Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Вазопрессин: краткая характеристика гормона 11
1.2. Вазопрессин и гипоталамо-гипофизарная система млекопитающих
1.2.1. Структура гипоталамо-гипофизарной системы млекопитающих 15
1.2.2. ВП-ергические нейроны гипоталамуса в условиях осмотической стимуляции 22
1.3. Катехоламины - нейромодуляторы функций организма 24
1.3.1. Катехоламины: общие сведения о локализации, синтезе и функциональном значении 24
1.3.2. Участие норадреналина в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов гипоталамуса 29
1.3.2.1. Влияние норадреналина на секрецию ВП гипоталамическими нейронами 29
1.3.2.2. Норадреналин как посредник в регуляции функций ВП-ергических нейронов 33
1.4. N0 и вазопрессинергическая система гипоталамуса 35
1.4.1. N0: синтез, роль в системе NO/цГМФ/цГМФ-зависимая протеинкиназа 35
1.4.2. Участие N0 в регуляции функций вазопрессинергических нейронов
1.5. Связь N0 с катехоламинами в гипоталамо-гипофизарной системе 43
1.6. N0 и катехоламины в апоптозе нейронов 45
1.6.1. Апоптоз: общие сведения о сигнальных белках апоптоза и о путях его инициации 45
1.6.1.1. Каспазы и апоптоз 46
1.6.1.2. Пути инициации апоптоза 47
1.6.1.3. Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза 52
1.6.2. Роль N0 в апоптозе 54
1.6.3. Участие КА в процессе апоптоза 57
Глава 2. Материалы и методы 61
2.1. Экспериментальные модели 61
2.1.1. Модели in vitro 61
2.1.2. Модели in vivo 63
2.2. Гистологическая обработка материала 65
2.2.1. Иммуногистохимический метод 66
2.2.2. Метод гибридизации in situ
2.3. Морфофункциональный анализ материала 70
2.4. Статистический анализ результатов з
Глава 3. Результаты исследования 72
3.1. Функциональное состояние ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ при инкубации переживающих срезов гипоталамуса в среде, содержащей ДА или НА 72
3.2. Синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ под действием НА и агонистов АР в опытах in vitro 75
3.3. Синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ дегидратированных крыс в условиях блокады синтеза катехоламинов 78
3.4. Экспрессия HNOS нейронами СОЯ и ПВЯ у дегидратированных крыс в условиях блокады синтеза катехоламинов 85
3.5. Синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ у мышей дикого типа и мышей-нокаутов по гену HNOS в условиях блокады синтеза катехоламинов 89
3.6. Экспрессия сигнальных белков апоптоза нонапептидергическими нейронами СОЯ и ПВЯ у мышей дикого типа и мышей-нокаутов по гену HNOS В условиях дегидратации и блокады синтеза катехоламинов 96
3.7. Экспрессия каспазы-9 и Вс1-2 нейронами СОЯ и ПВЯ под влиянием НА и агонистов АР в опытах in vitro 102
Глава 4. Обсуждение результатов 105
4.1. Влияние НА и ДА на функцию ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса крыс в опытах in vitro 105
4.2. Влияние НА и агонистов АР на синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ 107
4.3. Участие КА в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ у дегидратированных крыс 111
4.4. Влияние блокады синтеза катехоламинов на экспрессию HNOS нонапептидергическими нейронами СОЯ и ПВЯ дегидратированных крыс 118
4.5. Влияние низкого уровня катехоламинов на синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ у мышей дикого типа и мышей-нокаутов noreHyHNOS 122
4.6. Влияние дегидратации и блокады синтеза катехоламинов на экспрессию сигнальных белков апоптоза нонапептидергическими нейронами СОЯ и ПВЯ у мышей дикого типа и мышей-нокаутов по гену HNOS 132
4.7. Влияние НА и агонистов АР на экспрессию каспазы-9 и Вс1-2
нейронами СОЯ и ПВЯ в опытах in vitro 139
Заключение 143
Выводы 146
Список литературы 1
- Катехоламины - нейромодуляторы функций организма
- Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза
- Синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ под действием НА и агонистов АР в опытах in vitro
- Участие КА в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ у дегидратированных крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Функции многих регуляторных систем организма направлены на поддержание гомеостаза, что обеспечивает создание условий, оптимальных для реализации существующих регуляторных программ. Ведущая роль в регуляции водно-солевого обмена принадлежит вазопрессинергической системе гипоталамуса [Scharrer, Scharrer, 1963; Поленов, 1968, 1983]. Вазопрессин (ВП) относится к числу нейрогормонов с разнообразными функциями. Память и регуляция клеточного роста, сокращение гладких мышц и гликогенолиз, сон и стрессорные реакции организма — вот неполный перечень его внепочечных функций [Поленов, 1970, 1986; Филаретова, 1985; Чернышева, 1995; Landgraf, 2001]. Многообразны и почечные эффекты ВП: увеличение фильтрации, стимуляция транспорта хлорида натрия в толстой восходящей петле Генле, наконец, повышение проницаемости собирательных трубок для воды и мочевины [Scharrer, Scharrer, 1963; Поленов, 1968, 1983; Теппермен, Теппермен, 1989; Багров, Манусова, 1994]. Нетрудно увидеть, что эти, кажущиеся разрозненными, эффекты ВП объединены одной общей целью - создать оптимальные условия для реабсорбции «осмотически свободной» воды. Именно возможность раздельного регулирования реабсорбции электролитов и воды лежит в основе поддержания постоянства осмотической концентрации крови, что является основной стратегией осморегуляции.
В виду всего выше сказанного, ВП является ключевым звеном механизма осморегуляции. В связи с этим большой интерес представляет изучение процессов регуляции синтеза и выведения ВП. ВП у млекопитающих синтезируется в основном в нейронах паравентрикулярных (ПВЯ) и супраоптических (СОЯ) ядер гипоталамуса, откуда он впоследствии
транспортируется по аксонам и выделяется, главным образом, в задней доле гипофиза, откуда он поступает в общий кровоток, а также в капиллярных сплетениях наружной зоны срединного возвышения. Известно, что на биосинтез и выведение ВП в основном оказывает влияние осмотическое давление плазмы крови (осмотическая регуляция) и кровяное давление или объем крови (неосмотическая регуляция) [Sladek, Knigge, 1977; Share, 1996]. Причиной изменения выше перечисленных параметров могут быть осмотические нагрузки (обогащенная глюкозой, липидами или белками пища, солевая диета), а также функциональные состояния организма, связанные с повышением осмотического давления плазмы крови или других жидкостных сред (лактация, кровопотери, диурез, потоотделение).
Показано, что в процессе передачи сигналов на ВП-ергические нейроны гипоталамуса принимают участие такие неиротрансмиттеры, как катехоламины (КА), ацетилхолин, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), гистамин [Hornby, Piekut, 1987; Чернышева, 1995; Bealer, Abell, 1995]. Однако механизмы, с помощью которых данные неиротрансмиттеры передают клеточный сигнал, а часто даже сам характер влияния на ВП-ергические нейроны остаются еще во многом невыясненными.
Возможность участия КА в регуляции функционального состояния гипоталамических ВП-ергических нейронов подтверждается данными о наличии синаптических контактов между КА- и нонапептидергическими нейронами в пределах гипоталамуса [Shioda, Nakai, 1992, 1996; Michaloudi et al., 1997]. Важно также отметить, что на нейронах СОЯ и ПВЯ обнаружены все типы адренорецепторов (АР) [Hornby, Piekut, 1987; Takano et al., 1989; Khanna et al., 1993]. При этом, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о возможности как активирующего, так и на ингибиторного действия КА на синтез и выведение ВП, что указывает на необходимость дальнейших исследований в данной области [Yamashita Н. et al., 1988;
Harland D et al., 1989; Ji Y. et al., 1998; Cole R.L., Sawchenko P.E., 2002]. Кроме KA, важную роль в регуляции функций ВП-ергических нейронов гипоталамуса выполняет продукт нейрональной NO-синтазы (hNOS) - оксид азота (N0). В этом случае литературные данные также достаточно противоречивы и указывают как на активирующее [Kadowaki К. et al., 1994; Kadekaro М. et al., 1997, 1998], так и на ингибиторное [Ota М. et al., 1993] действие NO на синтез и выведение ВП гипоталамическими нейронами. Нельзя также исключать возможность взаимодействия КА и NO в процессе реализации внутриклеточных механизмов регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов. Но конкретных литературных данных по этому вопросу нам обнаружить не удалось. Как КА, так и NO кроме выполнения нейромодуляторной функции могут участвовать в инициации программированной клеточной гибели, при этом, действие этих веществ на апоптоз не является однозначным и во многом зависит от типа клеток и условий опыта [Alagarsamy S. et al., 1997; Mayer В., Hemmens В., 1997; Brune В. et al., 1998; Noh J.S. et al, 1999]. Однако, практически ничего не известно об участии КА и N0 в регуляции апоптоза нонапептидергических нейронов.
Цель и задачи исследования.
Целью работы было изучение участия КА и NO в регуляции синтеза и выведения ВП, а также в регуляции экспрессии сигнальных белков апоптоза ВП-ергическими нейронами СОЯ и ПВЯ гипоталамуса. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить влияние КА и активации различных типов адренорецепторов на синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ в опытах in vitro и in vivo.
Показать влияние изменения уровня КА, а также вклад различных типов адренорецепторов в регуляцию экспрессии сигнальных белков апоптоза клетками СОЯ и ПВЯ.
Оценить возможность взаимодействия КА и N0 в процессе регуляции функционального состояния ВП-ергичеких нейронов СОЯ и ПВЯ, а также в регуляции экспрессии этими нейронами сигнальных белков апоптоза в опытах in vivo на мышах дикого типа и мышах нокаутах по гену hNOS.
Научная новизна результатов исследования.
В работе впервые продемонстрировано, что КА могут оказывать противоположное действие на выведение ВП из перикарионов нейронов СОЯ и ПВЯ и из нервных окончаний задней доли гипофиза: ингибирующее действие в первом случае и активирующее - во втором.
Впервые показано, что N0 опосредует влияние снижения уровня КА на интенсивность синтеза ВП. При этом, тормозное действие КА и NO на выведение ВП из перикарионов носит аддитивый характер.
Активация разных типов адренорецепторов может оказывать различное (как активирующее, так и тормозное) действие на активность синтеза и выведения ВП гипоталамическими нейронами СОЯ и ПВЯ.
В работе впервые удалось показать участие NO в экспрессии сигнальных белков апоптоза нонапептидергическими нейронами СОЯ и ПВЯ в условиях осмотического воздействия.
Полученные данные впервые позволили предположить наличие в нонапептидергических нейронах СОЯ и ПВЯ рецепторных путей инициации апоптоза, действующих через адренорецепторы.
Основные положения, выносимые на защиту.
КА тормозят синтез ВП и его выведение из перикарионов ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, при этом влияние КА на синтез ВП опосредуется тормозным действием N0. В задней доле гипофиза отмечается противоположное действие КА и NO на выведение ВП из нервных окончаний в общий кровоток: активирующее действие КА и тормозное действие NO.
Активация разных типов адренорецепторов может оказывать различное действие на активность синтеза и выведения ВП, а также усиливать экспрессию сигнальных белков апоптоза нонапептидергическими нейронами СОЯ и ПВЯ.
NO необходим для активации экспрессии про- и антиапоптозных сигнальных белков апоптоза ВП-ергическими нейронами СОЯ и ПВЯ в условиях осмотической активации ВП-ергической системы гипоталамуса, вызванной дегидратации.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Совокупность результатов работы позволила сформулировать научную гипотезу об ингибиторном действии КА и N0 на выведение ВП из перикарионов нейронов СОЯ и ПВЯ. Тормозное действие КА на выведение ВП может иметь особо важное значение при осмотической стимуляции, когда для предотвращения истощения ВП-ергической системы гипоталамуса необходимо влияние сдерживающего фактора.
Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции водно-солевого обмена у млекопитающих, что имеет большое значение для разработки методических подходов лечения различного рода нарушений, приводящих к серьезным заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Изучение экспрессии сигнальных белков апоптоза при различных
функциональных нагрузках может быть полезно для понимания механизмов регуляции апоптоза при различных повреждающих воздействиях.
Работа выполнена по плану научных исследований лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН в рамках проекта РФФИ (01-04-48825).
Апробация работы и публикация результатов исследования.
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на V Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-2000" (С.-Петербург, 2000), на II Российской конференции молодых ученых с международным участием (Москва, 2001), на XVIII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001), на Второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" (Новосибирск, 2002), на международном симпозиуме "Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals" (Москва, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием "Нейроэндокринология-2003" (С.-Петербург, 2003). По материалам диссертации опубликовано 8 тезисов докладов на Российских и международных конференциях и 4 научные статьи в рецензируемых российских журналах.
Катехоламины - нейромодуляторы функций организма
В настоящее время показано участие различных гормонов и биологически активных веществ в регуляции функций ВП-ергических нейронов. Например, к таким веществам относятся пролактин [Mejia et al., 2003], серотонин [Jorgensen et al., 2003], тиреолиберин [Ciosek, Guzek, 1992], ангиотензин-2 [Perez-Delgado et al., 2000] и эстрогены [Nomura et al., 2002]. Кроме того, в процессе передачи сигналов на ВП-ергические нейроны гипоталамуса принимает участие ряд нейротрансмиттеров (ацетилхолин, глутамат, ГАМК и др.) [Hornby, Piekut, 1987; Чернышева, 1995; Bealer, Abell, 1995; Li, Pan, 2001], но, безусловно, главную роль в этом процессе играют КА.
Основным местом синтеза КА является хромаффинная ткань надпочечников, где образуются все представители данной группы веществ, а именно - норадреналин (НА), дофамин (ДА) и адреналин. Следует отметить, что хромаффинные клетки у большинства видов животных секретируют в основном адреналин, который выполняет свои функции, действуя как гормон. Имеющиеся же в организме НА и ДА - это в основном нейромедиаторы центральной и автономной нервной системы, о чем свидетельствует широкое их распространение в пределах всего организма и участие в регуляции подавляющего большинства физиологических функций.
Схема биосинтеза КА впервые была предложена Блашко в 1939 г. и до сих пор не изменялась, а лишь уточнялась в отдельных ее звеньях [Смиттен, Шаляпина, 1993] (рис.4). Согласно этой схеме первым этапом синтеза КА является превращение тирозина в 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА) под влиянием фермента тирозингидроксилазы. Затем ДОФА-декарбоксилаза приводит к декарбоксилированию ДОФА с образованием ДА. Следует отметить, что обе эти реакции происходят в цитоплазме. После этого ДА проникает в хромаффинные гранулы, где окисляется в НА ДА-Р-гидроксилазой. Затем образовавшийся НА возвращается в цитозоль и подвергается метилированию под действием фенилэтаноламин-N-метилтрансферазы, превращаясь в адреналин. Далее адреналин вновь поступает в хромаффинные гранулы и запасается для секреции. Показано, что фенилэтаноламин-Ы-метилтрансфераза в основном присутствует в мозговом слое надпочечников, хотя очень небольшие ее количества могут быть связаны и с нервными окончаниями. Это подтверждает тот факт, что адреналин синтезируется главным образом в надпочечниках. Ферментом, лимитирующим скорость синтеза КА, является тирозингидроксилаза. Интересным представляется также тот факт, что НА способен ингибировать процесс синтеза КА по механизму обратной связи.
В головном мозге млекопитающих представлены все КА. КА-ергические проекции стволовой части мозга изучены достаточно хорошо. Сразу следует уточнить, что не все КА одинаково вовлечены в регуляцию функций ВП-ергических нейронов. Так, немногочисленные литературные данные свидетельствуют об участии в этой регуляции ДА. Показано, что ДА может стимулировать секрецию ВП нейрогипофизом [Galfi et al., 2001] и подавлять ее при геморрагии [Yamaguchi et al., 1990]. Однако, более важная роль в процессе передачи сигнала на ВП-ергические нейроны отводится НА. Показано, что он оказывает более выраженное действие на ВП-нейроны СОЯ и ПВЯ и причем в значительно меньших концентрациях, чем ДА [Leibowitz et al., 1990]. В связи с этим более подробно следует рассмотреть именно НА.
Что касается интересующих нас СОЯ и ПВЯ, то эти ядра имеют одно из наиболее развитых КА-ергических терминальных полей в мозге. Показано, что источником почти всех НА-ергических волокон, проецирующихся в эти ядра, являются три группы клеток ствола мозга. Это А1 группа НА-ергических нейронов вентральной части продолговатого мозга; А2 - группа клеток, центр которой расположен в медиальной части ядра солитарного тракта, и голубое пятно (А6 группа НА-ергических клеток). Согласно результатам одних экспериментальных исследований, клетки НА-ергических групп А2 и А6 проецируются исключительно к мелкоклеточной популяции ПВЯ [Swanson, Sawchenko, 1983]. По другим немногочисленным данным, существуют прямые связи между нейронами каудального ядра солитарного тракта и нейросекреторными клетками СОЯ [Raby, Renaud, 1989]. Аксоны нейронов группы А1 были обнаружены как в мелкоклеточной, так и в крупноклеточной популяции ПВЯ, а также в СОЯ, преимущественно в тех частях обоих ядер, где расположены крупные ВП-ергические клетки [Swanson, Sawchenko, 1983; Shioda, Nakai, 1996].
На мембране клеток-мишеней НА может связываться с а- и Р-АР, различающимися по аффинности. Различают несколько подтипов а- и Р-АР. Каждый из АР имеет свой путь передачи сигнала в клетке посредством активации вторичных посредников. Так, Р-АР сопряжены с Gs-белками, которые вызывают активацию аденилатциклазы, тогда как ссг-АР - с Gi 28 белками, активация которых подавляет аденилатциклазную систему вторичных посредников. Другой подтип, cti-AP, при связывании с лигандом обусловливает увеличение входа Са2+ в клетку и выход иона из внутриклеточных депо вслед за активацией фосфолипазы С [Смиттен, Шаляпина, 1993]. Таким образом, через разные типы АР НА может оказывать как тормозное, так и активирующее воздействие. Например, показано, что в миокарде через (ЗрАР НА вызывает сокращение, тогда как в гладких мышцах стенки трахеи, бронхов и сосудов через 02-АР он вызывает более слабый констрикторный ответ, а через а2-АР - расслабление. Что касается других влияний НА на мышечную систему, то через Р-АР он оказывает влияние на ферментативные системы, вызывая активацию фосфорилазы с последующим усилением гликогенолиза (в печени НА также способствует гликогенолизу), а также подавляет активность гликогенсинтетазы и стимулирует липазу, что приводит к увеличению концентрации субстратов окисления (глюкозы и жирных кислот) и способствует интенсификации энергетического обмена [Чернышева, 1995]. Таким образом, реализуются основные метаболические эффекты НА - мобилизация энергетических ресурсов, что имеет большое физиологическое значение при стрессорных воздействиях. Воздействуя на а-АР, НА вызывает расширение коронарных сосудов и периферическую вазоконстрикцию в отдельных участках сосудистой системы, особенно в коже, слизистых оболочках и почках. Сужение сосудов внутренних органов и расширение сосудов скелетной мускулатуры обусловливают перераспределение кровотока, что является подготовительным этапом усиленной мышечной деятельности в случае возникновения стрессорной ситуации [Смиттен, Шаляпина, 1993].
Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза
Семейство Вс1-2 включает в себя белки, обладающие как про-, так и антиапоптозными свойствами. Белки этого семейства являются важными регуляторами выведения цитохрома С из митохондрии. Так, повышенная экспрессия Вс1-2 и Bcl-XL блокирует выведение цитохрома С в ответ на различные апоптотические стимулы [Kluck et al., 1997; Scaffidi et al., 1998; Banasiak et al., 1999; Mostafapour et al., 2002]. В противоположность этому проапоптозные члены семейства Вс1-2, такие как Вах [Rosse et al., 1998; Love, 2003] и Bid [Luo et al., 1998; Li et al., 1998; Gross et al., 1999] стимулируют выведение цитохрома С из митохондрии. Количественное соотношение про-и антиапоптозных белков этого семейства во многом определяет клеточную выживаемость и устойчивость по отношению к неблагоприятным стимулам. Об этом свидетельствуют и данные о взаимодействиях между белками этого семейства в условиях инициации процесса апоптоза. При апоптотическом воздействии происходит диссоциация Bad (проапоптозный член семейства Вс1-2) от белка-шаперона. Кроме того высвобождается Вах, который в норме находится в комплексе с антиапоптозным Bcl-XL. Затем Bad димеризуется с ВСІ-XL, а свободный Вах транслоцируется в мембрану митохондрии и индуцирует выведение цитохрома С и активацию каспаз [Henshall et al., 2002]. Показано, что большое значение для дальнейшей судьбы клетки имеет именно соотношение Вах: Bcl-XL[Luo et al., 2002].
Белок Bcl-2 (от англ. B-cell lymphoma/leukemia 2), по которому названо семейство, впервые выделен из В-клеток лимфомы человека. Этот белок представляет собой прото-онкоген, который локализуется во внутренней мембране митохондрий, мембранах эндоплазматического ретикулума и ядра [Jacobson et al., 1993]. Как уже отмечалось выше, Вс1-2 является антиапоптозным белком и способствует выживанию клеток, блокируя программированную клеточную гибель [Vaux et al., 1988; McDonnell et al., 1989; Hockenbery et al., 1990; Farlie et al., 1995; Clark et al., 1997]. Один из основных предполагаемых механизмов антиапоптозного действия Вс1-2 заключается в регуляции проницаемости пор в наружной митохондриальной мембране. В этом случае Вс1-2 препятствует высвобождение цитохрома С и таким образом предотвращает инициацию апоптоза по каспаза-9-зависимому пути [Kroemer et al., 1997].
Имеются интересные литературные данные о том, что в клетках с повышенной экспрессией Вс1-2 не наблюдается активации каспаз, и клетки выживают, несмотря на повышенное содержание в их цитоплазме цитохрома С. [Rosse et al., 1998]. Эти данные позволяют предположить, что Вс1-2 способен предотвращать апоптоз уже после выхода цитохрома С из митохондрии в цитоплазму, то есть на более поздних этапах активации каскада каспаз.
Еще один путь подавления апоптоза белком Вс1-2 связан с его способностью влиять на накопление Са . Изменение кальциевого гомеостаза в результате каких-либо токсических воздействий может приводить к апоптозу или некрозу многих типов клеток. Находящийся в мембране митохондрий Вс1-2 максимально увеличивает способность митохондрий аккумулировать Са , предотвращая таким образом дисфункцию [Lopez-Collazo et al., 1997], хондроцитов [Blanco et al., 1995], гладкомышечных клеток [Nishio et al., 1996], опухолевых клеток [Lorsbach et al., 1993] и многих других. О цитотоксическом влиянии NO на нейроны свидетельствуют многочисленные эксперименты, проведенные на мышах нокаутах по гену HNOS. В этом случае у нокаутных животных наблюдается подавление апоптоза, что при ишемии, например, выражается в уменьшении площади инфаркта [Shimizu-Sasamata et al., 1998; Huang, 1999; bCriegsfeld et al., 1999; Eliboletal., 2001].
Дальнейшие исследования позволили предположить механизм действия NO в инициации апоптоза. Применение веществ-доноров NO показало, что увеличение содержания в клетке N0 приводит к накоплению в ядре р53, что может быть связано с повреждением молекулы ДНК, вызванным NO [Brune В. et al., 1998]. Предполагается, что NO может напрямую воздействовать на мембрану митохондрий, вызывая повышение проницаемости мембраны и образования в ней гигантских пор [Hortelano et al., 1997]. Через образовавшиеся поры из матрикса митохондрий в цитоплазму выходят апоптогенные факторы, которые опосредуют дальнейшее развитие программы гибели клетки (активацию каскада каспаз, ядерные изменения) [Uehara et al., 1999; Moriya et al., 2000]. Считается, что цитотоксическое воздействие может оказывать не сам NO, а его производные, такие как пероксинитрит (ONOO"). Именно пероксинитрит способен вызывать цитотксическое повреждение ДНК и мембраны митохондрий, запуская апоптоз по р53- и касапаза-9-зависимым путям [Leist, Nicotera, 1998]. В литературе присутствуют данные о том, что NO-индуцируемая клеточная гибель опосредуется снижением уровня Вс1-2, транслокацией проапоптозного белка Вах и активацией эффекторной касапазы-3 [Tamatani М. et al., 1998 (a,b); Zubrow et al., 2002]. Существует возможность опосредованного проапоптозного действия N0 в нейронах. В этом случае N0 оказывает пресинаптическое действие, вызывая активное высвобождение глутамата в синаптическую щель. Глутамат активирует на постсинаптической мембране NMDA (N-methyl-D-aspartate) рецепторы, представляющие собой Са2+- каналы, что может приводить к нарушению внутриклеточного Са2+- баланса [Leist, Nicotera, 1998]. Изменение Са2+- гомеостаза, как известно, может приводить к запуску программированной клеточной гибели [Wei et al., 1998].
Синтез и выведение ВП нейронами СОЯ и ПВЯ под действием НА и агонистов АР в опытах in vitro
Участие НА в регуляции функций ВП-ергических нейронов гипоталамуса опосредуется активацией различных типов АР. В этой связи мы попытались определить роль АР в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ в опытах in vitro на переживающих срезах гипоталамуса.
Как и в первой серии опытов, для оценки функционального состояния ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ было проведено выявление и измерение оптической плотности метки иРНК ВП и ВП-иммунореактивного вещества. Измерение оптической плотности метки иРНК ВП в нейронах СОЯ и ПВЯ показало, что НА (10 нМ) не оказывает влияния на уровень иРНК ВП в нейронах обоих ядер (табл. 3, 4; рис. 8). Оба ядра одинаково реагировали и на применение агонистов различных типов АР. Как в СОЯ, так и в ПВЯ показано достоверное уменьшение по сравнению с контролем количества и-РНК ВП при действии агониста ссрАР циразолина (10 мкМ), увеличение уровня иРНК ВП при воздействии агониста Р-АР циматерола (10 мкМ) и отсутствие изменений в содержании иРНК ВП при применении агониста а?-АР UK14304 (10 мкМ) (табл. 3, 4; рис. 8).
В проведенном исследовании НА вызывал увеличение содержания ВП-иммунореактивного вещества по сравнению с контролем только в пределах ПВЯ (табл. 4; рис. 86), тогда как в СОЯ после действия НА содержание ВП-иммунореактивного вещества не отличалось от контроля (табл. 3; рис. 8а). Как и в случае иРНК ВП, нейроны и СОЯ и ПВЯ одинаково отвечали на применение агонистов АР. При этом, агонист ссі-АР циразолин не вызывал изменений в содержании ВП-иммунопозитивного вещества, а применение агониста а2-АР UK 143 04 и агониста Р-АР циматерола увеличивало содержание ВП-иммунопозитивного вещества в обоих ядрах Безусловно, опыты in vitro облегчают изучение прямого влияния тех или иных веществ на клетки-мишени. Но в организме важную роль играет процесс взаимодействия регуляторных систем, что обеспечивает высокую пластичность и приспособляемость организма к меняющимся условиям окружающей среды. В связи с этим особое значение имеет проведение опытов in vivo, в условиях целостного организма.
Выявление и измерение оптической плотности метки иРНК ВП и ВП-иммунореактивного вещества в нейронах СОЯ и ПВЯ позволило оценить функциональное состояния ВП-ергических нейронов этих ядер при различных экспериментальных воздействиях.
Супраоптическое ядро
Внутрибрюшинное введение физиологического раствора не вызвало изменений в содержании иРНК ВП в нейронах СОЯ: оптическая плотность иРНК в данном случае не отличалась от контрольной (табл. 5; рис. 10а). Дегидратация вызвала повышение уровня и-РНК ВП в СОЯ, что свидетельствует об активации синтеза ВП (табл. 5; рис. 9, 10а). Уровень же иРНК ВП, измеренный у животных, которым на фоне дегидратации вводился блокатор синтеза КА a-mpt, также был выше контрольного и примерно соответствовал уровню иРНК ВП дегидратированных животных (табл. 5; рис. 9, 10а).
Что касается количества ВП-иммунопозитивного вещества в нейронах СОЯ, то ни внутрибрюшинное введение физиологического раствора, ни дегидратация не привели к его изменению, так как в обоих случаях оптическая плотность не отличалась от контрольной (табл. 5; рис. 9, 10а). Применение блокатора синтеза КА a-mpt у дегидратированных крыс вызвало достоверное снижение количества ВП-иммунопозитивного вещества в нейронах СОЯ, его количество составило 75% от контрольного уровня и 70% от уровня, характерного для дегидратированных крыс (табл. 5; рис. 9, 10а).
Паравентрикулярное ядро
Внутрибрюшинное введение физиологического раствора привело к достоверному повышению уровня и-РНК ВП в нейронах ПВЯ по сравнению с контролем, а следовательно, и к активации синтеза ВП (табл. 6; рис. 106). Достоверное повышение уровня и-РНК ВП в ПВЯ наблюдалось у дегидратированных животных, а также и у животных, которым на фоне дегидратации вводился блокатор синтеза КА a-mpt (во всех группах наблюдалось достоверное отличие только от контроля) (табл. 6; рис. 106).
Количество ВП-иммунопозитивного вещества не отличалось от контроля при введении физиологического раствора (табл. 6; рис. 106). Достоверно более низким количество ВП-иммунопозитивного вещества в нейронах ПВЯ оказалось у дегидратированных животных (85% от контрольного уровня) и у животных с введением a-mpt (76% от контрольного уровня). Однако, между собой эти две группы (дегидратация и введение a-mpt) достоверно не отличались (табл. 6; рис. 106).
Задняя доля гипофиза
В контрольной группе с помощью иммуногистохимического метода в задней доле гипофиза выявлено большое количество волокон и расширений, содержащих ВП-иммунореактивное вещество (рис. 11). Введение физиологического раствора не изменило оптическую плотность ВП-иммунореактивного вещества в задней доле гипофиза (табл. 7; рис. 12). Дегидратация вызвала достоверное снижение количества ВП-иммунореактивного вещества по сравнению с контролем (табл. 7; рис. 11, 12). При этом снижение содержания ВП наблюдалось в мелких волокнах нейрогипофиза. При применении блокатора синтеза КА a-mpt на фоне дегидратации наблюдалось повышение уровня ВП-иммунореактивного вещества по сравнению с просто дегидратированными животными и он достигал уровня, отмеченного в контрольной группе животных (табл. 7; рис. 11, 12).
Участие КА в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ у дегидратированных крыс
Конечной целью в изучении любого физиологического вопроса, касающегося регуляции какой-либо функции, является выяснение механизмов этой регуляции в условиях целостного организма, то есть в опытах in vivo. Мы предположили, что наиболее целесообразным будет изучение роли КА в регуляции функционального состояния ВП-ергических нейронов СОЯ и ПВЯ в условиях активации ВП-ергической системы гипоталамуса. Основанием для такого подхода послужили литературные данные, согласно которым введение гипертонического раствора способно активировать метаболизм КА в ПВЯ [Klemfuss, Seiden, 1986], водная депривация крыс приводит к увеличению уровня КА, в частности НА, в гипоталамической области [Tasaka et al., 1992], а длительная солевая нагрузка вызывает активную экспрессию тирозингидроксилазы, ключевого фермента синтеза КА, во всех ВП-ергических нейронах СОЯ [Abramova et al., 2002]. Приведенные данные без сомнения указывают на участие КА в регуляции функций ВП-ергической системы гипоталамуса при осмотическом воздействии. В проведенных нами опытах для того, чтобы активировать ВП-ергические нейроны гипоталамуса, животные подвергались дегидратации (водная депривация и солевая нагрузка в течение 5 дней).
Следует отметить, что литературные данные об активирующем действии КА на ВП-ергические нейроны гипоталамуса в условиях осмотической стимуляции касаются только КА-ергической регуляции выведения ВП в общий кровоток [Kiss et al., 1994; Smith et al., 1995; Buller et al., 1999]. Вопрос о КА-ергической регуляции выведения ВП из перикарионов в аксоны в данном случае остается открытым. Что касается регуляции синтеза ВП в опытах in vivo, то в литературе доминирует точка зрения о стимулирующем влиянии КА на уровень синтеза ВП, но в этом случае речь идет о регуляции неактивированных ВП-ергических нейронов. В частности, при использовании метода микроинъекций НА в область ПВЯ отмечено увеличение содержания иРНК ВП [Л et al., 1998; Cole, Sawchenko, 2002], а у мышей-нокаутов по гену моноаминоксидазы, у которых отмечается повышенный уровень КА, показано повышение уровня иРНК ВП в нейронах СОЯ и ПВЯ. Таким образом, многие аспекты КА-ергической регуляции функций ВП-ергических нейронов гипоталамуса в условиях целостного организма остаются не выясненными.
Супраоптическое ядро
Сопоставляя полученные нами данные об уровне иРНК ВП и количестве ВП-иммунопозитивного вещества в нейронах СОЯ можно сделать вывод о том, что введение физиологического раствора не вызвало изменений в интенсивности синтеза ВП и его выведения (табл. 5; рис. 10а). Дегидратация привела к активации синтеза ВП. При этом количество ВП-иммунопозитивного вещества не отличалось от контроля, что свидетельствует и о более интенсивном выведении ВП нейронами СОЯ в условиях дегидратации (табл. 5; рис. 9, 10а). Таким образом, как и предполагалось, дегидратация активировала ВП-ергические нейроны СОЯ, о чем свидетельствовала активация его синтеза и выведения из перикарионов.
Что касается блокатора синтеза КА a-mpt, то его введение на фоне дегидратации вызвало еще большую активацию выведения ВП нейронами СОЯ, так как в данном случае произошло достоверное снижение содержания ВП-иммунопозитивного вещества по сравнению с контролем. При этом интенсивность синтеза ВП примерно соответствовала уровню, характерному для просто дегидратированных животных (табл. 5; рис. 9, 10а). Исходя из этого, можно предположить, что в данном случае КА не оказывали влияния на интенсивность синтеза ВП. Однако, в то же время недостаток КА привел к активации выведения ВП нейронами СОЯ. Из этого можно сделать вывод, что при осмотической стимуляции КА могут подавлять выведение ВП из перикарионов нейронов СОЯ. Интересно отметить, что эти данные полностью согласуются с полученными нами ранее данными в опытах in vitro об ингибиторном действии НА на выведение ВП ВП-ергическими нейронами гипоталамуса (см. п. 4.1., 4.2.) и дают еще одно основание для предположения о том, что КА могут предотвращать истощение ВП-ергической системы при осмотической нагрузке.
Паравентрикулярное ядро
Следует отметить, что реакция ПВЯ на использованные экспериментальные условия отличалась от реакции, характерной для СОЯ. Это можно объяснить, во-первых, меньшей базальной активностью ВП-ергической системы ПВЯ, а также большей полифункциональностью ПВЯ по сравнению с СОЯ [Угрюмов, 1989; Чернышева, 1993]. Так как ВП-ергические нейроны ПВЯ связаны не только с задней долей гипофиза, но и с наружной зоной срединного возвышения и, помимо регуляции водно-солевого обмена, участвуют в регуляции адаптивных реакций организма, то интерпретировать полученные данные достаточно сложно.
В нашем исследовании внутрибрюшинное введение физиологического раствора вызвало активацию синтеза ВП, а также его выведения нейронами ПВЯ (повышенный уровень иРНК ВП на фоне контрольного количества ВП-иммунореактивного вещества) в отличие от СОЯ, где инъекции физиологического раствора не вызвали никаких изменений функционального состояния ВП-ергических нейронов (табл. 6; рис. 106). Этот факт можно объяснить тем, что ПВЯ является одним из основных центров, отвечающих за стрессорный ответ организма, тогда как СОЯ в первую очередь ответственно за регуляцию водно-солевого обмена. Поэтому понятно, почему такой стрессорный фактор как инъекции физиологического раствора вызывал изменения функционального состояния ВП-ергических нейронов именно ПВЯ.
Дегидратация, также как и в СОЯ, привела к активации синтеза ВП и его выведения нейронами ПВЯ, так как в этом случае повышенному уровню иРНК ВП соответствовало пониженное по сравнению с контролем количество ВП-иммунореактивного вещества (табл. 6; рис. 106). После применения на фоне дегидратации блокатора синтеза КА a-mpt и уровень иРНК ВП, и содержание ВП-иммунопозитивного вещества достоверно не отличались от таковых, характерных для дегидратированных животных (табл. 6; рис. 106). Из этого следует, что недостаток КА в условиях дегидратации не вызвал изменений в активности синтеза ВП и его выведения из перикарионов в пределах ПВЯ.
