Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Дофаминергическая система мозга 10
1.2 Дофаминергическая нигростриатная система 11
1.2.1 Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы 12
1.2.1.1 Синтез дофамина 12
1.2.1.2 Запасание дофамина 13
1.2.1.3 Выделение дофамина
1.2.1.3.1 Докирование и прайминг везикул в активной зоне 17
1.2.1.2.1 Экзоцитоз синаптических везикул 18
1.2.1.2.2 Регуляция экзоцитоза 21
1.2.1.2.3 Эндоцитоз и траспорт везикул 21
1.2.1.4 Обратный захват и деградация дофамина 22
1.3 Морфо-функциональная организация стриатума 26
1.3.1 Кортикостриатная система 26
1.3.2. Морфологическая характеристика стриатума 26
1.3.3 Афферентная иннервация стриатума 27
1.3.4 Стриатофугальная система 28
1.3.5 Роль дофамина в регуляции моторного поведения 29
1.4. Функциональная недостаточность дофаминергической нигростриатной системы при болезни Паркинсона 31
1.4.1 Этиология и патогенез Болезни Паркинсона 31
1.4.2 Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона 35
1.5 Экспериментальное моделирование болезни Паркинсона 36
1.5.1 Клеточные модели болезни Паркинсона 37
1.5.2 Модели болезни Паркинсона на животных 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1 Животные, моделирование болезни Паркинсона 42
2.2 Взятие материала 42
2.3 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 43
2.4 Электрофорез белков в полиакриламидном геле 45
2.5 Вестерн-блот 45
2.6 Иммуногистохимия 46
2.7 Световая микроскопия и анализ изображений 47
2.8 Полуколичественный анализ содержания ДАТ и ВМАТ2 в терминалях аксонов стриатума 47
2.9 Выделение вентрального среднего мозга эмбрионов мыши 48
2.10 Первичная культура дофаминергических нейронов вентральной части среднего мозга эмбрионов мыши 49
2.8 Моделирование болезни Паркинсона in vitro и скрининг нейропротекторов 50
2.9 Иммуноцитохимия in vitro 50
2.10 Световая микроскопия и количественная оценка дофаминергических нейронов в первичной культуре клеток среднего мозга мыши 51
2.11. Определение содержания дофамина и его метаболитов 52
2.12 Оценка скорости обратного захвата дофамина 53
2.13 Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3. Результаты 55
3.1. Модели доклинической и ранней клинической стадии болезни Паркинсона у мышей 55
3.1.1 Содержание мРНК ДАТ и ВМАТ2 в черной субстанции 55
3.1.2 Содержание белка ДАТ и ВМАТ2 в черной субстанции и стриатуме
3.1.2 Количественный анализ ДАТ- и ВМАТ2-иммунореактивных волокон стриатума 59
3.1.3 Внутринейрональное содержание белков ДАТ и ВМАТ2 в волокнах стриатума 62
3.1.5 Содержание мРНК белков везикулярного цикла в черной субстанции 62
3.1.6 Содержание белков везикулярного цикла в черной субстанции и стриатуме 63
3.1.7 Содержание мРНК белков везикулярного цикла в стриатуме и моторной коре 65
3.2. Клеточная модель болезни Паркинсона in vitro 67
3.2.1 Морфо-функциональная характеристика дофаминергических нейронов через 24
часа после введения МФП+ 67
3.2.2 Влияние пролин-глицин-пролин-дофамина и N-докозогексаноил-дофамина на морфо-функциональное состояние дофаминергических нейронов in vitro 69
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 74
4.1. Компенсаторные процессы в нигростриатной системе при моделировании доклинической стадии болезни Паркинсона 76
4.1.1 Компенсаторные изменения экспрессии генов и содержания белков везикулярного цикла 76
4.1.2 Изменения экспрессии генов и содержания белков ДАТ и ВМАТ2 78
4.2. Компенсаторные процессы и потенциальные триггеры нарушения моторного поведения в нигростриатной системе при моделировании клинической стадии болезниПаркинсона 81
4.2.1 Изменения экспрессии генов и синтеза белков везикулярного цикла 81
4.2.2. Изменения экспрессии генов и синтеза белков ДАТ и ВМАТ2 82
4.3. Влияние дегенерации дофаминергических нейронов на экспрессию генов везикулярного цикла в стриатуме и моторной коре 83
4.4. Клеточная модель болезни Паркинсона 85
4.3.1. Развитие нейродегенеративного процесса ДА-ергических нейронов в культуре клеток. 86
4.3.2. Использование клеточной модели болезни Паркинсона для тестирования потенциальных нейропротекторов 87
Заключение 90
Выводы 91
Список сокращений 92
Список литературы 93
- Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени
- Содержание мРНК белков везикулярного цикла в стриатуме и моторной коре
- Влияние дегенерации дофаминергических нейронов на экспрессию генов везикулярного цикла в стриатуме и моторной коре
Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы
Нигростриатная система обеспечивает связь двух крупных структур мозга – среднего мозга (мезенцефалона) и базальных ганглиев, располагающихся в переднем мозге [Bjrklund, Dunnett, 2007]. В ЧС выделяют две области: компактную, в которой содержатся тела ДА ергических нейронов и ретикулярную, образованную дендритами нейронов компактной части ЧС, где также обнаружено незначительное количество тел ДА-ергических нейронов [Gerfen et al., 1987; Отеллин, Арушанян, 1989]. Компактная часть ЧС на 80-95% состоит из ДА-ергических нейронов, тогда как оставшиеся клетки являются нейронами недофаминергической природы. Они представляют собой ГАМК-ергические и холинергические нейроны, которые обладают отличными от ДА-ергических нейронов ЧС электрофизиологическими свойствами. Функция этих нейронов до конца не ясна. Было показано, что часть таких нейронов посылают свои отростки в стриатум, что дает возможность предположить их участие в регуляции работы базальных ганглиев [van der Knooy et al., 1981].
По морфологическим характеристикам ДА-ергическую популяцию нейронов ЧС делят на 2 группы. Первая группа - веретенообразные нейроны, размер которых составялет 12-25 мкм. Эти нейроны распологаются в дорзальной части ЧС. Вторая группа-мультиполярные нейроны размером 25-35 мкм, расположенные в вентральной части ЧС. 1.2.1 Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы 1.2.1.1 Синтез дофамина
Синтез ДА включает три ферментативные реакции: аминокислота фенилаланин превращается в тирозин с помощью фермента фенилаланингидроксилазы, далее бензольное кольцо тирозина гидроксилируется в 3 положении ферментом тирозингидроксилазой (ТГ), в результате чего образуется L-ДОФА. От L-ДОФА отщепляется карбоксильная группа при участии фермента декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (ДАА) и образуется ДА (рисунок 2) [Deutch, Roth, 2004]. н Т3 н2 / -с -сн фенилаланин / о фенилаланингидроксилаза а декарбоксилаза ароматических L-аминокислот дофамин Рисунок 2 - Схема синтеза дофамина ТГ - скорость лимитирующий фермент синтеза ДА, основной функцией которого является контроль уровня концентрации ДА в нейроне [Levitt et al., 1965]. ТГ относится к монофункциональным оксидазам, т.е. обладает относительной субстратной специфичностью и гидроксилирует не только тирозин, но также фенилаланин, особенно в условиях подавления активности фенилаланингидроксилазы [Harsing, 2008]. Для работы ТГ необходимы кофактор тетрагидробиоптерин, выступающий в качестве донора водорода, ионы Fe2+ и молекулы кислорода [Kumer, Vrana, 1996].
Регуляция работы ТГ как скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА представляет собой набор сложных биохимических процессов. Механизмы регуляции активности ТГ можно разделить на быстрые и медленные. К быстрым механизмам относят посттрансляционные изменения, к медленным – изменения скорости транскрипции и трансляции.
Быстрые изменения активности ТГ происходят через фосфолирирование и дефосфолирирование четырех остатков серина (Ser8, Ser19,Ser31, Ser40) на N-конце фермента с помощью различных протеинкиназ, включая протеинкиназы А, С и Са2+/кальмодулин-зависимою протеинкиназу II [Dunkley et al, 2004; Daubner, Wang, 2011]. Фосфолирирование остатков серина в положении 19 и 40 активирует ТГ, тогда как – в положении 8 и 31 повышает каталитическую активность [Dunkley et al, 2004; Daubner, Wang, 2011]. К медленным механизмам регуляции активности ТГ относится регуляция транскрипции путем альтернативного сплайсинга незрелой мРНК, что характерно только для приматов [Kumer and Vrana, 1996]. Следствием этого процесса является наличие 4-х (в случае человека) или 2-х (в случае всех остальных приматов) различных изоформ белка ТГ, отличающихся числом аминокислотных остатков в их составе, кинетическими свойствами и различным распределением в тканях организма. К медленным путям регуляции ТГ также относят посттранскрипционные изменения времени полужизни зрелой мРНК и изменения скорости трансляции [Kumer and Vrana, 1996].
Второй фермент синтеза ДА – декарбоксилаза ароматических L-аминокислот (ДАА) является пиридоксин-зависимым ферментом и может катализировать декарбоксилирование различных аминокислот: L-ДОФА, мета-тирозина и 5-гидрокситриптофана [Elsworth, Roth, 1997]. На активность ДАА оказывают влияние ионы металлов. Так, ионы Fe2+, F3+ и K+ слабо ингибируют активность ДАА, а ионы Cu2+, Zn2+, Hg2+ оказывают сильный ингибирующий эффект на ДАА [Christenson et al., 1970].
ДА хранится в так называемых синаптических везикулах или больших везикулах с плотным содержимиым. Синаптические везикулы имеют очень маленькие размеры - их диаметр составляет примерно 50 нм, тогда как у везикул с плотным содержимиым диаметр может варьироватся от 100 до 1000 нм. Матрикс везикул с плотным содержимым является зернистым и состоит из водорастворимых гликопротеинов. В данных везикулах ДА находится в связанном состянии с гликопротеинами, что увеличивает место для хранения нейротрасмиттера [Helle et al., 1985]. Синаптические везикулы, в отличии от везикул с плотным содержимиым не содержат растворенного белка. Цитоплазматический ДА транспортируется в синаптические везикулы с помощью везикулярного транспортера моноаминовов 2-го типа (ВМАТ2) (рисунок 3). Транспорт цитозольного ДА в везикулы - АТФ-зависимый процесс, работающий по принципу вторично-активного транспорта. Протонная помпа, локализованная в мембране везикулы, создает внутри везикулы электрохимический градиент, закачивая в них протоны и тем самым закисляя среду внутри везикулы. В свою очередь ВМАТ2, используя энергию градиента концентрации, работает по принципу антипорта – транспортируя протоны водорода в цитоплазму по градиенту концентрации, а цитоплазмитический ДА в везикулы против градиента концентрации [Harsing, 2008; Wimalasena, 2011]. протонная помпа ВМАТ АТФ рН 7. АДФ Н Н ДА ВМАТ2 - везикулярный транспортер моноаминового 2-го типа; ДА- дофамин
Схематичное изображение транспорта дофамина через ВМАТ2 в синаптическую везикулу ВМАТ2 – гликопротеин с молекулярной массой около 70 кДа, состоящий из 12 трасмембранных доменов, N- и C-концы которого направлены в цитоплазму, а между первым и вторым доменами транспортера находится петля с гликозилированными сайтами (рисунок 4) [Erickson et al., 1992; Erickson, Eiden, 1993; Wimalasena, 2011]. Наполнение везикул ДА и, как следствие, количество выделенного ДА при экзоцитозе в синаптическую щель, напрямую зависят от количества транспортера в мембране везикулы и скорости захвата им ДА. Важную роль в захвате ДА в везикулы было продемонстрировано на мышах с выключенным геном ВМАТ2. Такие мыши погибали в течение нескольких дней после рождения. При этом в стриатуме отсутствовало стимулированное выделение ДА [Wang et al., 1997]. У мышей, экспрессирующих лишь 5% ВМАТ2 по сравнению с диким типом, было показано снижение содержания ДА в везикулах и, как следствие, снижение стимулированного выделения ДА в стриатуме на 30% [Takahashi et al., 1997; Mooslehner et al., 2001; Patel et al., 2003].
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
В работе использовано 80 самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяцев и весом 22-26 г. Мыши содержались в стандартных условиях вивария, при температуре 21С ± 1С, со сменой светлой и темной фаз суток 12/12 часов при свободном доступе к пище и воде. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по охране животных Института биологии развития РАН, находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями.
Для воспроизведения доклинической стадии БП мышам подкожно вводили МФТП (Sigma, США) двукратно по 8 мг/кг с двухчасовым интервалом между инъекциями (обозначается как 2х8). Для воспроизведения ранней клинической стадии БП МФТП вводили в дозе 10 мг/кг четырехкратно с двухчасовым интервалом между инъекциями (обозначается как 4х10).Во всех экспериментах всем контрольным животным, по аналогичной опытным животным схеме, вводили физиологический раствор (0.9% NaCl). Сбор материала во всех экспериментах (2х8 и 4х10) проводили через 2 недели после инъекций МФТП.
Для сбора материала животных декапитировали, извлекали мозг и на охложденной пластине разрезали по средней сагиттальной линии под бинокулярной лупой (OlympusSZ51, Япония), снабженной окуляр-микрометром. Далее мозг разрезали фронтально на 0.3 мм каудальнее (bregma 0.02) передней комиссуры, второй фронтальный срез проходил на 1 мм ростральнее мозолистого тела (bregma 2.10), затем выделяли стриатум, моторную кору в соответствии с атласом (рисунок 14) [Paxinos, Franklin, 2001]. Для выделения ЧС от оставшегося блока отрезали кору, медиальную часть блока, отступив на 0.75 мм от саггитальной линии и на 1.3 мм от нижнего края блока (рисунок 14). Затем образцы от обеих половинок мозга соединяли, взвешивали и замораживали в жидком азоте и хранили при -70С до проведения дальнейших экспериментов. бж – боковой желудочек, ВТО – вентральная тегментная область, мт – мозолистое тело, пк – передняя комиссура, СТР – стриатум, ЧСк – компактная часть черной субстанции, ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Бар - 0,45 мм.
Содержание мРНК ДАТ, ВМАТ2, SynIa, SynIb, SytI, CmplI,IIи Rab5a в ЧС, стриатуме и моторной коре определяли методом ПЦР в реальном времени. Из замороженных образцов ЧС, стриатума и моторной коры выделяли тотальную РНК путем гомогенизации в Trizol (Sigma, США), далее гомогенат последовательно инкубировали с 1-бром-3-хлорпропаном (Sigma, США), изопропанолом (Sigma, США). После этого смесь центрифугировали 10 мин при +4С и 12000 g, затем осадок промывали 70% очищенным этиловым спиртом, образцы высушивали и растворяли в воде, не содержащей РНКаз (WaterRNAsefree, ThermoScientific, США). Концентрацию тотальной РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 8000 (ThermoScientific, США). Остатки геномной ДНК удаляли при помощи фермента ДНКазы I (RNAsefree,ThermoScientific, США), после чего ДНКазу инактивировали в этилендиаминтетрауксусной кислоте (EDTA) (RNAsefree, ThermoScientific, США) и инкубировали 10 мин при 65С. РНК переосаждали в LiCl (Sigma, США) ночь при -20С, затем смесь центрифугировали 20 мин при +4С и 12000g и осадок растворяли в воде (WaterRNAsefree, ThermoScientific, США). Далее с помощью кита RevertAid H Minus First Strandc DNA Synthesis Kit (ThermoScientific, США) проводили реакцию обратной транскрипции в 30 мкл раствора, содержащего случайные гексаолигонуклеотиды (0,2 мкг/ мкл), 5х M-MLV буфер, 10 mM четырех типов нуклеотидов dNTP, 20U ингибитора рибонуклеазы RiboLock RI и 200U обратной транскриптазы M-MLV (Thermo Scientific, США). Смесь инкубировали на приборе Applied Biosystems 7500 (США) в течение 60 минут при +42С, реакцию останавливали путем нагревания до +70С в течение 10 минут. ПЦР проводили с использованием интеркалирующего красителя SYBRGreen (Maxima SYBR GreenKit, ThermoScientific, США) на приборе Applied Biosystems 7500 (США). При стандартизации реакции определяли содержание мРНК гипоксантингуанинфосфорибоизилтранферазы (ГФРТ, house-keeping gene). Структура праймеров, используемая в эксперименте, представлена в таблице 2. Для определения уровня мРНК исследуемых генов в образцах проводили нормировку по ГФРТ для каждого образца по следующей формуле: C(t)исслед ген = C(t)исслед ген - C(t)ГФРТ где C(t) – цикл пересечения кривой заданной пороговой линии. Далее проводили сравнение контрольных и опытных образцов по формуле: C(t) = C(t)исслед ген(контроль) - C(t)исслед ген (опыт) После этого определяли количественную разницу в экспрессии между опытными и количественными образцами по формуле: 2-C(t).
Образцы ЧС и стриатума были гомогенизированы в RIPA буфере содержащем 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0.5% дезоксихолата натрия, 0.1% лаурилсульфатом натрия (SDS), 50 мМ Tris, pH8 (Sigma, США) из расчета 50 мкл буфера на 1 мг ткани. Затем смесь центрифугировали 20 мин при +4С и 12000 g и определяли концентрацию общего белка в супернатанте методом BCA [Smith, e tal., 1985], с помощью набора BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, США). После чего образцы денатурировали в 1% -меркаптоэтаноле 5 мин при 95С и смешивали с SLB-буфером содержащим 10% SDS, 50% глицерол, 10% -меркаптоэтанол, 0.5 М Tris-HCl, pH 6.8, 0.004% бромфенолового синего в соотношении 4:1.
Электрофорез проводили в 12%-ном полиакриламидном геле по методу Лэммли [Laemmli, 1970] в камере для вертикального электрофореза Mini-ProteinTetraSystem (BioRad, США). На дорожки наносили одинаковое количество белка (20-40 мкг в зависимости от эксперимента), в качестве маркеров молекулярных масс использовали коммерческий препарат (Fermentas Page Ruler, Германия).
Содержание мРНК белков везикулярного цикла в стриатуме и моторной коре
После пероксидазного моноиммуномечения тирозингоидроксилазы лунки с культурой клеток были исследованы с помощью микроскопа Zeiss Observer Z1 (Zeiss, Германия), оснащенным сканирующим координатным столом Ludi MAC 5000 XY (Zeiss, Германия), камерой AxioCam MRс (Zeiss, Германия) при увеличении объектива 20/NA 0,4 (EC Plan-Neofluar, Zeiss, Германия) и с использованием программного обеспечения AxioVision 4.8. С помощью модуля MosaiX AxioVision (Zeiss, Германия) создавали мозаичное изображение лунки и подсчитывали общее число ТГ-ИР нейронов на лунку с помощью программы Image J.
В культуре клеток подсчитывали количество выживних нейрноов и проводили стереологический анализ длины нейритов ДА-ергических нейронов. Для этого в каждой лунке случайным образом выбирали 100 ТГ-ИР нейронов и определяли длину нейритов по раннее описанной методике [Rnn, et al., 2000].С помощью программы Photoshop СS 5.1 на изображениях с ДА-ергическими нейронами создавали горизонтальные линии (рисунок 17). Расстояние между линиями составляло 20 мкм. После чего подсчитывали количество пересечений отростков - нейритов с горизонтальными линиями и высчитывали длину нейритов (L) по формуле: где I-количество пересечений нейритов с горизонтальными линиями, d- расстояние (20 мкм) между горизонтальными линиями. Рисунок 17 - Схематичное изображение принципа подсчета длины нейритов [Rnn, et al., 2000] Для определения катехоламинов из лунок отбирали культуральную среду и вносили в эппендорфы с HCIО4, конечная концентрация HCIО4 в культуральной среде составляла 0.1 М. Затем в лунки заливали 0.1 М HCIО4, клетки соскребали со дна лунки, после чего образцы замораживали в азоте и хранили при -70С до проведения дальнейших экспериментов.
Пробы культуральной среды и культуры клеток подготавливали методом твердофазной экстракции на оксиде алюминия. К пробам добавляли 15 мг активированного Al2O3 (Sigma, США) и холодный 1,5 М трис-буфер (pH 8,6) после чего встряхивали на шейкере в течение 15 минут в темноте при +4С. Далее центрифугировали 5 минут при +4С и 400 g и удаляли надосадочную жидкость. Осадок два раза промывали 1 мл холодной бидистиллированной воды и каждый раз центрифугируя 5 минут при +4С и 400g, тщательно удаляли надосадочную жидкость. Элюцию катехоламинов проводили добавлением 60 мкл 0.2 Н HClO4.
Концентрацию ДА, L-ДОФА и ДОФУК в пробах культуральной среды и культуры клеток определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД). Разделение осуществляли на обращнно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4х100 мм с диаметром пор 3 мкм (Dr.Majsch GMBH, Германия) при температуре +30С и скорости подвижной фазы 1 мл/мин, поддерживаемой жидкостным хроматографом LC-20ADsp (Shimadzu, Япония). В состав мобильной фазы входили: 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, 0,3 мМ октансульфонат натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрил (все реактивы – Sigma, США), pH 2,5. Электрохимический детектор Decade II (AntecLeyden, Нидерланды) был укомплектован стеклоуглеродным рабочим электродом (+0.85 V) и хлорсеребряным электродом сравнения. Пики катехоламинов и метаболитов идентифицировали по времени их выхода в стандартном растворе. Содержание катехоламинов и метаболитов рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце, с помощью программного обеспечения LabSolutions (Shimadzu, Япония).
Для оценки скорости захвата культуру клеток при 37С промывали раствором искуственной спиномозговой жидкости следующего состава (мМ): NaCl – 126, KCl – 2.5, NaH2PO4 – 1.2, CaCl2 – 2.4, MgCl2 – 1.2, NaHCO3 – 25, D-глюкоза – 11, HEPES – 20, аскорбиновая кислота – 0.13, парглин (ингибитор МАО-А и МАО-Б) – 0.1 (Sigma, США). Затем культуру клеток инкубировали искуственной спиномозговой жидкостью содержащей GBR-12909 в концентрации 10 мкМ и 3Н-ДА с удельной активностью – 33 Ки/ммоль в конечной концентрацмм 32.10-9 в течении 15 минут при 37С (за предоставленный 3Н-ДА благодарим академика Н.Ф. Мясоедова, Институт молекулярной генетики РАН). Захват 3Н-ДА останавливали охлаждением культуры клеток до 0С , затем дважды промывали охлажденным растоворм искуственной спиномозговой жидкости. Далее в лунки с культурой клеток вносили 500 мкл 96% этанола и экстрагировали радиоактивный продут в течении 30 мин при 37С. После чего спирт переносили в стеклянные флаконы и добавляли 10 мл сцинтилляционной жидкости (Liquid scintillator 402, Koch-light LTD, Англия). Определение содержания тритиевой метки в собранных образцах проводились методом жидкостоной сцинтилляционной спектрометрии.
Специфический захват 3Н-ДА определяли как разницу между значениями радиоктивности образцов, полученных без использования GBR-12909 ( общий захват) и с его пременением (неспецифический захват).
Для определения статистической значимости полученных данных использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U-тест) или двухфакторный дисперсионный анализ (2-way ANOVA), с последующим использованием теста Тьюки для множественного сравнения средних, в программе GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad Software, США). Данные представлены как среднее значение ± средняя ошибка среднего значения. Достоверность различий признавалась при p 0,05, при 0,05 p 0,1 расценивалось как тенденция к изменению, при р 0,1 изменения считались недостоверными.
Влияние дегенерации дофаминергических нейронов на экспрессию генов везикулярного цикла в стриатуме и моторной коре
Появление моторных нарушений при БП является результатом не только достижения порогового уровня деградации нигростриатной ДА-ергической системы, но и «истощения» компенсаторных процессов. В качестве основного триггера нарушения моторного поведения в литературе рассматривается достижение порогового уровня дефицита ДА в стриатуме (70-80%), как результирующей синтеза, выделения, обратного захвата и деградации ДА. Поэтому в этом разделе работы предпринята попытка идентифицировать клеточные и молекулярные механизмы путем сравнительного анализа экспрессии генов и содержания белков везикулярного цикла на доклинической стадии и клинической стадии. Нарушение данных процессов может служить триггером появления моторных симптомов, которые можно рассматривать в качестве мишеней для фармакотерапии.
Черная субстанция. Наиболее существенным отличием функционального состояния ЧС на модели клинической стадии от доклинической стадии является значительное снижение экспрессии генов Syt I, Syn Ia, Rab5a (Таблица 4). Эти данные коррелирует с клиническими (патологоанатомическими) исследованиями на нелеченых больных, у которых в ЧС было обнаружено снижение экспрессии генов белков везикулярного цикла (Таблица 4) [Bossers et al., 2008; Simunovic et al., 2009; Dijkstra et al., 2015]. Однако, несмотря на значительное снижение экспрессии генов белков везикулярного цикла, на клинической стадии не было выявлено изменений по сравнению с контролем в содержании таких белков как Syt I, Cmpx I и II, Rab5a (Таблица 5). При этом незначительно снижалось содержание Syn Ia, по сравнению с контролем и досимптомной стадией. Эти результаты хорошо согласуется с данными предыдущей работы, где на модели клинической стадии БП также не было выявлено изменений спонтанного и стимулированного выделения ДА, по сравнению с контролем и досимптомной стадией [Хакимова и др. 2011]. Отсутствие изменений выделения ДА в ЧС может происходить благодаря повышению функциональной активности выживших ДА-ергических нейронов. Действительно, показано, что при пересчете полученных данных на количество сохранившихся нейрон происходит увеличение как спонтанного, так и стимулированного выделения ДА [Хакимова и др. 2011]. Также при пересчете полученных данных на отдельные тела сохранившихся ДА-ергических нейронов оказалось, что содержание белков Syt I, Rab5a, Cmpx I и II увеличивается по сравнению с доклинической стадией, что свидетельствует об активации везикулярного цикла, в конечном итоге, ведущее к увеличению выделения ДА из индивидуальных ДА-ергических нейронов ЧС. Не исключено, что увеличение содержания белков везикулярного цикла связано с нарушением антероградного аксоплазматического транспорта, что приводит к накоплению везикул в телах ДА-ергических нейронов и дефициту в терминалях аксонов.
Стриатум. В отличие от ЧС, в стриатуме на модели ранней клинической стадии нами обнаружены значительные изменения функциональной активности сохранившихся ДА-ергических аксонов по сравнению с нейронами на доклинической стадиии и с контролем. В стриатуме содержание белков везикулярного цикла существенно снижается по сравнению с доклинической стадией, в большей степени снижается содержание Syt I и Rab5a (Таблица 5). Известно, что Syt I является кальциевым сенсором и играет ключевую роль в стимулированном выделении нейротрасмиттера [Fernandez-Chacon et al., 2001; Pang et al., 2006]. Rab5a участвует не только в везикулярном цикле, но и регулирует транспорт нейротрофических лиганд-рецепторных комплексов от клеточной поверхности к ранним эндосомам, которые в дальнейшем транспортируются к телу нейрона ретроградным аксональным транспортом [Grimes et al., 1996; Barker et al., 2002, Heerssen, Segal, 2002; Ye et al., 2003]. Снижение содержание Syt I и Rab5a в стриатуме на модели клинической стадии БП, может свидетельствовать о значительных нарушениях в Ca2+-зависимом экзоцитозе везикул, нарушении клатрин-зависимого эндоцитоза. Этот результат хорошо согласуется с данными предыдущей работы, где в стриатуме на клинической стадии показано снижение как спонтанного, так и стимулированного выделения ДА [Хакимова и др. 2011].
Таким образом, снижение стимулированного выделения ДА в стриатуме на модели клинической стадии можно объяснить снижением уровня белков, участвующих в процессах экзоцитоза и транспорта везикул, поэтому данные белки могут рассматриваться в качестве потенциальных мишеней для фармакотерапии при БП.
Черная субстанция. Следует обратить внимание на то, что экспрессия гена ВМАТ2 на модели клинической стадии сохраняется на таком же уровне, как и на модели доклинической стадии, тогда как экспрессия гена ДАТ снижается (Таблица 4). При этом содержание белка ВМАТ2 на модели клинической стадии не изменяется по сравнению с моделью доклинической стадией, а содержание белка ДАТ увеличивается. При пересчете данных значений на нейрон содержание белка ВМАТ2 и ДАТ на ранней клинической стадии повышается по сравнению с доклинической стадией и в большей степени по сравнению с контролем. Выявленая нами разнонаправленность изменения уровня экспрессии генов и синтеза белков ДАТ и ВМАТ2 является еще одним примером различной регуляции транскрипции и трансляции функционально значимых молекул. Нельзя также исключать, что увеличение содержания ВМАТ2 и ДАТ в телах нейронов на фоне снижения его содержания в аксонах может рассматриваться как проявление нарушения антероградного аксоплазматического транспорта, отмеченного раннее на моделях БП [Hinckelmann et al., 2013; Kozina et al., 2014].
Стриатум. Определенный интерес представляет тот факт, что в стриатуме мышей на модели клинической стадии, по сравнению с доклинической стадией существенно снижено содержание белков ДАТ и ВМАТ2, что также наблюдается у больных БП с помощью ПЭТ и при исследовании патологического материала [Wilson et al., 1996; Okamura et al., 2010; de la FuenteFernndez et al., 2011]. Существенным отличием клинической стадии, от доклинической, является снижение внутриаксонального содержания белка ДАТ. В тоже время, как внутриаксональное содержание ВМАТ2 снижается на клинической стадии, по сравнению с контролем и не изменяется по сравнению с доклинической стадией. При исследовании скорости захвата ДА в везикулы у людей с БП, также отмечено снижение количества молекул ВМАТ2 в мембране везикул [Pifl et al., 2014]. Это является показателем снижения гранулярного депонирования ДА, возможно, в результате нарушения антероградного транспорта из тел нейронов и может рассматриваться как один из главных триггеров, ведущих к дегенерации ДА-ергических нейронов и выступающих в качестве потенциальной мишени для фармакотерапии.