Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Современные представления о генерации мембранного потенциала покоя 11
2.1.1. Мембранный потенциал покоя - важнейшее свойство возбудимых клеток 11
2.1.2. Ионная проводимость мембраны возбудимых клеток 13
2.1.3. Распределение ионов в клетке 15
2.1.4. Калий как основной потенциалобразующий ион 15
2.1.5. Вклад ионов Na+ в мембранный потенциал покоя 18
2.1.6. Вклад ионов СГ в мембранный потенциал покоя 20
2.1.7. Модель Гольдмана-Ходжкина-Катца 21
2.2. Значение активного транспорта ионов для механизма генерации мембранного потенциала покоя 22
2.2.1. Поддержание концентрационных градиентов ионов Na+ и К+ 22
2.2.2. Поддержание концентрации ионов СГ 24
2.3. Влияние изменения ионной проницаемости на мембранный потенциал покоя 26
2.4. Влияние активации или ингибирования ионного транспорта на мембранный потенциал покоя 27
2.5. Организация нервно-мышечной системы олигохет 30
2.6. Мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры земляных червей 32
3. Объекты и методы исследования 36
3.1. Объекты исследования 36
3.1.1. Дождевой червь 36
3.1.2. Лягушка 36
3.2. Методы исследования 36
3.2.1. Подготовка мышечного препарата 36
3.2.1.1. Мышечный препарат дождевого червя 36
3.2.1.2. Мышечный препарат лягушки 37
3.2.2. Электрофизиологические методы исследования 38
3.2.2.1. Растворы 38
3.2.2.2. Метод предварительной нагрузки мышечных волокон Na+ 42
3.2.2.3. Электроды и регистрирующая аппаратура 42
3.2.2.4. Измерение мембранного потенциала мышечных клеток 43
3.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 43
4. Результаты исследования и их обсуждение 44
4.1. Величина мембранного потенциала покоя соматических мышечных клеток дождевого червя 44
4.2. Влияние ионной среды на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя 44
4.3. Влияние изменения ионной проводимости на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя 50
4.4. Вклад Na+,K+-Hacoca в величину мембранного потенциала покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя 52
4.5. Доказательства наличия котранспорта Na+,K+,C1~ в клетках соматической мускулатуры дождевого червя и его значение для мембранного потенциала покоя 62
4.6. Влияние норадреналина и адреналина на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя 68
4.7. Кальциевый механизм активации ионного насоса норадреналином в клетках соматической мускулатуры дождевого червя 76
4.8. Влияние некоторых медиаторов на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя 82
4.9. Влияние холиномиметиков на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя 89
4.10. Влияние ионной среды на карбахолининдуцированную деполяризацию мембраны клеток соматической мускулатуры дождевого червя 96
5. Заключение 103
6. Выводы 109
7. Список литературы 111
- Калий как основной потенциалобразующий ион
- Влияние ионной среды на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя
- Влияние норадреналина и адреналина на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя
- Влияние холиномиметиков на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя
Введение к работе
Актуальность исследования
Мембранный потенциал покоя (МПП) - основная характеристика возбудимых клеток, играющая ключевую роль в процессах передачи сигнала, вторичноактивном транспорте и мышечном сокращении [109]. Его величина формируется за счет разности концентраций потенциалобразующих ионов, а также избирательной ионной проводимости мембраны [133]. Работа активного ионного транспорта создает и поддерживает ионные градиенты, и, кроме того, может вносить прямой вклад в величину МПП в виде амперогенного компонента [6; 33].
Согласно современным представлениям, тип кольчатые черви или аннелиды, по эволюционному положению находятся у истоков филогенетической линии первичноротых, развитие которых привело к возникновению более высокоорганизованных представителей животного мира. Кроме того, кольчатые черви наиболее древняя эволюционная группа, у которой впервые появляется мускулатура, по строению близко напоминающая поперечнополосатую мускулатуру позвоночных животных [11]. Однако в литературе имеются лишь несколько работ, посвященных изучению механизмов формирования и поддержания величины МПП аннелид, которые к тому же носят крайне противоречивый характер [52; 84; 85; 104]. Подробные и системные исследования, показывающие роль потенциалобразующих ионов в генерации МПП, роль активного ионного транспорта, существование вторичноактивного хлорного транспорта, участие проводимости мембраны для отдельных ионов в величине МПП, влияние веществ, обладающих медиаторной активностью на потенциал покоя соматической мускулатуры аннелид в литературе до настоящего времени отсутствуют. Поэтому изучение особенностей электрогенеза в соматической мускулатуре на примере одного из представителей аннелид дождевого
червя, представляется наиболее актуальным, поскольку оно позволит создать единую картину филогенеза механизмов электрогенеза, и, прежде всего, важнейшего из них, как генерация МПП в клетках возбудимых тканей высших беспозвоночных и позвоночных животных.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы явилось изучение механизмов электрогенеза мембранного потенциала покоя в мембране клеток соматической мускулатуры дождевого червя. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
Исследовать влияние основных потенциалобразующих ионов на величину МПП мышечных клеток дождевого червя.
Установить зависимость величины МПП мышечных клеток дождевого червя от дифференциальных проводимостей мембраны для ионов Na+ и СГ.
Исследовать вклад активного Na+,K+-Hacoca в величину МПП мышечных клеток дождевого червя.
Установить факт существования и возможную физиологическую роль активного транспорта СГ в мышечных клетках дождевого червя.
Исследовать влияние некоторых медиаторов на величину МПП мышечных клеток дождевого червя.
Изучить влияние холиномиметиков и холинолитиков на величину МПП мышечных клеток дождевого червя.
Положения, выносимые на защиту:
1. Величина МПП соматических мышечных клеток дождевого червя является суммой калиевого и хлорного диффузионных потенциалов, а также «потенциала» создаваемого работой электрогенных ионных насосов.
Норадреналин, адреналин и ГАМК способны увеличивать трансмембранную разность потенциалов соматических мышечных клеток дождевого червя. Данный эффект связан с активацией рецепторных структур, обеспечивающих вход ионов Са в клетку, при участии Са -акцепторных белков и усиления работы активного ионного транспорта.
Мембрана соматических мышечных клеток дождевого червя обладает высокой чувствительностью к КХ и никотину, но не чувствительна к мускарину. Деполяризация под действием холиномиметиков не устраняется классическими Н— и М-холинолитиками, а также ганлиолитиками.
Научная новизна
В настоящем исследовании впервые показано, что в клетках соматической мускулатуры дождевого червя существует уабаинчувствительный электрогенный Na+,K+-Hacoc, вносящий значительный и постоянный вклад в интегральную величину МПП мышечных клеток по сравнению со скелетными мышечными волокнами. Также установлено, что в мышечных клетках дождевого червя имеется фуросемидчувствительный вторичноактивный Na+,K+,CF котранспорт, который отклоняет равновесный хлорный потенциал от уровня МПП. Впервые показано, что активация Na+,K+-Hacoca норадреналином происходит через чувствительные структуры, сходные с семейством адренорецепторов позвоночных, без вовлечения циклических нуклеотидов, при участии экстраклеточного Са+ и хлорпромазинчувствительных кальцийакцепторных структур подобных кальмодулину позвоночных. Также впервые установлено, что МПП клеток соматической мускулатуры дождевого червя не изменяется под действием серотонина, глутамата, глицина, АТФ и мускарина, тогда как никотин и КХ вызывают деполяризацию, а ГАМК - гиперполяризацию. Увеличение МПП мышечных клеток в присутствии ГАМК
связано с активацией Na+,K+-Hacoca. Кроме того, показано, что в мембране клеток соматической мускулатуры дождевого червя существует особый фармакологический тип АХ-рецепторно-канального комплекса, не чувствительного к воздействию классических холинолитиков - d-тубокурарина, сс-бунгаротоксина, атропина и ганглиолитика - бензогексония.
Научно-практическая ценность
Полученные данные позволяют дополнить картину эволюционного становления основных механизмов электрогенеза мембранного потенциала покоя у беспозвоночных животных. Наши исследования показывают, что мышечный препарат дождевого червя является удобной моделью для изучения базовых механизмов электрогенеза в скелетных мышцах высших животных. Установление факта наличия особого фармакологического типа никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в клетках соматической мускулатуры дождевого червя, возможно, позволит ближе подойти к решению проблемы лечения нервно-мышечных патологий, в основе которых лежит синаптический дефект, в частности, таких как нарушение функционирования и синтеза ацетилхолиновых рецепторов.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН (Казань, 2002, 2003, 2004), XVIII Съезде физиологов России (Казань, 2001), VII и VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2000, 2001), VI региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые Нервные Системы» (Москва-Пущино, 2000), VII региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Калининград-Светлогорск-Отрадное, Россия, 2003), VI Всероссийского симпозиума и школы семинара молодых ученых и учителей «Растущий организм: адаптация к физической и
умственной нагрузке» (Казань, 2002), международной школе-семинаре «Фармакология синаптической трансмиссии в нервной системе» (Киев, Украина, 2002), II Международной конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003) и 8-ой Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пушино, 2004).
Структура и объем диссертации
Диссертация объемом 127 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 173 источника, из них 144 - иностранных авторов. Диссертация содержит 29 рисунков и 4 таблицы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Калий как основной потенциалобразующий ион
Мембранный потенциал хорошо описывается на примере глиальной клетки, мембрана которой проницаема только для одного вида ионов. В целом, селективность мембраны для различных ионов определяется относительным соотношением различных типов открытых ионных каналов в клетке. Глиальная клетка имеет мембранный потенциал порядка -75 мВ. В покое подавляющее большинство ионных каналов в мембране клетки проницаемы только для К+, и как результат, через мембрану проникают исключительно ионы К+ [63]. Глиальные клетки обладают высокой внутренней концентрацией ионов К+ и отрицательно заряженных органических анионов, а снаружи высокой концентрацией Na+ и СГ [115]. Поскольку К+ присутствует в большей концентрации внутри клетки, а глиальная клетка селективно проницаема для него, К+ стремится диффундировать наружу клетки, уменьшая свой химический концентрационный градиент. В результате, вследствие незначительного избытка К+, снаружи мембраны аккумулируется положительный заряд, а внутри - отрицательный заряд, поскольку возникает дефицит К+ и незначительный избыток анионов. С этого момента противоположные заряды, притягивая друг друга, равномерно собираются, образуя на внешней поверхности мембраны слой из положительных зарядов, а на внутренней слой из отрицательных [154].
Диффузия К+ наружу продолжает расти некоторое время. Накопление заряда вследствие диффузии К+ дает увеличение электрической разности потенциалов. Чем больше К+ продолжает выходить, тем больше становится электрический градиент, и тем больше будет разность потенциалов. Поскольку ион К положительно заряжен, разность потенциалов будет стремиться препятствовать дальнейшему выходу К+. Таким образом, на ионы К+ действует две силы, которые управляют ими по обе стороны мембраны: концентрационная сила, зависящая от разности концентраций, и сила электрического поля, которая производится разностью потенциалов. Поскольку диффузия К+ продолжается до определенного момента, потенциал накапливается на мембране до тех пор, пока электрическая сила, управляющая входом К+, в точности не станет равной концентрационной силе, контролирующей выход К+ из клетки. То есть движение К+ наружу по концентрационному градиенту становится равным движению К+ внутрь по электрическому градиенту. Значение электрической разности потенциалов, при котором наблюдается такое равновесие входа и выхода К+, называется равновесным калиевым потенциалом и обозначается Ек- В клетках проницаемых только для К+, равновесный калиевый потенциал определяет мембранный потенциал покоя, который в большинстве глиальных клеток равен примерно -75 мВ [109]. Равновесный потенциал для любого иона X может быть подсчитан из уравнения, полученного на основе термодинамических принципов немецким химиком Уолтером Нернстом: где R - есть газовая постоянная, Т - температура по Кельвину, z - валентность иона, F - постоянная Фарадея, а [Х]0, [Х]І - концентрации ионов снаружи и внутри, соответственно. Для более точного описания равновесного потенциала, концентрации ионов в формуле заменяются на активности ионов. Отношение RT/F при комнатной температуре (25 С) равно 25 мВ, а константа для преобразования натурального логарифма в десятичный равна 2,3. В таком случае уравнение Нернста приобретает вид: Так как валентность для К+ равна 1, то есть z=l, то при известных концентрациях К+ снаружи и внутри клетки можно вычислить равновесный калиевый потенциал [118], так например для аксона кальмара он равен -75 мВ, для мышечных клеток млекопитающих -97 мВ [26]. Уравнение Нернста может использоваться для нахождения равновесного потенциала любого иона, который присутствует по обе стороны мембраны, если она проницаема для этого иона (иногда равновесный потенциал называют потенциалом Нернста). Например, таким же образом могут быть вычислены равновесные потенциалы для Na+ и СГ в аксоне кальмара, они равны +55 и -60 мВ, соответственно [56]. Для генерации мембранного потенциала необходима диффузия ионов по концентрационному градиенту, однако одного пассивного механизма недостаточно, и как будет сказано ниже, для возникновения начальных концентрационных градиентов и их поддержания требуется энергия гидролиза АТФ. Таким образом, равновесное состояние перемещений ионов К+ через мембрану, то есть калиевый диффузионный потенциал, определяет величину потенциала покоя в клетках, проницаемых только для ионов К+. Измерения МПП с помощью внутриклеточных электродов, а также исследование потоков ионов с использованием радиоактивных меток показали, что нервные и мышечные клетки проницаемы не только для К+, но еще и для Na+ и СГ [26; 88]. В цитоплазме нервных и мышечных клеток также имеются большие органические анионы и отрицательно заряженные аминокислоты, непроникающие сквозь мембрану. На мембране этих клеток имеются натриевые каналы, которые в покое обеспечивают незначительную проницаемость для Na+. Две силы влияют на вход Na+ в клетку. Во-первых, поскольку Na+ значительно больше снаружи, возникает тенденция к входу Na+ внутрь клетки по химическому концентрационному градиенту. Во-вторых, вход Na+ в клетку обеспечивается отрицательным зарядом электрической разности потенциалов на внутренней поверхности мембраны. Вход положительно заряженных ионов Na+ деполяризует клетку, но незначительно по сравнению с величиной равновесного калиевого потенциала. Новый уровень мембранного потенциала не находится вблизи значения для равновесного натриевого потенциала, потому что в покое в мембране количество открытых калиевых каналов намного больше, чем количество открытых натриевых [42].
Влияние ионной среды на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя
Изучение зависимости величины МПП мышечных клеток от [К+]0 проводилось еще в двух следующих вариантах эксперимента: в безнатриевом растворе (растворы №5-8, табл. 4.1, рис. 4.1) и в растворе с уабаином (растворы №9-12, табл. 4.1, рис. 4.1). Как в первом, так и во втором вариантах эксперимента двух-, либо трехкратное увеличение [К+]0 в большей степени деполяризует мембрану, если сравнивать с раствором, имеющим весь набор ионов и не содержащим уабаин (табл. 4.1, рис. 4.1). При этом МПП мышечных клеток дождевого червя в растворе с трехкратноувеличенной [К+]0 был существенно ниже (р 0,001), чем в растворе с двухкратноувеличенной [К+]0 (табл. 4.1, рис. 4.1). Графики зависимости МПП мышечных клеток от [К+]0, как в первом, так и во втором случаях оказались практически идентичными и приблизились к теоретической зависимости, соответствующей модели Гольдмана-Ходжкина-Катца. Необходимо отметить возрастающую разницу в величине МПП мышечных клеток в растворах полного ионного состава, с одной стороны, и в растворах с уабаином или в отсутствии в них Na+, с другой, по мере увеличения в них [К+]0 (табл. 4.1, рис. 4.1). Так, при удвоенной [К+]0, разница составляет в среднем 3,0 мВ, тогда как при утроенной [К+] - 13,0 мВ и эти различия были достоверны (р 0,01, рис. 4.1).
Проведенные исследования позволяют высказать мнение, в соответствии с которым отклонение зависимости МПП от [К+]0 от классической кривой вызвано калийзависимой активацией электрогенных ионных насосов. Это одно из важнейших отличий в механизмах формирования МПП в мышцах аннелид и позвоночных животных. Необходимо дополнительно подчеркнуть, что по мере увеличения [К+]0 наблюдается нарастание различий в величинах МПП в мышечных волокнах с интактным, с одной стороны, и инактивированным ионными насосами, с другой. Так, эта разница составляет 5-6 мВ в диапазоне [К+]0 4-8 ммоль/л (одно и двухкратная) и 13 мВ при [К+]0 в 12 ммоль/л (трехкратная). Таким образом, величина "насосного" компонента в величине МПП, а, следовательно, и сам МПП, находятся в прямой зависимости от [К+]0 в жидкостях внутренней среды червя.
Замена раствора нормального ионного состава на раствор, не содержащий СГ, приводит к снижению МПП мышечных клеток дождевого червя (р 0,05, раствор №13, табл. 4.1). Дальнейшая 40-минутная инкубация мышечных клеток в этом растворе усугубляет деполяризацию мембраны. МПП в этом случае составляет -34,4±0,9 мВ («=84, /? 0,001). Таким образом, в первые минуты после удаления СГ из наружной среды наблюдалось падение величины МПП мышечных клеток. Если исходить из предпосылки, что Есі равен МПП и распределение этого иона носит пассивный характер, тогда возникающую деполяризацию можно отнести за счет быстрого перемещения СГ через ионные каналы мышечной мембраны. В таком случае при дальнейшей инкубации мышечных клеток в бесхлорной среде МПП должен был бы вернуться к исходным значениям. Однако 40-минутная инкубация в бесхлорном растворе, напротив, только усугубляла мышечную деполяризацию. Полученные результаты дают основание предполагать, что Еа в мышечных клеток червя не равен МПП, что подразумевает существование активного ионного транспорта, направленного на поддержание внутриклеточной концентрации СГ.
Таким образом, величина МПП клеток продольных мышечных пучков кожно-мускульного мешка дождевого червя вдвое ниже, чем у лягушки и млекопитающих [8]. Величина МПП представляет сумму двух составляющих: а) трансмембранного градиента основных потенциалобразующих ионов, и, прежде всего К+; б) вклада электрогенного компонента уабаинчувствительных ионных насосов, возникающего в результате падения напряжения на входном сопротивлении мембраны [2; 27].
Равновесный потенциал для СГ в мышечных клетках дождевого червя, по-видимому, не равен МПП. В мышечных клетках дождевого червя предположительно существует система активного переноса СГ через мембрану, подобная транспортным системам в гигантском аксоне кальмара [149], гигантском мышечном волокне ракообразных [58], скелетных мышечных волокнах лягушки [4] и млекопитающих [23; 61]. Указанный перенос, возможно, осуществляется системой Ма+,К+,2СГ симпорта [2], сопряженной с работой Ка+,К+-активируемой Mg2+-3aBHCHMOft АТФазы. Предположительно мембранные системы активного транспорта ионов в соматических мышечных клетках дождевого червя могут иметь отношение к механизмам поддержания внутриклеточного осмотического гомеостаза.
Известно, что проводимость мембраны в покое для различных ионов неодинакова и обеспечивается селективными каналами в мембране клетки. Избирательная проводимость и градиент потенциалобразующих ионов приводят к диффузии ионов через мембрану и возникновению мембранного потенциала покоя [26]. Изменение проводящего состояния ионных каналов определенных типов может влиять на значение МПП и, таким образом, показывать роль проводимости мембраны для отдельных ионов в величине МПП [86].
В присутствии в растворе тетродотоксина - блокатора потенциалзависимых натриевых ионных каналов [26; 126], МПП мышечных клеток дождевого червя равнялся -48,1+1,0 мВ (л=80) (рис. 4.2). Закисление раствора до рН 5,6, блокирующее селективную хлорную проводимость [66], также не изменяло МПП мышечных клеток, который в этих условиях составлял -49,1+0,9 мВ (п=80) (рис. 4.2).
Влияние норадреналина и адреналина на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя
Известно, что изменение проницаемости мембраны клетки, может происходить под действием различных веществ, например нейромедиаторов, которые имеют специфические рецепторы на мембране. Связывание нейромедиаторов с рецепторами приводит к открытию ионных каналов и увеличению проводимости мембраны для ионов, что понижает или повышает уровень МПП [109]. Кроме того, некоторые медиаторы, могут влиять на потенциал покоя и за счет изменения величины вклада электрогенного компонента Ыа+,К+-насоса [7; 19; 59]. Также известно, что основным медиатором при передаче возбуждения с нерва на клетки соматической мускулатуры дождевого червя, является АХ [11; 169]. Однако, не исключено, что мембрана мышечных клеток, имеющих полинейрональную мультитерминальную иннервацию, обладает чувствительностью и к другим медиаторам.
Установлено, что такие вещества как серотонин, глутамат, глицин и АТФ являются медиаторами возбуждения, как у позвоночных, так и беспозвоночных [16; 145]. АТФ может служить комедиатором, выделяющимся совместно с основным нейротрансмиттером, например АХ, и способным модулировать функциональные свойства постсинаптической мембраны [152]. Добавление в раствор таких веществ, как: серотонин, глутамат, глицин и АТФ, в каждой отдельной серии экспериментов, не влияло на величину МПП мышечных клеток дождевого червя (рис. 4.18). Можно думать, что мышечные клетки кожно-мускульного мешка не содержат рецепторов к серотонину, глутамату, глицину и АТФ, по крайней мере, в количестве, достаточном для изменения МПП. В то же время добавление в раствор ГАМК вызвало гиперполяризацию мышечной мембраны (рис. 4.19). Имеются исследования, показывающие, что соматические мышечные клетки дождевого червя имеют двойную иннервацию, а именно возбуждающую (деполяризующую) - с медиатором АХ и тормозную (гиперполяризующую) - с медиатором ГАМК [11]. Увеличение МПП под действием ГАМК может иметь два различных механизма. Первый - изменение ионной проницаемости мембраны через активацию ионных каналов, обеспечивающих выходящий калиевый или входящий хлорные токи. Второй - увеличение потенциала, создаваемого работой активных ионных насосов (см. главу 4.4). Ранее нами было показано, что потенциал покоя мышечных клеток дождевого червя является суммой калиевого, хлорного диффузионных потенциалов и потенциала, создаваемого активными Ыа+,К+-насосом и вторичноактивным хлорным котранспортом (см. главу 4.5). При этом вклад последнего компонента в величину МПП весьма внушителен (см. главу 4.4). Опыты показали, что в бесхлорном растворе наблюдается снижение МПП (рис. 4.19), и в этом случае, ГАМК утрачивает способность гиперполяризовать мышечную мембрану (рис. 4.19). Известно, что потенциал равновесия для СГ в мышце червя не равен МПП, и возникающий при этом градиент поддерживается работой активного СГ-транспорта (см. главу 4.5). Следовательно, можно думать, что мышечная мембрана содержит ГАМК-ергические рецепторы, сопряженные с хлорными каналами [103; 108]. Активация ГАМК-ергических рецепторов индуцирует входящий по градиенту хлорный ионный ток, что и приводит к увеличению МПП. В то же время нами было показано, что активные ионные насосы находятся в активном состоянии и, тем самым, вносят непосредственный вклад (насосный потенциал) в величину МПП, только в присутствии в растворе всех потенциалобразующих ионов, включая и СГ (см. главы 4.4, 4.5). Следовательно, отсутствие гиперполяризующего эффекта ГАМК на МПП мышечных клеток в бесхлорном растворе может быть обусловлено инактивацией амперогенных ионных насосов. Чтобы проверить такую возможность нами были проведены эксперименты с изучением влияния ГАМК на МПП в условиях выключенной уабаином ионной помпы. Эксперименты показали, что инактивация ионных насосов уабаином снижает МПП (рис. 4.20). Применение ГАМК на фоне действия уабаина не приводило к гиперполяризации мембраны (рис. 4.20). Следовательно, причиной вызванного ГАМК увеличения трансмембранной разности потенциалов может быть активация ионной помпы, а не входящий ток СГ. Удаление из раствора К+ также ингибирует работу ионных насосов, но в силу особенностей формирования МПП мышечных клеток дождевых червей бескалиевый раствор не изменяет потенциал покоя (см. главу 4.4). В наших экспериментах отсутствие ионов калия в растворе не влияло на величину МПП (рис. 4.20). При этом аппликация на мышцу ГАМК в отсутствии ионов калия в среде не изменяла потенциал покоя (рис. 4.20). Важно подчеркнуть, что инактивация ионных насосов мембраны мышечных клеток дождевого червя в разных вариантах экспериментов устраняет гиперполяризующий эффект ГАМК. Добавление в омывающий мышцу раствор стрихнина не изменяло МПП (рис. 4.21). В то же время ГАМК в его присутствии также утрачивал способность увеличивать трансмембранную разность потенциалов (рис. 4.21). Известно, что стрихнин является блокатором глицин-зависимых хлорных каналов и А-подтипа ГАМК-рецепторов, связанного также с хлорным каналом [108]. По-видимому, активирующее ионную помпу действие ГАМК каким-то образом обусловлено рецепторами, чувствительными к блокирующему действию стрихнина и, возможно, с трансмембранным перемещением СГ.
Влияние холиномиметиков на мембранный потенциал покоя клеток соматической мускулатуры дождевого червя
Мембранный потенциал покоя возбудимых клеток зависит, в основном, от ионной проводимости мембраны и электрохимического градиента основных потенциалобразующих ионов [26]. Образование и поддержание разности концентраций обеспечивается благодаря работе активного ионного транспорта. Кроме того, в клетках существует вторичноактивный ионный транспорт, а также транспорт низкомолекулярных веществ, которые используют энергию существующих ионных градиентов [2]. На основе концентрационных градиентов, а, следовательно, потенциала покоя, развивается потенциал действия, участвующий в процессах передачи сигнала между нервными и мышечными клетками и сокращения мышц [109].
В настоящее время в литературе имеются отрывочные сведения, касающиеся механизмов формирования МПП соматических мышечных клеток дождевого червя, согласно которым, величина МПП мышечных клеток дождевого червя отличается низким значением по сравнению со скелетными мышечными волокнами [52; 60; 84; 85], а мембрана мышечных клеток обладает пониженной калиевой и повышенной натриевой проницаемостями [11; 104]. Несмотря на это в литературе до настоящего времени отсутствуют детальные исследования по изучению формирования МПП в соматической мускулатуре дождевого червя, такие как роль потенциалобразующих ионов, вклад ионной проводимости, вклад активного транспорта в величину МПП, наличие вторичноактивного хлорного транспорта и т.д. Проведение таких исследований очень важно, поскольку позволит создать целостное представление о механизмах формирования МПП соматических мышечных клеток дождевого червя.
Результаты наших экспериментов показали, что значение МПП для клеток соматической мускулатуры дождевого червя Lumbricus terrestris составляет порядка -48,7 мВ. Эта величина соответствует данным литературы [52; 60; 84; 85]. Полученное среднее значение МПП для мышечных клеток дождевого червя, примерно в два раза меньше МПП для скелетных мышечных волокон.
В работе Ito с соавт. [104] низкая величина МПП мышечных клеток дождевого червя объясняется повышенной натриевой проницаемостью. В наших экспериментах в безнатриевом растворе гиперполяризация мембраны не наблюдается, что наоборот свидетельствует об относительно невысокой натриевой проницаемости мембраны. Применение тетродотоксина - блокатора потенциалзависимых натриевых каналов [26; Nasledov et al., 129], также не выявило повышенной проницаемости для Na+. Кроме того, нами также установлено, что блокада хлорной проводимости закислением среды до рН 5,6 [66] не влияет на величину МПП мышечных клеток дождевого червя. Все это говорит о том, что низкая величина МПП мышечных клеток дождевого червя, скорее всего, не связана с высокой проницаемостью мембраны для ионов Na+ и СГ.
Проведенный анализ влияния модифицированных ионных растворов и уабаина на МПП мышечных клеток дождевого червя показывает, что зависимость величины МПП от внеклеточной концентрации ионов К+ приближается к классической кривой рассчитанной по модели Гольдмана-Ходжкина-Катца [26; 88], только при условии отсутствия во внешней среде ионов Na+, К+, СГ или в присутствии уабаина. Из этого следует, что величина МПП мышечных клеток дождевого червя представляет собой сумму электрохимического градиента основных потенциалобразующих ионов, и прежде всего, ионов К+, а также вклада электрогенных ионных насосов в интегральную величину МПП в виде «насосного потенциала».
Вклад электрогенных ионных насосов в величину МПП мышечных клеток дождевых червей создается работой уабаинчувствительного Na+,K+-Hacoca. В отличие от амфибий, не имеющих электрогенного компонента [6] и теплокровных животных у которых он сравнительно небольшой [8; 121], доля вклада Na+,K+-Hacoca в МПП мышечных клеток дождевого червя, по нашим данным, является чрезвычайно большой и находится в прямой зависимости от концентрации ионов К+ снаружи клетки. Необходимо также отметить, что одним из важных отличий формирования МПП мышечных клеток дождевого червя от скелетных мышечных волокон является то, что при повышении концентрации К+ снаружи, происходит активация электрогенных ионных насосов.
Установлено, что в генерации МПП некоторых типов возбудимых клеток принимает участие вторичноактивный Na+,K+,CP котранспорт, регулирующий внутриклеточное содержание ионов СГ [4; 23; 24]. Наши эксперименты показали наличие в клетках соматической мускулатуры дождевого червя Na+,K+,CP котранспорта. Этот транспорт является как уабаин, так и фуросемидчувствительным и осуществляется только при условии наличия в среде всех переносимых им ионов, то есть ионов Na+, К+ и СГ. Скорее всего, транспорт ионов котранспортом СГ и Na+,K+-насосом в мышечных клетках дождевого червя совершается одновременно, несмотря на то, что в транспорте могут участвовать самостоятельные молекулярные переносчики. Хлорный котранспорт в мышечных клетках дождевого червя, возможно, имеет электрогенную компоненту, а перенос ионов СГ, вероятно, направлен наружу клетки.
В литературе отсутствуют какие-либо сведения, доказывающие наличие адренергических нейронов, а также норадреналина и адреналина во внутренней среде дождевого червя [11]. Однако, согласно нашим данным, присутствие норадреналина и адреналина в омывающем растворе вызывает прирост трансмембранной разности потенциалов мышечных клеток дождевого червя. Это увеличение МПП происходит, прежде всего, за счет активации работы Na+,K+-noMnbi. Исследование механизмов активации электрогенного Na+,K+-Hacoca катехоламинами в мышечных клетках дождевого червя, показывает, что усиление работы ионного насоса происходит через чувствительные структуры сходными с семейством адренорецепторов позвоночных.
Необходимо подчеркнуть, что в отличие от мышечных волокон позвоночных в процессе активации Na+,K+-Hacoca в мышечных клетках дождевого червя, не принимают участие такие циклические нуклеотиды, как цАМФ и цГМФ. При взаимодействии катехоламинов с адренорецепторами, ионы Са2+ поступают в клетку, где связываются с акцепторным белком подобным кальмодулину позвоночных, предположительно усиливающим работу электрогенных ионных насосов. При этом, как для активации катехоламинами активного ионного насоса так и для его работы, обязательно присутствие в критически достаточной концентрации внеклеточного Са2+.
Известно, что сдвиги уровня МПП могут происходить в результате изменения ионной проводимости мембраны, либо вследствие перемен в работе активного ионного транспорта. Так, при взаимодействии нейромедиатора со специфическим рецептором, наблюдается повышение проводимости мембраны, приводящее к изменению величины МПП [109]. Кроме того, такой нейромедиатор как АХ в малых концентрациях, может влиять на активность Ка+,К+-помпы, и увеличивать электрогенность Иа+,К+-АТФазы [5; 23]. Согласно нашим экспериментальным данным, величина МПП клеток соматической мускулатуры дождевого червя не изменяется в присутствии во внешней среде серотонина, глицина, глутамата и АТФ, что свидетельствует о не чувствительности мембраны к данным медиаторам. Имеются исследования показывающие, что соматическая мускулатура дождевого червя обладает двойной иннервацией, в которой, предположительно, секретируются два типа медиатора, деполяризующий - АХ и гиперполяризующий — ГАМК [11]. В наших опытах установлено, что КХ — негидролизуемый аналог АХ в малых дозах, не изменяет величину МПП мышечных клеток дождевого червя, но повышение концентрации КХ снижает уровень МПП. Присутствие ГАМК вызывает гиперполяризацию мембраны мышечных клеток дождевого червя, при участии рецепторов, чувствительных к блокирующему действию стрихнина.
