюмосиликатов месторождений Белгородской области.
Для достижения цели в исследовании решаются следующие задачи:
– обобщить известные методы морфометрии и идентификации субпопуляций эритроцитарной системы на случай исследования эритроцитов крови птицы;
– разработать способы оценки кинетики, активности эритропоэза, позволяющие характеризовать эритроцитарный гомеостаз в физиологических условиях и при адаптации к стрессорам, а также способы ранней диагностики функционального состояния организма птицы;
– установить гематологический статус, морфометрический профиль, физиологические свойства эритроцитов периферического звена эритрона, выявить зависимость динамики и направленности их перестроек и восстановления под влиянием десинхронизирующих факторов;
– изучить возрастной состав циркулирующего эритроцитарного пула и его стрессорную динамику;
– определить кинетику эритропоэза и его резервную мощность в генезе изменённых состояний организма птицы;
– исследовать возможность стабилизации параметров красной крови на оптимальном для поддержания кислородного гомеостаза уровне без ущерба физиологическому состоянию птицы путём применения в рационе природной сорбционно-активной полиминеральной добавки.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые на основе интегрированного подхода проведено комплексное исследование эритроцитарного гомеостаза птицы, включающего оценку стандартных гематологических характеристик, геометрического профиля, состояния мембранного аппарата и физиологических свойств эритроцитов периферического звена эритрона, а также кинетики эритропоэза в естественных условиях и в динамике изменённых состояний организма, вызванных факторами различной природы.
Впервые дана количественная оценка кинетики и резервной мощности эритропоэза. Установлено, что интегральным показателем напряжения костно-мозгового кроветворения и активности эритропоэза у птиц, как и у млекопитающих, служат число ретикулоцитов и степень их созревания. Разработана модель для достаточно обоснованного прогноза развития адаптационных процессов в организме, базирующаяся на статистической идентификации субпопуляций эритроцитарной системы.
Впервые на основе определения реактивности эритроцитов крови по степени структурно-функциональной дестабилизации мембран показана возможность осуществления адекватной оценки состояния эритроцитов, включая ситуации их визуальной морфологической целостности. Экспериментально подтверждена для клеток красной крови, в том числе и птицы, высокая чувствительность к флуктуации уровня гликемии.
Показана возможность стабилизации параметров эритроцитарного гомеостаза без ущерба физиологическому состоянию птицы при применении природной сорбционно-активной полиминеральной кормовой добавки «Экос».
Научная новизна проведенного исследования подтверждена шестью патентами Российской Федерации на изобретения: № 2227280 от 20.04.2004 г.;
№ 224235 от 20.02.2004 г.; № 2234701 от 20.08.2004 г.; № 2268463
от 20.01.2006 г.; № 2336046 от 20.04.2008 г.; № 2350952 от 27.03.2009 г.
Практическая значимость исследования. Материалы диссертации расширяют представления о структурно-функциональных свойствах эритроцитов и их роли в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций и поддержание гомеостаза организма. Новые данные по кинетике эритропоэза у птиц с коротким жизненным циклом эритроцитов дают возможность на клеточном уровне в свёрнутом виде оценить поведение биологической системы при чрезмерно высоком напряжении физиологических функций в организме.
Разработанные способы изучения клеток крови легли в основу новой технологии, базирующейся на комплексном оперативном исследовании функциональной морфологии клеток красной крови, которую можно рекомендовать в качестве интегрального теста оценки адаптивного резерва птицы в ветеринарной практике. Работоспособность предложенных способов изучения системы эритрона проверена в лаборатории «Болезни птиц» Белгородской межобластной ветеринарной лаборатории и ветлаборатории птицекомплекса «Яснозоринский» Белгородского района Белгородской области.
Установлено, что для стабилизации параметров эритроцитарного гомеостаза, повышения общей резистентности и физиологического статуса организма, сохранности поголовья, улучшения качества и экологической чистоты мяса и яиц целесообразно к сбалансированным рационам молодняка птицы, выращиваемого на мясо, и курам-несушкам добавлять полиминеральную добавку «Экос» в дозировке 100-150 и 250 мгкг-1 массы тела соответственно.
Результаты диссертационного исследования реализованы в учебном процессе Белгородского государственного университета на кафедрах анатомии и физиологии человека и животных, биохимии и фармакологии в курсах медико-биологических дисциплин, медико-биологических основ физической культуры и спорта, а также могут быть использованы в ходе изучения соответствующих разделов физиологии в других вузах. Отдельные материалы диссертационной работы по разрабатываемой проблеме были положены в основу 5 кандидатских и одной магистерской диссертаций, выполненных под руководством соискателя.
Защищённые патентами РФ способы изучения крови рекомендованы научным работникам и ветеринарным службам для внедрения в практику оценки системы крови птиц.
Положения, выносимые на защиту:
1. Многопиковые эритрограммы статистического распределения по размерам диаметров эритроцитов, отражающие гетерогенные популяции (группы) клеток, участвующих в формировании циркулирующего эритроцитарного пула, являются специфической особенностью эритрона птицы.
2. Типовая неспецифическая и независимая от первичного стрессогенного фактора реакция, проявляющаяся в первые сутки как дисбаланс эритроцитарного гомеостаза, обусловлена поступлением в кровоток эритроцитов депонированных старых, деструктивных и стрессорных de novo, готовых к гемолизу.
3. Качественные изменения в системе красной крови отражают деструктивные процессы в эритроидном ростке костного мозга и мембранах, влияющих на функциональную активность эритроцитов и проявляющихся в виде фазовых изменений проницаемости эритроцитарных мембран, их сорбционной ёмкости и устойчивости к гемолитикам.
4. Кинетика эритропоэза зависит от вида, интенсивности и длительности воздействия на организм стрессирующего фактора. Интегральным показателем развития репаративных процессов в эритроне птицы служат число ретикулоцитов и степень их зрелости.
5. Эритроциты птиц высоко реактивны к флуктуации гликемии независимо от вида стрессорного воздействия.
6. Полиминеральная природная добавка «Экос» в рационе утят, цыплят-бройлеров и кур-несушек способствует стабилизации параметров красной крови в пределах верхних значений нормы, положительно влияет на физиологическое состояние, повышает продуктивность и экологическую чистоту мяса и яиц.
Апробация результатов работы. Основные положения, результаты и выводы диссертации доложены и опубликованы в материалах 47 Международных, всесоюзных, российских съездов, конгрессов, симпозиумов, конференций в период с 1980 по 2009 г., включая: Всесоюзные съезды физиологического общества им. И.П. Павлова ( XII - Тбилиси, 1975; XIII -Алма-Ата, 1979; XIV -Баку, 1983; XV - Кишинёв, 1987); VII Научное совещание по эволюционной физиологии (Ленинград, 1978); III и IV (Сыктывкар, 1993, 1997) Международные симпозиумы по сравнительной электрокардиологии; Российскую научно-практическую конференцию «Экология, здоровье и природопользование» (Саратов, 1997); Международную научно-практическую конференцию «Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия и пути их решения» (Брянск, 1999); I и II Международные симпозиумы «Миграция тяжёлых металлов и радионуклидов в звене: почва – растение (корм, рацион) – животное – продукт животноводства – человек» (Великий Новгород, 2000, 2001); Всероссийскую конференцию, посвящённую памяти и 95-летию со дня рождения
В.А. Пегеля (Томск, 2001); V (2004) и VI (2005) Международные научные конференции «Успехи современного естествознания» (ОК «Дагомыс», Сочи); I, II и III Российские научные конференции с международным участием «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2004, 2006, 2008); XIX (Екатеринбург, 2004) и XX (Москва, 2007) Съезды Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова; сателлитный симпозиум «Экология и здоровье» XX Съезда физиологов России (Москва, 2007); II Российскую научную конференцию с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2005); I Съезд физиологов СНГ (Сочи – Дагомыс, 2005); V Сибирский физиологический съезд (Томск, 2005); Всероссийскую научную конференцию «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006); VI Международную конференцию «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)» (Ярославль, 2007); V научную конференцию с международным участием «Гомеостаз и эндоэкология» (Хургада – Египет, 2007); I Международный конгресс ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства» (Санкт-Петербург, 2008); II Съезд Российского общества медицинской элементологии (РОСМЭМ) (Тверь, 2008).
Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 60 работ, среди них 2 монографии, 15 работ в изданиях из списка ВАК, методические рекомендации (2), получено 6 патентов РФ на изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащего 605 отечественных и зарубежных источни-ков, и пяти приложений. Диссертация изложена на 340 страницах машинопи-си, включает 52 таблицы и 46 рисунков.
Связь работы с научными программами (проектами) и темами.
Исследование, составившее основное содержание диссертационной работы, выполнено при финансовой поддержке МО РФ (Программа «Государственная поддержка региональной научно-технической политики высшей школы и развитие её научного потенциала», проект № 449-1632, 1999-2002 гг.), Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 01-04-97-406, 2000-2002 гг., № 03-04-96-473, 2003-2005 гг.), хоздоговорных тем: «Физиолого-токсикологическая оценка сорбирующей кормовой добавки в птицеводстве»; «Создание местной минерально-сырьевой базы глин и мергелей для очистки воды и производства кормовых и пищевых добавок и лекарственных препаратов для выведения радиоактивных и тяжёлых элементов из организма сельскохозяйственных животных и человека» (1997-1999 гг.).
Стрессиндуцированные поведение и гемопоэз
Резистентность эритроцитов - устойчивость «к воздействию различных повреждающих факторов среды, реализуемых на основе общебиологического принципа гомеостаза» (Словарь физиологических терминов /отв. ред. О.Г. Газенко — М.: Наука, 1987 - С. 316) - оценивается их способностью противостоять разрушительным воздействиям, обусловлена свойствами плаз- молеммы и служит выражением её важнейшей функции — барьера для прохождения веществ и осуществления избирательного их транспорта. Реактивность — свойство живой системы «отражать воздействия внешней среды» (там же, с. 311) - проявляется в форме цепной реакции нарастающих, затухающих или фазовых колебаниях состава, физико-химических и биологических свойствах крови, элиминации метаболитов, гормонов, изменениях проницаемости гистогематических барьеров и тонуса регуляторных систем (Кассиль Г.Н., 1981). С усложнением организации животных эволюционировали формы и механизмы реактивности. Реактивность простейших и многих беспозвоночных ограничивается изменением метаболизма и смыкается с проблемами их экологии — температура, влажность, содержание в среде кислорода, обеспеченность кормом. Экспериментальное исследование неспецифической реактивности и резистентности у высших организмов к экстремальным факторам выявило колебания физиолого-биохимических параметров в достаточно узких гомеостатических границах, оптимальных для конкретной жизненной ситуации.
Реактивность клетки оценивается диапазоном её функциональной активности, в том числе лабильностью биохимических процессов и способностью к ауторегуляции с участием универсальных филогенетически древних мембранных рецепторных структур. На клеточном уровне в процесс адаптации к изменению средовых факторов, действию сигнальных молекул вовлекаются йонтранспортирующие системы. При этом реакция клеток зависит от типа и соотношения рецепторов, экспрессированных на мембране, вторичных посредников, субстратов, киназ (Теппермен Дж.., Теппермен X., 1989).
Проблема исследования механизмов, оценки и прогнозирования индивидуальной реактивности организма и его резистентности к действию различных стресс-факторов не утратила актуальности и связана с решением ряда как теоретических, так и сугубо практических задач. Экспериментальные исследования неспецифической реактивности и резистентности млекопитающих животных и человека к экстремальным физическим факторам выявили ведущую роль в их формировании регуляторных систем, главная из которых - центральная нервная система (Кассиль Г.Н., 1981, 1987; Ушаков И.Б., Штемберг A.C., 2007). Однако если в физиологических условиях нервная регуляция является ведущей, то при возмущающих воздействиях и сопутствующих нарушениях гомеостаза состояние самой нервной системы становится зависимым от химических сдвигов в составе и свойствах как общей внутренней среды, так и непосредственной - микросреды клеток.
Исследование реактивности и резистентности клетки позволяет на основе гипотезы о функциональной надёжности регуляторных систем, используя интегральный показатель клетки, разрабатывать методы прогнозирования индивидуальной (и видовой) резистентности организма. А.В. Сыроешкин и соавт. (2002) методом лазерной дифракции распределения клеток (в том числе и крови) по размерам и форме разработали новые подходы к исследованию физиологии клетки для диагностики и мониторинга заболеваний и сформулировали общую теорию клеточного формообразования.
Для клеток крови интегральным и регулируемым показателем служит объём. При изменении осмоляльности цитоплазмы или интерстициальной жидкости возрастает скорость ионных потоков, контролируемых системами мембранного транспорта, ответственных за восстановление объёма клетки после первичного сжатия — регуляторное увеличение объёма (regulatory volume increse - RVI), и набухания — регуляторное уменьшение объёма (regulatory volume descrease - RVD) (Орлов C.H., Гурло Т.Г., 1991).
Объём клетки и его регуляция. Живая клетка — подвижная саморегулирующаяся система, её внутренняя организация поддерживается активными процессами, направленными на устранение, предупреждение или сглаживание сдвигов, вызванных стимулами из внешней или внутренней среды. Способность возвращаться к исходному объёму после отклонения от некоторой величины, вызванного возмущающим фактором, — особое преимущество клетки как животной, так и растительной (Kinne R., 1993).
В последние годы в зоне внимания исследователей — изучение механизмов, позволяющих клеткам крови изменять и регулировать объём. Решение вопроса взаимосвязано с раскрытием кинетики объёмзависимых транспортных систем, механизмов внутриклеточной сигнализации, выявлением специализированного или специфического сенсора, воспринимающего информацию об изменении объёма клетки, и последующего его усиления и трансмиссии на соответствующую ионтранспортирующую систему (Конев
C.B., 1987; Орлов C.H., Гурло Т.Г., 1991; Орлов С.Н., Новиков К.Н., 1996). При изменении осмоляльности экстрацеллюлярной жидкости возрастает скорость объёмчувствительных ионных потоков: при уменьшении объёма клетки активируются Na+, К+, 2СГкотранспорт, На+/Н+-обмен, СГ/НСОз- обмен; при увеличении объёма - активируются К+,СГкотранспорт, К+ и СГ каналы и СГ/НСОз-обмен (Орлов С.Н., Гурло Т.Г., 1991; Strange К. et al., 1996; Hernandez J.A., Ernesto С., 1998). В объёмную регуляцию вовлекаются системы внутриклеточной сигнализации, гормоны, биологически активные вещества (БАВ), метаболиты. Основной механизм ауторегуляции клеточного объёма - изменение метаболизма - энзиматически регулируемого процесса, ведущего к сдвигам концентрации внутриклеточных компонентов (Garner М.М., Burg М.В., 1994; Summers J.C. et al., 1997). В объёмной регуляции участвуют ферменты, контролирующие уровень циклических мононуклеотидов, диацилглицерола, инозитолфосфатов (Abdel-Latif A.A., 1986; Eveloff J.L., Warnock D.G., 1987), участвующих в фосфорилировании мембранных белков с характерным сдвигом функциональной активности клетки. В.А. Галенок и соавт. (1987), С.Н. Орлов, Т.Г. Гурло (1991) отмечают роль метаболитов ар- хидоновой кислоты (простагландины, простациклины, лейкотреины) как вторичных месенжеров в регуляции клеточного объёма.
Роль гормонов в регуляции клеточного объёма обусловлена их способностью модифицировать работу ионных переносчиков и изменять состояние мембранного каркаса и элементов цитоскелета (Конев C.B., 1987; Смирнова Е.А и соавт., 1987; Орлов С.Н., Новиков К.Н., 1996; Наточин Ю.В., 2000; Summers J.C et al., 1997). Макромолекулы цитоскелета обеспечивают высокую чувствительность клетки к изменению объёма (Venter H. et al., 1991; Chen J. et al., 1994; Burg M.B., 1995; Doctor B.R. et al., 1997), препятствуют свободному току воды в клетку (Смирнова Е.А. и соавт., 1987), изменяют упругоэластические характеристики мембраны, что небезразлично для контроля над транспортной активностью (Орлов С.Н., Гурло Т.Г., 1991).
Методы исследования морфологии эритроцитов
Согласно современной концепции, состояние биологической системы, возникшее под влиянием изменённой среды, оценивается либо с позиции адекватной стабилизации (при полном соответствии степени мобилизации и напряжения функций требованиям, предъявляемым конкретными условиями), либо динамического рассогласования, при которых ответ организма неадекватен нагрузке или в принципе невозможен ввиду новизны, специфичности действия и высокой интенсивности фактора, превышающего физиологические возможности организма. При этом в реакцию адаптации вовлекается вся иерархия реакций - от системного до субклеточного уровней, направленных на восстановление возникших гомеостатических нарушений.
На начальном этапе адаптации преобладают защитно-компенсаторные механизмы (Воложин А.И., Субботин, Ю.К., 1986), объединяющие рефлекторные процессы, направленные на устранение или ослабление функциональных сдвигов в организме на стрессорное воздействие, и затухающие по мере развития адаптации. По механизму развития - использование функциональных резервов, поддерживающих необходимый уровень гомеостаза в течение времени, достаточного для развития устойчивых форм адаптации. С.Г. Кривощеков и Г.М. Диверт (2001) такое состояние обозначают как «незавершенная адаптация».
Реакции компенсации эффективнее протекают у предварительно адаптированных к стрессу животных, для них типичны менее выраженные пока/
затели гипоксического повреждения тканей (Меерсон Ф.З., 1987, 1991; Пи- кендоева О.В., 1997; Защитный эффект предварительной адаптации..., 1999). Критерий достижения адаптированности систем — минимизация энергозатрат, рассматриваемая с позиции «цены адаптации» (Озернюк Н.Д., Нечаев С.К. 2002).
Эволюционные истоки формирования адаптации заложены в нервной, иммунной и эндокринной регуляторных системах, прообразы которых присутствуют у примитивных многоклеточных. Интеграция регуляторных систем при стрессорном ответе обеспечивает адаптацию, поддержание гомеоста- за и выживание особи (Онтогенетические и генетико-эволюционные аспекты ..., 1990).
Независимо от уровня организации животного и среды обитания стрес- сорная реакция характеризуется следующими чертами: уклонение от стресс- фактора, перестройка метаболизма, выделение медиаторов стресса. В основе реализации стрессорной реакции лежит феномен общеорганизменной хемокоммуникации - обмен информацией между клетками посредством биологически активных веществ, обладающих исключительной эволюционной консервативностью (Поленов А.Д., Кулаковский Э.Е., 1993). Так, у всех представителей филогенетического ряда, начиная с моллюсков, к числу важнейших эффекторных молекул стресса принадлежат соединения типа нейро- пептидов, катехоламиновых и индоловых аминов. У позвоночных ведущие нейросекреторные системы, координирующие реакцию на стрессорное воздействия, гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная и каудальная (Ак- маев И.Г., 1996; Филаретов A.A. и соавт., 1994; Эволюционные аспекты ..., 2002; Szentagothal J. et al., 1962).
Начальное звено и обязательный компонент устойчивой адаптации — стресс-реакция, имеющая стадийное развитие (Selye Н., 1976), направленная на мобилизацию эрго- и трофотропных резервов и формирование системного структурного следа адаптации (Меерсон Ф. 3., 1987; Гаркави Х.С. и соавт., 1990; Судаков К. В., 2000, 2002).
В основе стрессорного (экстремального) состояния лежит ослабление реактивности и снижение функциональных резервов нейро-иммунно- эндокринной системы, энергетический дисбаланс, лабилизация клеточных мембран, изменение антигенно-структурного гомеостаза. Отражением резистентности организма к стрессорному воздействию служит установление оптимального соотношения активности в отдельных звеньях регуляции и генетически детерминированная устойчивость вида, что рассматривается с позиции классических представлений об адаптации (Баевский P.M., 1976; Казначеев В. П., 1980; М. Г. Меерсон, 1991; Медведев В. И., 1979; Ястребов А.П. и соавт., 1988; Яковлев Г.М. и соавт., 1990; ОзернюкН.Д., 1992; Судаков К.В., 2000; Пшённикова М.Г., 2001, 2003).
В последнее десятилетие механизмы развития стресса обсуждаются с позиции его биологической значимости (Дмитриева Н.В., Глазачев О.С., 2005; Иванов К.П., Мельникова H.H., 2005; Сох Т., 1991; Hayes Ph., 2003; Arnetz В. et al., 1991; Malarkey W.B. et al., 2001; Theorell Т., 2003). В частности, представление о стрессе как о состоянии рассогласования баланса адаптивных сил организма, происходящее через комплекс координированных изменений биохимических, нейрональных, гуморальных и клеточных процессов. Широкий интегральный подход к пониманию механизма формирования стресса представлен Ph. Hayes (2003), логически объединивший результаты собственных исследований на макро- и микроуровнях. Подтверждена перспективность индивидуального подхода к изучению, оценке и прогнозированию устойчивости к стрессу, сформулировано представление о неспецифическом информационном синдроме дезинтеграции функциональных систем при экстремальных состояниях (Судаков К.В., 1998, 2000; Судаков К.В., Захаров Ю.М., 2002; Пшённикова М. Г., 2003).
К настоящему времени накоплен значительный фактический материал по структурным основам реакции адаптации, типам адаптивного реагирования и неоднозначности гомеостатического сдвига при остром и хроническом стрессе. Экспериментальные данные и клинические наблюдения послужили основанием для углубления и уточнения характеристик стадий общего адаптационного синдрома (Саркисов Д.С., 1987, 1994; Гаркави и соавт., 1990; Аболенская A.B., 1993). В частности, показано, что не всегда стресс-факторы инициируют образование одного спектра гормонов; тип стресса может стать определяющим фактором в вовлечении в адаптацию центральных структур и сигнальных молекул, например, при возросшей неспецифической сопротивляемости организма, обусловленной реакцией адаптации стресс-лимитиру- ющих систем к раздражению (Меерсон Ф.З., 1987; Пшённикова М.Г., 2003).
В свете современных представлений об адаптации с позиции не изменения структур функциональной системы, а изменения связей между ними (Федоров В.И., 2000), перспективен синергетический подход, существенно расширяющий представления о генезе адаптивных состояний в функциональных системах на эндо- и экзогенные воздействия (Коршунов Г.В. и соавт., 2005).
Информативный и удобный объект изучения индивидуальной феноти- пической резистентности к стрессу на молекулярно-клеточном уровне - эритроциты (Lee Е. et al., 2001). Установлена высокая чувствительность их мембран к гормонам стресса, что рассматривается как ранний маркер адаптации организма к экстремальным факторам (Шепотиновский В.И., 1984; Баро- ненко В.А., 1988). Индикатор метаболизма и ранний информативный критерий стрессового состояния — электрофоретическая подвижность эритроцита, измеряемая скоростью их перемещения в электромагнитном поле (Бароненко В.А., 1988; Матюшичев В.Б. и соавт., 1999; Матюшичев В.Б., Шамратова В.Г., 2004). Выбор эритроцитов в качестве модели при оценке стрессорных воздействий на биосистему целесообразен еще и потому, что структура их мембран отражает особенности биохимического строения мембранных структур соматических клеток организма (Черницкий Е.А, Воробей A.B., 1981), и изучение морфофизиологии, физико-химии и биохимии красных клеток крови при стрессе перспективно для прогноза патогенеза и разработки методов диагностики, средств и способов повышения неспецифической резистентности организма.
Функциональная морфология эритроцитов. Возрастной состав циркулирующего эритроцитарного пула
На основе анализа литературы по вопросам, касающимся темы диссертационной работы, установлено, что проведенные в последние два десятилетия исследования на системном и клеточно-молекулярном уровнях характеризуют клетки красной крови, эритропоэз, регуляцию процессов дифферен- цировки эритроидных клеток-предшественниц и регуляцию кроветворения в естественных условиях, а также при стрессорных воздействиях и развитии адаптации или патологического процесса. Внимание исследователей акцентируется на диагностической значимости морфофункциональных особенностей эритроцитов, подчеркивая тем самым не потерявших актуальности исследования морфологии клеток крови. Значительное количество работ посвящено изучению физико-химических свойств мембран эритроцитов, путям транспорта и участия ионов в регуляции клеточного объёма с экстрапаляци- ей полученных экспериментальных данных на другие клетки организма.
Глубокая проработка упомянутых вопросов у человека и млекопитающих животных стала основанием для переноса установленных особенностей, закономерностей и даже методических подходов и методик к исследованию системы эритрона у низших позвоночных и птиц, что неправомерно в силу физиологических особенностей и экологической специфики клеточных и системных регуляторных механизмов у этих групп животных.
Возросшие нагрузки на организм сельскохозяйственной птицы при ее выращивании и содержании в связи с переводом птицеводческой отрасли на индустриальную основу делают актуальными исследования генеза и механизмов протекания стресса и адаптации, причин снижения продуктивности и ухудшения качества продукции, знание которых необходимо для разработки методов оперативной и объективной диагностики. Раскрытие механизмов компенсаторных и адаптационных реакций организма в изменённых условиях жизнедеятельности требует знания динамики специфических функций и структурно-функциональных преобразований клеток. В качестве одного из путей детоксикации и эндоэкологической реабилитации организма широко обсуждаются вопросы создания сорбционных технологий и сорбентов, в том числе и целевых, получаемых на основе природных минералов, преимущественно местных, а следовательно, и более доступных и дешевых.
В последнее десятилетие внимание ученых привлечено к изучению индивидуальной и фенотипической резистентности к стрессу и экстремальным состояниям на молекулярно-клеточном уровне. В качестве физической модели для изучения физиологических свойств соматических клеток организма активно используются клетки крови. Особая роль отводится клеткам красной крови, выполняющих в организме комплекс важнейших функций.
Изучение научной литературы позволяет отметить, что в практическом птицеводстве и ветеринарии для оценки состояния птицы преимущественно используются биохимические методы исследования крови. К изучению морфологии и физиологии клеток обращаются значительно реже, отсюда недостаточная проработка методической стороны исследования и игнорирование физиологической роли эритроцитов в поддержании гомеостаза на уровне целого организма. Однако, присущие клеткам красной крови свойства соматических клеток дают основание отдать предпочтение прежде всего ядерному эритроциту как естественной и доступной модели (и маркёра) при изучении влияний изменённой среды на структурно-функциональные свойства биологической системы.
В тоже время исследования крови птиц носят преимущественно прикладной характер, а унифицированные методики не позволяют в полной мере изучать физиологию эритрона у этой группы животных. Отсутствуют комплексные работы, отражающие структурно-функциональные показатели эритроцитов, раскрывающие интегральные характеристики функционирования эритрона (по возрастной, функциональной и цитокинетической гетерогенности); регенераторные реакции в системе крови; кинетику эритропоэза и адаптационно-компенсаторные реакции в эритроне под влиянием стрессор- ных (десинхронизирующих) факторов. Актуальность такого рода исследований обусловлена необходимостью решения как теоретических (исследование общебиологичеких механизмов жизнедеятельности клетки, анализ и сопоставительная оценка протекания стресс-реакции, адаптации и компенсации в эритроне, сущности нарушения эритропоэза при стрессировании организма и состояния эритрона в условиях отклонения функционирования гомеоста- тических систем организма от оптимального для биосистемы уровня в условиях экспериментально изменённого гомеостаза), так и практических задач (разработка новых и модернизация унифицированных для млекопитающих способов изучения красной крови птиц; разработка тест-систем для индикации стрессорных состояний птицы, оценка морфофункциональных параметров эритроидной клетки и направленности ее динамики в генезе восстановительных и репаративных процессов после (или в процессе) экстремального воздействия). Диссертационное исследование, включающее анализ состояния научной проблемы, разработку концепции и методик, теоретические обобщения и систематизацию результатов, научное обоснование выводов, подготовку рекомендаций и оформление диссертации выполнено согласно планам НИР кафедры физиологии и биохимии животных Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева. Гематологические исследования проведены в лаборатории «Физиология клеток крови» Белгородского госуниверситета, биохимический анализ образцов тканей, корма и помёта — в лаборатории биологических исследований Бел ГСХА.
Проведено 4 серии опытов, в 3-х использовали кровь половозрелых петухов кросса ISA. Влияние природной полиминеральной добавки «Экое» на характеристики красной крови (4-я серия опытов) изучали на утятах кросса Медео, цыплятах-бройлерах и курах-несушках кросса ISA. Птицу в опытах не использовали повторно. Согласно существующему мнению, под влиянием приобретенного опыта в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе птиц сохраняется структурный след, проявляющийся в форме повышенной неспецифической резистентности к другим или повторным раздражителям (Аврутина А .Я., Кислюк С.М., 1976, 1978), что выражается в развитии компенсаторных реакций, направленных на снижение реактивности нервных центров и исполнительных органов к медиаторам и гормонам стресса (Меерсон Ф.З., Пшённикова М.Г., 1988; Меерсон Ф.З., 1991; Подвигина Т.Т., 1998; Краснов И.Б., 2007; Stone Е.А., 1982) на фоне менее выраженных показателей токсического повреждения тканей (Защитный эффект предварительной адаптации к стрессу ..., 1999).
Выбор для исследования самцов обусловлен их способностью поддерживать на относительно постоянном уровне характеристики крови, что объясняется стимулирующим действием на кроветворение стабильно высоких концентраций андрогенов и ингибирующим - эстрогенов (Рябов С.А., 1971).
Влияние на метаболизм (баланс и конверсия веществ корма)
Одна из возможных причин дестабилизации мембран, выраженной в повышении концентрации плазменного гемоглобина и росте проницаемости, - флуктуация уровня гликемии у птицы в ходе адаптивного периода. Так, согласно имеющимся данным, гипергликемия инициирует процессы ПОЛ, повышает осмотическую хрупкость, изменяет форму и размеры клеток (Ге- нес С.Г., 1977; Галенок В.А. и соавт., 1987; Бондарь Т.П., Козинец Г.И., 2002; Gaciong Ъ., 1995), не влияя при этом на жидкостность мембраны и активность встроенных в нее ферментов (8гоз1апс1 К. е1 а1., 1995).
В нашем исследовании концентрация глюкозы в крови (1,3-и сутки) снижена соответственно до 7,40±0,15 и 6,88±0,08 ммоль-л"1 (р 0,001) (см. табл.14). На седьмые сутки отмечен гипергликемический подъем до 9,88±0,28 ммоль-л"1 (р 0,01), СПГ и СПГ55/6о выше контроля (р 0,001), а сорбционная емкость снижена на 17,5 % (р 0,01). Концентрация глюкозы в крови находится в обратной зависимости с уровнем ВЭГ (г = - 0,88). Через 2 недели концентрация глюкозы в крови составила 11,27±0,47 ммоль-л"1 (р 0,001) и наметилась тенденция к снижению ВЭГ и СПГ; СЕЭ повысилась, но не достигла фонового уровня; изменение СЕЭ находилось в обратной корреляционной зависимости с уровнем ВЭГ (г = - 0,86). На 23-и и 29-е сутки концентрация глюкозы в крови близка к контрольному уровню, но СЕЭ достоверно ниже, а ВЭГ - выше контроля. Начавшееся снижение ПЭМ мы объясняем эффектом уплотнения мембран под влиянием малонового альдегида, который накапливается в эритроцитах при стрессорной активации процессов ПОЛ, что приводит к конформационным перестройкам в белково-липидном слое мембраны, повышению её жесткости и снижению проницаемости (Ми- каелян Н.П. и соавт., 1991; Бондарь Т.П., Г.И. Козинец , 2003).
Постстрессорное увеличение ПЭМ мы рассматриваем с позиции усиления свободнорадикального окисления (СРО) липидов мембран. Однако увеличение проницаемости не означает полного разрушения клеток. Модель критического размера пор (Антонов В.Ф., 1998) предполагает циклический характер дестабилизации мембраны: при пороговом уровне ее натяжения формируются гидрофильные поры для выхода гемоглобина и низкомолекулярных веществ; при размерах меньше критической пора залечивается. При неконтролируемом росте ПЭМ эритроцит разрушается.
Динамика реставрационных процессов в эритроцитарной популяции отражена на кислотных эритрограммах. В первую неделю после отмены стресс-фактора повышается функциональная активность эритрона, растет популяция старых клеток с пониженной резистентностью, отмеченный специфическим левым сдвигом эритрограмм распределения эритроцитов по стойкости (см. рис. 20а,б,в), свидетельствующим об усилении гемолиза. Поднятие правого крыла и удлинение времени гемолиза до 6 минут (15-е сутки) — явный признак омоложения популяции (см. рис. 20г). На 23-и сутки смещённая вправо эритрограмма становится многопиковой и растянутой до 8-9 минут, наконец, на 29-е сутки кислотоустойчивость эритроцитов повышается, профиль эритрограммы приближается к фону, знаменуя восстановление белкового компонента мембраны. Однако в эритроцитарной популяции велика доля клеток со скрытыми структурными нарушениями - 84,74 % красных клеток лизируются в критической точке резистентности (0,55 % ЫаС1) и до 21,0 % - в точке аутогемолиза (0,70 % №С1) (см. рис. 19).
Таким образом, состояние острого стресса (фотодесинхроноза) побуждает развитие неспецифического адаптационного синдрома клеток, проявляемого ростом проницаемости мембран и усилением мочевинного гемолиза. У птиц, в отличие от млекопитающих животных, при остром стрессе физиологический ответ эритроцита на эндогенную интоксикацию сдвинут в сторону снижения СЕЭ, что мы связываем с увеличением токсической нагрузки на клеточную мембрану и блокированием имеющихся на ней рецепторов, вследствие избыточного накопления эндотоксинов, а также гормонов стресса. Известно, что после отмены стрессора липидный бислой мембраны может вернуться к состоянию низкой проводимости - появлению в мембране кластеров малого размера (Браун А.Д., Моженок Т.П., 1987)
