Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора До Хыу Кует

Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора
<
Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

До Хыу Кует. Компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.03.01 / До Хыу Кует;[Место защиты: ФГБОУ ВО Белгородский государственный аграрный университет имени В.Я. Горина], 2017.- 129 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 9

1.1. Морфологические и физиологические особенности гемоцитов рыб 9

1.1.1. Морфологические особенности клеток крови рыб 9

1.1.2. Функции клеток крови рыб 15

1.2. Структурно-функциональные особенности плазматической мембраны клеток крови 19

1.2.1. Структурные особенности плазматической мембраны 19

1.2.2. Структурная организация мембраны эритроцита 20

1.2.3. Функции клеточной мембраны 22

1.2.4. Влияние различных факторов на функциональное состояние мембран эритроцитов

1.3. Механизм миграции клеток крови 26

1.4. Роль актинового цитоскелета в регуляции миграционной активности клеток

1.4.1. Структурно-функциональные особенности актинового цитоскелета 28

1.4.2. Функциональная активность актинсвязывающих белков 29

1.4.3. Мембранный цитоскелет эритроцитов 30

1.4.4. Участие актинового цитоскелета в активации клеток и их миграции 31

1.5. Зависимость сезонных колебаний физиологических функций животных от

температуры окружающей среды 32

1.5.1. Сезонная периодичность физиологических функций организма 32

1.5.2. Роль температурного фактора в формировании сезонных ритмов 34

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37

2.1. Организация эксперимента 37

2.2. Методы изучения гематологического профиля у представителей костистых рыб 44

2.3. Метод атомно-силовой микроскопии 44

2.3.1. Изучение морфометрических параметров эритроцитов и лейкоцитов рыб 45

2.3.2. Изучение упруго-элатических и адгезионных свойств плазмалеммы эритроцитов и лейкоцитов рыб 46

2.4. Метод изучения спонтанной миграционной активности клеток крови 47

2.5. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

2.5.1. Пробоподготовка гемоцитов Cyprinus carpio для флуоресцентного анализа 48

2.5.2. Флуоресцентный анализ актинового компонента цитоскелета клеток крови Cyprinus carpio 49

2.6. Методы статистической обработки результатов исследования 50

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 51

3.1. Гематологические показатели крови рыб 51

3.1.1. Cyprinus carpio 51

3.1.2. Hypophthalmichthys molitrix 56

3.1.3. Ctenopharyngodon idella 60

3.1.4. Carassius gibelio 64

3.2. Динамика морфометрических параметров эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов рыб в ответ на действие температурного фактора 67

3.2.1. Cyprinus carpio 67

3.2.2. Hypophthalmichthys molitrix 71

3.2.3. Ctenopharyngodon idella 74

3.2.4. Carassius gibelio

3.3. Механизмы миграционной активности клеток крови рыб (на примере Cyprinus carpio) 81

3.4. Циркануальные изменения площади спонтанной миграции эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Cyprinus carpio в ответ на действие температурного фактора 84

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 88

Выводы 95

Практические рекомендации 96

Список литературы 97

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Одной из актуальных проблем клеточной физиологии является изучение процессов адаптации к действию экстремальных факторов среды, к числу которых относится температура (Федорова М.З., 2002; Hochachka P.W., Somero G.N., 2002; Hansen P.J., 2004; Prtner H.O. et al., 2005; Абатчикова О.А., Костеша Н.Я., 2010). Несмотря на широкий спектр исследований, охватывающих проблему изучения влияния данного фактора на организм рыб (Brett J.R., 1971а; Precht H. et al., 1973; Coutant C.C., 1975; Виленкин Б.Я., 1977; Ивлева И.В., 1981; Jobling M., 1981; Слоним А.Д., 1986; Beitinger T.L. et al., 2000; Исаев Р.А. и соавт., 2012; Кулаченко В.П. и соавт., 2013; Голованов В.К., 2013а, б), до настоящего времени остается не изученным ряд вопросов, связанных с ключевыми механизмами компенсаторно-приспособительных реакций их клеток крови на воздействие температуры разного диапазона. В частности, требуют исследования физиологические свойства плазматической мембраны, тесно связанные с морфометрическими параметрами ядерных эритроцитов и лейкоцитов рыб, в ответ на колебания температурного фактора. Кроме того, при изменении температуры среды, недостаточно изучены физиологические механизмы спонтанной миграционной активности клеток крови рыб, в том числе процессы преобразования элементов их цитоскелета, определяющие реактивность мембранного аппарата (Gratzer W.B., 1981; Emanuela F. et al., 2011; Скоркина М.Ю., 2014) и локомоционную активность клетки в целом. Исследования такого рода имеют не только теоретическое (анализ и сравнительная оценка внутриклеточных механизмов приспособительных реакций к экстремальным факторам среды), но и, безусловно, практическое (прогнозирование состояния организма на основе оценки клеточных реакций, разработка эффективных мер повышения адаптационных возможностей организма) значение [цит. по Федорова М.З. автореф. дис. д.б.н., 2002. с. 5].

С учетом вышесказанного была сформулирована цель исследования и поставлены основные задачи.

Цель работы: изучить компенсаторно-приспособительные реакции эритроцитов и лейкоцитов рыб на действие температурного фактора в опытах in vitro.

Задачи исследования:

  1. Оценить реактивность плазматической мембраны эритроцитов и лейкоцитов сазана Cyprinus carpio, амура белого Ctenopharyngodon idella, карася серебряного Cara ssius g ibelio, толстолобика белого Hyp ophthalmichthys molitrix на действие температурного фактора.

  2. Изучить механизмы миграционной активности красных и белых клеток крови рыб (на примере Cyprinus carpio) под влиянием температуры.

  3. Определить особенности сезонных изменений площади спонтанной миграции гемоцитов Cyprinus carpio в условиях различной температуры инкубации.

  4. Изучить гематологический профиль крови у представителей костистых рыб: C yp rinus ca rpio, C tenopharyngodon id ella, C arassius gibelio, H ypophthalmichthys m olitrix.

Научная новизна. Впервые с использованием метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) в условиях in vitro изучены компенсаторно-приспособительные реакции красных и белых клеток крови сазана C. carpio, толстолобика белого H. molitrix, амура белого C. idella, карася серебряного C. gibelio на действие

температурного фактора, выражающиеся в изменении физиологических свойств плазмалеммы (упругость, адгезия) и морфометрических параметров клеток (площадь, объем, большой и малый диаметры). Установлена зависимость между устойчивостью красных клеток крови исследуемых видов рыб и температурным диапазоном их жизнедеятельности.

Определены циркануальные изменения площади спонтанной миграции у эритроцитов и лейкоцитов сазана в условиях различных температур инкубации.

Впервые методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
изучены внутриклеточные механизмы реализации компенсаторно-

приспособительных реакций, выражающиеся в перестройке актинового компонента цитоскелета клеток крови у Cyprinus carpio при их миграции.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании полученных данных изучены механизмы компенсаторно-приспособительных реакций клеток крови у представителей костистых рыб (C. carpio, C. idella, H. molitrix, C. gibelio) на действие температурного фактора, реализующиеся с участием плазматической мембраны и элементов цитоскелета.

Результаты исследования расширяют и углубляют содержание понятия «миграция» по отношению к ядерным эритроцитам рыб, способным к спонтанным локомоциям.

Выявленные показатели миграционной активности и перестройки актинового компонента цитоскелета у ядерных гемоцитов C. carpio позволяют более детально понять механизмы фагоцитоза клеток крови рыб.

Полученные данные по изменению миграционной активности ядерных гемоцитов C. ca rpio при действии температурного фактора могут быть использованы для тестирования эффективности и безопасности биологически активных соединений, разрабатываемых с целью их внедрения в технологические процессы аквакультуры.

Выявленный гематологический профиль у представителей костистых рыб может быть использован для оценки их функционального состояния, здоровья и степени адаптации к условиям окружающей среды.

Материалы работы используются в учебном процессе на кафедре биологии Института инженерных технологий и естественных наук НИУ «БелГУ», при написании монографий, учебных и учебно-методических пособий по дисциплинам: «Физиология животных», «Биология клетки», «Иммунология», «Цитология», «Гистология с основами эмбриологии» для студентов направления подготовки 06.03.01 – Биология; «Гематология», «Физиология крови», «Эволюционная физиология» для магистрантов по направлению подготовки 06.04.01 – Биология, магистерская программа «Физиология человека и животных».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

  1. Миграционная активность гемоцитов Cyprinus carpio как компенсаторно-приспособительная реакция эффективно реализуется в пределах физиологического температурного оптимума, за его пределами – снижена.

  2. Для локомоционной активности гемоцитов характерна циркануальная двухфазная ритмичность: повышение в летне-осенний период и снижение в весенне-зимний сезон.

  1. Упруго-эластические и адгезионные свойства плазмалеммы гемоцитов Cyprinus carpio, Hypophthalmichthys molitrix, Carassius gibelio характеризуются реактивностью в условиях физиологического температурного оптимума и резко снижены за его пределами.

  2. Морфометрические параметры эритроцитов исследуемых рыб проявляют устойчивость к действию температурного фактора в пределах границ жизнедеятельности, у лейкоцитов выявлена разнонаправленная динамика их сдвигов.

Достоверность полученных результатов подтверждается наличием
репрезентативной выборки объектов, адекватной целям и задачам исследования,
применением современных методик и сертифицированного высокоточного
микроскопического оборудования (зондовый атомно-силовой микроскоп,
конфокальный лазерный сканирующий микроскоп), соответствующих

компьютерных программ обработки и анализа изображений, достаточным объемом фактического материала, который обработан при использовании методов математической статистики, применяемых в биологических исследованиях; публикацией результатов работы в рецензируемых журналах.

Личное участие автора. Основные результаты, включенные в работу, получены автором самостоятельно. Исследования с использованием светового, зондового атомно-силового микроскопа, конфокального лазерного сканирующего микроскопа осуществлены самостоятельно. Выводы сделаны на основе собственных оригинальных данных. Материалы, включенные в диссертацию, были обсуждены и опубликованы совместно с соавторами и научным руководителем.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и
обсуждены на ХХI съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва-
Калуга, 2010), VII съезде Казахского физиологического общества с международным
участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интергативной –
основа здоровья и долголетия» (Алматы, 2011), X Всероссийской молодежной научной
конференции института физиологии Коми научного центра уральского отделения РАН
(Сыктывкар, 2011), 13-ой Пущинской международной школы-конференции молодых
ученых (Пущино, 2009), 14-ой Пущинской международной школы-конференции
молодых ученых (Пущино, 2010), III международной научно-практической

конференции «Наука в современном информационном обществе» (США, 2014).

Публикация. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ общим объемом 4,22 п.л., авторский вклад – 1,12 п.л., в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 45 рисунков. Список литературы состоит из 314 наименований: 112 отечественных и 202 иностранных источников.

Морфологические особенности клеток крови рыб

«Шнуровидные» клетки – это эозинофильные клетки, которые встречаются на поверхности жаберного эпителия и в слизистом кишечнике костистых рыб. Форма этих клеток вытянута перпендикулярно поверхности, цитоплазма – гранулированная в виде тяжей – «шнурков». «Шнуровидные» клетки посредством поры соединяются с эпителиальными клетками. Имеется предположение, что «шнуровидные» клетки происходят от «бродячих» лейкоцитов (Иванов А.А., 2003), физиологическая роль клеток данного вида практически не изучена.

Функции гранулоцитов. По данным Verburg-van Kemenade L.B.M. et al. (1994), Кондратьевой И.А. с соавт. (2001) функции гранулоцитов рыб и высших позвоночных животных отличаются незначительно. Так, Sigel M.M. et al. (1986) отмечают увеличение количества эозинофилов при заражении рыб паразитами и при воспалениях.

Watson L.J. et al. (1963) и Jakowska S., Nigrelli R.F. (1953) установили, что эозинофилы золотых рыбок Carassius auratus и гуппи Lebistes reticulatus фагоцитируют бактерии. В исследованиях Weinreb E.L. и Weinreb S. (1969) показано, что у золотых рыбок эозинофилы фагоцитировали диоксид тория. Mackmull G., Michels N.A. (1932) выявили фагоцитарную активность эозинофилов Tautogolabrus adspersus в отношении коллоидных частиц углерода в брыжейке, однако данная активность в жабрах рыб не выявлена. Duthie E.S. (1939) описал эозинофилы рыб, как клетки, обладающие подвижностью, однако он отрицал их фагоцитарную активность.

В исследованиях Лягушина Н.Б. и соавт. (1977) показано, что изменения в составе белой крови при острых токсикозах развиваются по единой схеме, характерной для млекопитающих. При токсических заболеваниях в токе крови увеличивается процент фагоцитирующих элементов (Шубина А.В., 1959).

У костистых рыб авторами Hine P.M. et al. (1987) детально изучен цитохимический состав лейкоцитов, в частности ферменты, участвующие в фагоцитозе. Уровень пероксидазы в их гранулоцитах часто изменяется (Hine P.M., Wain J.M., 1988b) и зависит от вида рыб (Hine P.M. et al., 1986b), а также от их физиологического состояния (Yasuda T. et al., 1984; Sakai T. et al., 1987; Hine P.M., Wain J.M., 1988a; Waagbo R. et al., 1988).

Эозинофилы в периферической крови многих видов костистых рыб встречаются редко (Hine P.M. et al., 1987a-d), что затрудняет их изучение (Ezeasor D.N., Stokoe W.M., 1980; Ellis A.E, 1985; Suzuki K., 1986; Reimschuesel R. et al., 1987; Hine P.M., Wain J.M., 1989; Vallejo A.N., Ellis A.E., 1989; Powell M.D. et al., 1990; Cross M.L., Matthews R.A., 1991; Lamas J. et al., 1991). Клетки данного вида могут накапливаться в организме рыб при паразитических инфекциях (Lester R.J.G., Daniels B.A., 1976) и воспалениях (Roubal F.R., 1986), однако это не является достоверным доказательством их антипаразитической функции, в отличие от млекопитающих (Butterworth A.E. et al., 1980).

Методом электронной микроскопии не всегда удается найти различия между базофилами и эозинофилами карповых. При использования цитохимического метода также могут возникать неточности в определении эозинофильных гранулоцитарных клеток и базофилов (Hine P.M., 1992). У базофилов костистых рыб не выявляется метахромазия, в отличие от млекопитающих (Suzuki Y., 1986).

Нейтрофилы костистых рыб участвуют в острой воспалительной реакции (Finn J.P., 1970; Finn J.P., Nielsen N.O., 1971a, b; Nagamura Y., Wakabayashi H., 1983; MacArthur J.I. et al., 1984; Suzuki K., 1986; Suzuki Y., Hibiya T., 1988; Ventura M.T., Grizzle J.M., 1989), также как и клетки данного вида млекопитающих (Montalo R.J., 1988; Benestad H.B., Laerum O.D., 1989). У рыб повышение нейтрофилов в периферической крови может свидетельствовать признаком ранней фазы острого воспаления, полученного в результате инфекции (Bruno D.W., Munro A.L.S., 1986; Lowe-Jinde L., 1986; Clifton-Hadley R.S. et al., 1987; Steinhagen D. et al., 1990). Кроме этого, повышение нейтрофилов в крови рыб, также является неспецифической реакцией на стрессоры разной природы (Ellis A.E., 1981a; Peters G. et al., 1991), например, травмы (Mahajan C.L., Dheer T.R., 1982), воздействие химических веществ (Hlavek R.R., Bulkley R.V., 1980), голодание (Mahajan C.L., Dheer T.R., 1983). Изменение температуры также может оказывать влияние на число нейтрофилов рыб (Dunn S.E. et al., 1989), в результате чего происходит нейтрофилия (Bennett M.F., Neville C.G., 1975) или нейтропения (Dheer J.M.S., 1988). Нейтрофилы рыб могут также реагировать на гельминтозы (Elarifi A.E., 1982; Sharp G.J.E. et al., 1991).

Нейтрофилы рыб принимают участие в фагоцитарных реакциях (MacArthur J.I. et al., 1984; MacArthur J.I., Fletcher T.C., 1985). Фагоцитарная активность нейтрофилов в отношении патогенных частиц, в частности флогистонов, между разными видами рыб различна и имеет индивидуальные особенности (Moritomo T. et al., 1988). Согласно Ellis A.E. (1981b), нейтрофилы могут выполнять внеклеточные бактерицидные функции. В процессе осуществления данной функции они могут изменяться в зависимости от вирулентности и видов возбудителя (Ainsworth A.J., Dexiang C., 1990; Waterstrat P.R. et al., 1991). Фагоцитарная активность нейтрофилов у рыб зависит от температуры окружающей среды (O Neill J.G., 1985). Таким образом, нейтрофилы большинства видов рыб фагоцитируют как in vivo (MacArthur J.I., Fletcher T.C., 1985; Suzuki K., 1986; Siwicki A., Studnicka M., 1987), так и in vitro (Suzuki K., 1984; Hine P.M. et al., 1986a; Finco-Kent D., Thune R.L., 1987; Thuvander A. et al., 1987; Moritomo T. et al., 1988; Ainsworth A.J., Dexiang C., 1990). Во время воспаления фагоцитарная активность разных субпопуляций нейтрофилов может варьировать (Sovenyi J.F., Kusuda R., 1987).

Изучение морфометрических параметров эритроцитов и лейкоцитов рыб

Для оценки спонтанной миграционной активности гемоцитов в тесте миграции под агарозой использован классический метод, описанный в многочисленных работах (Nelson R.D. et al., 1975; Дуглас С.Д., Куи П.Г., 1983) в модификации (Федорова М.З., Левин В.Н., 2001). Отличием модификационного от устоявшегося метода изучения и оценки спонтанной миграции являлось то, что, во-первых, самопроизвольные локомоции оценивали по миграции эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов из одиночных лунок, что исключало влияние химических агентов, находящихся во второй лунке (Nelson R.D. et al., 1975; Дуглас С.Д., Куи П.Г., 1983), на миграционную активность клеток крови, во-вторых, для получения более точной информации о локомоционной активности клеток крови измеряли не путь, а площадь их распространения (Федорова М.З., Левин В.Н., 2001).

Гемоцитарный профиль у представителей костистых рыб определяли с использованием классического метода световой микроскопии (Лейси А., 1992). 2.2. Методы изучения гематологического профиля у представителей костистых рыб Определение типов клеток крови у рыб были проведены на основе метахромазии цитоплазмы и ядра, а также размеров, формы клеток и их ядер после фиксации и окрашивания мазков по-Романовскому. Также были использованы для сравнения иллюстрации, описанные рядом авторов (Головина Н.А., 1979; Иванова Н.Т., 1983; Иванов А.А., 2003; Campbell T.W., 2015). Изображения клеток были получены с помощью метода световой микроскопии (Лейси А., 1992). В работе использовали оптический микроскоп Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия, 2009) и фотоаппарат Canon SuperShort (Германия, 2009).

Подсчет клеток крови проводили в камере Горяева. Концентрацию гемоглобина измеряли общепринятым методом (Кулаченко С.П., Коган Э.С., 1979).

Методом атомно-силовой микроскопии изучали морфометрические показатели клеток крови Ctenopharyngodon idella, Carassius gibelio, Hypophthalmichthys molitrix и Cyprinus carpio и упруго-эластические и адгезионные свойства их плазмалеммы. Полученную кровь центрифугировали 10 мин при относительной силе центрифугирования равной 400g. Суспензии эритроцитов и лейкоцитов разбавляли изотоническими растворами (см. табл. 2). Далее клетки крови инкубировали при комнатной (20оС), пониженной (5оС) и повышенной (40оС) температурах (тоС) в течение 2 ч. После инкубации гемоцитов делали мазки крови. Методом атомно-силовой микроскопии исследовали по 20-25 клеток в каждой из серий пробоподготовки. Сканирование клеток крови проводили на атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71) (рис. 6). Рисунок 6 – Система зондового атомно-силового микроскопа

Морфометрические параметры клеток изучали в режиме полуконтактного сканирования (Федорова М.З. и соавт., 2008) с частотой развертки 0,6-0,8 Hz, используя кантилевер серии NSG03 с жесткостью 1,1Н/м и радиусом закругления 10 нм (Скоркина М.Ю. и соавт., 2011). На сканах измеряли такие показатели как площадь (S, мкм 2), большой (D, мкм) и малый (d, мкм) диаметры, а также объем (V, мкм 3) клеток. 2.3.2. Изучение упруго-элатических и адгезионных свойств плазмалеммы эритроцитов и лейкоцитов рыб С помощью программного обеспечения «Nova» (NT MDT, Зеленоград, 2009) строили кривые профиля клеток крови, на которых определяли их адгезию к кантилеверу (нН) (рис. 7). Рисунок 7 – Определение адгезии клетки крови с помощью программного обеспечения «Nova 1.0.26.1058»

Модуль Юнга, характеризующий упругость эритроцитов и ПМЯЛ измеряли на АСМ в режиме силовой спектроскопии. Для этого в контактном режиме сканирования регистрировали кривые подвода и отвода, которые обрабатывали с помощью программного обеспечения «Image Analysis 3.5.0.2070» и рассчитывали модуль Юнга (кПа; рис. 8).

Локомоционную активность гемоцитов определяли по площади миграции клеток под агарозой. В качестве критерия самопроизвольной миграции использовали ареал спонтанного распространения лейкоцитов и эритроцитов.

Полученную кровь центрифугировали 10 мин при 400 g. Собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами и лейкоцитарное кольцо. Фракцию, обогащенную лейкоцитами, а также эритроциты разбавляли изотоническим раствором и с помощью камеры Горяева проводили подсчет клеток крови.

В лунки, которые были вырезаны в агарозном геле (рис. 9), нанесенном на предметное стекло, помещали по 3 мкл суспензии клеток крови, разведенной изотоническим раствором, содержащей около 1 млн. клеток. Рисунок 9 – Тест-система миграции клеток под агарозой: 1 – агарозный гель, 2 – лунки, подготовленные для суспензии клеток.

Стекла с гемоцитами сазана инкубировали сутки в среде с 5% содержанием СО2 при оптимальной (20С), пониженной (5С) и повышенной (40оС) температурах. По окончании инкубации гемоциты фиксировали в течение часа 10% глутаровым альдегидом и окрашивали азур-эозином. На малом увеличении микроскопа 40 с помощью окуляр-микрометра определяли площадь спонтанной миграции отдельных пулов клеток.

Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследовали изменения пространственной организации актиновых филаментов ядерных красных и белых клеток крови у сазана до и после миграции под агарозой.

С целью проведения флуоресцентного анализа актинового компонента цитоскелета была проведена пробоподготовка гемоцитов. Предварительно были апробированы 3 способа фиксации клеток крови: с помощью 4% формальдегида, 4% параформальдегида и 10% глутарового альдегида. Использование в качестве фиксатора формальдегида приводило к деформации клеток и изменению их формы. Применение параформальдегида в качестве фиксатора через 10 мин после начала процесса приводило к гемолизу клеток крови. Глутаровый альдегид, согласно исследованиям ряда авторов (Sabatini D.D. et al., 1963; Фрайштат Д.М., 1980; Дуглас C.Д., Куи П.Г., 1983), а также полученным нами данным, способствует сохранению структуры клеток и их прижизненных размеров.

Гемоциты сазана фиксировали в течение 60 мин 10%-ным раствором глутарового альдегида на изотоническом растворе NaCl 0,75%. По окончании процесса фиксации клетки крови отмывали от глутарового альдегида с помощью буфера (PBS, рН 6,8). Фиксированные клетки обрабатывали 0,1%-ным раствором Тритона X-100 на PBS в течение 20 мин, снова отмывали с помощью PBS и высушивали на воздухе. Полученные препараты окрашивали родамин-фаллоидином-R415 (Molecular Probes, США) в течение 15 мин в темноте.

Изучение перестройки микрофиламентов цитоскелета проводили на клетках крови сазана, которые мигрировали под агарозой (Федорова М.З., Левин В.Н., 2001) при комнатной температуре в среде с 5%-ным содержанием СО2 в течение суток. Флуоресценцию актинового компонента цитоскелета клеток визуализировали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon D-Eclipse Ti-E (Япония, 2011). В работе было использовано программное приложение С1 (см. рис. 5) С целью получения изображения актиновых микрофиламентов ядерных эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов использовали объектив с увеличением 60. При исследовании были применены лазеры с длинами волн 488 нм (для возбуждения) и 514 нм (для регистрации свечения

Динамика морфометрических параметров эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов рыб в ответ на действие температурного фактора

В результате проведенных нами исследований установлено, что у сазана и толстолобика белого, при повышенной (40оС) и пониженной (5оС) температурах инкубации, по сравнению с комнатной температурой, морфометрические показатели эритроцитов (площадь, объем, большой и малый диаметры) практически не изменяются. Полученные нами данные на клеточном уровне в опытах in vitro согласуются с температурным диапазоном жизнедеятельности организма рыб. Известно, что данный параметр у сазана находится в пределах от 0оС до +41оС (Никольский Г.В., 1963; Голованов В.К., 2013а), у белого толстолобика – от 0 до +40оС (Vovk P.S., 1979). Кроме того, верхней летальной границей у Cyprinus carpio является температура +43-46оС, у Hypophthalmichthys molitrix – +43,5-46,5оС (Opuszynski K. et al., 1989). Можно предположить, что в пределах этих температурных диапазонов реализуются врожденные механизмы клеточной адаптации к действию температурного фактора.

Морфометрические показатели полиморфноядерных лейкоцитов сазана при повышенной (40оС) температуре инкубации, по сравнению с комнатной температурой, также не изменяются, а при пониженной (5оС) – снижаются. У толстолобика белого увеличение (до 40оС) и снижение (до 5оС) температуры инкубации по сравнению с температурой 20оС не влияют на морфометрические показатели лейкоцитов.

У Ctenopharyngodon idella при пониженной температуре инкубации (5оС), по сравнению с комнатной температурой, морфометрические показатели эритроцитов не изменяются, при повышенной (40оС) – увеличиваются в диаметрах и снижаются в объеме. Согласно данным ряда исследователей, температурный диапазон жизнедеятельности у белого амура варьирует от 0 до +39,3оС (Vovk P.S., 1979; Chilton E.W.II., Muoneke M.I., 1992; Svedentsov E.P. et al., 2006). Исходя из этого, температура инкубации 40оС является критической как для организма белого амура в целом, так и для морфометрических параметров их эритроцитов в частности.

У амура белого, по сравнению с другими видами исследованных рыб, самый узкий температурный диапазон жизнедеятельности, что сказывается также на морфометрических показателях лейкоцитов, которые изменяются как при пониженной температуре инкубации (5оС), по сравнению с комнатной температурой, так и при повышенной (40оС) температуре.

Для серебряного карася температурный диапазон жизнедеятельности находится в пределах границ от 0 до +41оС (Голованов В.К., 2013а). Температура инкубации клеток 40оС в наших исследованиях является практически критической для Carassius gibelio и ведет к снижению большого диаметра эритроцитов. При температуре инкубации 5оС, отмечено также уменьшение площади, большого диаметра красных клеток крови и увеличение их объема.. Предполагаем, что эритроциты у серебряного карася достаточно чувствительны к низкой температуре, хотя температура инкубации 5оС выше, чем минимальная критическая температура (0оС) этого вида рыб.

Лейкоциты карася серебряного более устойчивы, чем эритроциты к пониженной температуре инкубации (5оС). При повышенной температуре инкубации, по сравнению с комнатной, морфометрические показатели белых клеток крови Carassius gibelio увеличиваются.

Таким образом, динамика морфометрических показателей эритроцитов Cyprinus carpio, Ctenopharyngodon idella, Carassius gibelio, Hypophthalmichthys molitrix при действии повышенной и пониженной температур инкубации зависит от величины температурного диапазона жизнедеятельности вида. При сравнительной оценке аналогичных показателей у лейкоцитов общей закономерности не установлено. Наряду с изменениями морфометрических показателей клеток крови рыб под влиянием температурного фактора нами были также изучены механизмы функциональной активности плазматической мембраны эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов сазана Cyprinus carpio, амура белого Ctenopharyngodon idella, карася серебряного Carassius gibelio, толстолобика белого Hypophthalmichthys molitrix на действие температурного фактора.

Предварительно, на примере клеток крови сазана, нами было установлено, что эритроциты рыб способны к спонтанным локомоциям. В настоящее время считается, что динамика переднего края клетки вносит основной вклад в скорость миграции (Кудряшова Т.В. и соавт., 2008). В наших исследованиях выявлено образование на переднем крае коротких протрузий, благодаря которым осуществляется миграция красных клеток крови Cyprinus carpio. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей (Ломакина М.З., Александрова А.Ю., 2010), согласно которым способность клетки к локомоциям во многом определяется изменением её формы. Образование протрузий или псевдоподий у эритроцитов осуществляется благодаря тому, что их плазмалемма имеет складчатость и мембранный резерв (Головко С.И., 2010). В свою очередь, образование псевдоподий у ядерных эритроцитов рыб дает возможность этим клеткам участвовать не только в реакциях миграции (Чернявских С.Д. и др., 2008), осуществляя амебоидные движения, подобно лейкоцитам, но и принимать участие в ряде других процессов, в частности, в процессе фагоцитоза (Чернявских С.Д. и соавт., 2011).

У амура белого нами было выявлено образование длинных псевдоподий у эритроцитов при взаимодействии с лейкоцитами. Рядом авторов описано взаимодействие между эритроцитами и лейкоцитами, особенно макрофагами и нейтрофилами, у позвоночных животных и человека (Brendan J.Q. et al., 2009; Anna N., 2009; Djuna Z. de B. et al., 2014). Однако, в этих случаях, образование псевдоподий отмечено лишь у лейкоцитов в процессе фагоцитоза старых эритроцитов макрофагами.

Циркануальные изменения площади спонтанной миграции эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Cyprinus carpio в ответ на действие температурного фактора

У эритроцитов при снижении температуры инкубации до 5оС, по сравнению с инкубацией при температуре 20оС, на фоне уменьшения площади и большого диаметра (соответственно на 28% и 28%), наблюдали увеличение объема на 54%. Повышение температуры инкубации до 40оС способствовало снижению большого диаметра у красных клеток крови на 15% по сравнению с инкубацией при комнатной температуре.

У полиморфноядерных лейкоцитов при пониженной температуре инкубации уменьшилась только площадь (на 28%), при повышенной температуре инкубации – увеличились площадь (на 113%), объем (на 85%), большой диаметр (на 56%) и малый диаметр (на 59%) клеток.

В таблице 10 представлены показатели, характеризующие свойства плазматической мембраны эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Carassius gibelio после инкубации при разных температурах.

Примечание: Э – эритроциты, ПМЯЛ – полиморфноядерные лейкоциты; тоС – температура инкубации; - достоверное различие по сравнению с температурой 20оС при условии р 0,05 (t-критерий Стьюдента).

Установлено, что при пониженной температуре инкубации (5оС) по сравнению с комнатной температурой изменяются свойства плазмалеммы: адгезия красных и белых клеток крови уменьшилась на 26% и 38%, упругость – на 64% и 61% соответственно. В условиях повышенной температуры инкубации по сравнению с температурой 20оС адгезия ПМЯЛ повысилась на 19%, упругость белых клеток крови незначительно увеличилась.

В третьей серии опытов было установлено, что у Cyprinus carpio красные клетки крови способны к спонтанным локомоциям. На рис. 42 видно, что после 24-х часовой инкубации при комнатной температуре за края лунки мигрировали как лейкоциты, так и эритроциты. При миграции у красных клеток крови сазана на переднем крае наблюдали единичные случаи выпячивания мембраны – короткие протрузии.

Распределение клеток крови сазана в лунке через сутки после инкубации: а – малое увеличение (х40), б – большое увеличение (х400), в – большое увеличение (2000), 1 – эритроциты, 2 – лейкоцит. С помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии выявлены преобразования актинового компонента цитоскелета у ядерных эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Cyprinus carpio. Микрофотография красных клеток крови Cyprinus carpio представлена на рис. 43.

В структуре эритроцитов выявлены следующие компоненты актиного цитоскелета: клеточный кортекс, актиновые стресс-фибриллы и ядерный актин. На рисунке 43 видно, что актиновые стресс-фибриллы радиально отходят от ядра к плазмалемме в виде длинных пучков. Рисунок 43 – Микрофотография эритроцитов сазана, расположенных на стеклянной подложке: 1 – клеточные кортексы, состоящие из актиновых филаментов, 2 – актиновые стресс-фибриллы, 3 – ядерный актин. У белых клеток крови Cyprinus carpio актин также как и у красных клеток крови выявлен в ядре и под наружной цитоплазматической мембраной (рис. 44). Рисунок 44 – Микрофотография лейкоцита сазана, расположенного на стеклянной подложке: 1 – ядерный актин, 2 – цитоплазматическая мембрана. На рисунке 45 представлены клетки крови сазана через сутки после начала миграции. На скане визуализировали изменения структуры актинового компонента цитоскелета, а также формы клеток крови.

Полученные в разные периоды года показатели площади спонтанной миграции гемоцитов Cyprinus carpio представлены в таблице 11.

Как видно из таблицы 11, в весенний период достоверных различий между значениями миграционной активности красных и белых клеток крови не установлено при пониженной (5оС) температуре инкубации по сравнению с комнатной (20оС) температурой. При повышенной температуре инкубации (40оС) площадь локомоционной активности эритроцитов и лейкоцитов была ниже на 13% и 22% соответственно по сравнению с температурой инкубации равной 20оС.

В летний период снижение (до 5оС) и повышение температуры инкубации (до 40оС) приводит к уменьшению миграционной активности у эритроцитов сазана на 10% и 27% соответственно по сравнению с контрольной температурой (20оС) (см. табл. 11). При снижении температуры инкубации лейкоцитов сазана по сравнению с инкубацией при комнатной температуре, площадь спонтанных локомоций клеток не изменяется, при повышении температуры инкубации (до 40оС) происходит уменьшение их локомоционной активности.

В осенний период снижение температуры инкубации красных и белых клеток крови до 5оС по сравнению с комнатной температурой не оказывает влияния на их миграционную активность. При повышении температуры инкубации до 40оС наблюдали уменьшение площади спонтанной миграции только у эритроцитов сазана (на 9%) по сравнению с инкубацией при температуре 20оС.

В зимний период показатели площади спонтанной миграции клеток крови сазана изменялись аналогично осеннему периоду. При увеличении температуры инкубации до 40оС миграционная активность эритроцитов снизилась на 15%, у лейкоцитов не изменилась по сравнению с инкубацией при комнатной температуре. При пониженной температуре инкубации по сравнению с температурой 20оС показатели площади спонтанной миграции эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов достоверно не изменились.

При температуре инкубации равной 5оС в летний и осенний периоды исследования площадь спонтанной миграции эритроцитов сазана на 15% и 18% соответственно снизилась по сравнению с весенним сезоном (см. табл. 11).

При комнатной температуре инкубации миграционная активность красных клеток крови Cyprinus carpio в летний и осенний сезоны на 21% и 17% повысилась по сравнению с весенним периодом.

По сравнению с зимним периодом площадь спонтанной миграции эритроцитов сазана увеличилась при температуре инкубации равной 20оС в летний период (на 9%), при температуре инкубации равной 40оС – в осенний сезон (на 12%).

При пониженной температуре инкубации (5оС) показатели площади спонтанной миграции лейкоцитов сазана в летний и осенний периоды на 16% и 31% повысились по сравнению с весенним сезоном. При вышеназванной температуре инкубации в осенний период спонтанная миграционная активность белых клеток крови сазана также увеличилась (на 16%) по сравнению с зимнним сезоном. При комнатной температуре инкубации показатели площади спонтанной миграции лейкоцитов в летний период повысились на 21% и 9% по сравнению с весенним и зимним периодами. При данной температуре инкубации повышение миграционной активности белых клеток крови в осенний период по сравнению с весенним и зимним сезонами происходило аналогично летнему сезону.

Миграционная активность лейкоцитов сазана при повышенной температуре инкубации (40оС) в летний период увеличилась на 15% по сравнению с весенним сезоном и на 16% снизилась в сравнении с зимним периодом. При температуре инкубации равной 40оС площадь миграции лейкоцитов в осенний период увеличилась на 48% и 11% соответственно по сравнению с весенним и зимним сезонами.