Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. H2S как эндогенный посредник 11
2.1.1. Физико-химические свойства H2S 11
2.1.2. Эндогенные концентрации H2S. Баланс между токсическими и физиологическими эффектами 12
2.1.3. Синтез и катаболизм H2S 15
2.2. Некоторые физиологические эффекты и мишени действия H2S в возбудимых тканях 18
2.3. Роль H2S в регуляции эндокринной системы 22
2.4.GH3 клетки как модель для изучения мишеней действия H2S в эндокринных клетках 26
2.5.Са2+ активируемые К каналы как мишень действия H2S 29
2.6.АТФ-зависимые К каналы (К(АТФ) каналы) как мишень действия H2S 30
2.7.Роль H2S в ноцицепции 32
2.8.Нейроны тройничного ганглия как модель для изучения клеточных механизмов ноцицепции 34
2.9.TRP рецепторы 35
2.9.1. TRPV1 рецепторы и модуляция их активности H2S 36
2.9.2. TRPA1 рецепторы и H2S 40
3. Материалы и методы 44
3.1.Культура клеток 44
3.1.1. Вторичная культура клеток 44
3.1.2. Первичная культура нейронов 45
3.2.Электрофизиологические методы исследования 46
3.2.1. Выделение и регистрация активности тригеминального нерва 46
3.2.2. Регистрация токов и потенциалов в нейронах 47
3.3.Флуоресцентные методы 49
3.4.Статистический анализ 52
4. Результаты собственных исследований 53
4.1.Влияние H2S на возбудимость GH3 клеток гипофиза крысы 53
4.1.1. Эффекты NaHS на мембранный потенциал GH3 клеток 53
4.1.2. Влияние NaHS на амплитуду К(АТФ) токов 58
4.1.3. Влияние NaHS на Са2+ осцилляции в GH3 клетках 60
4.1.4. Влияние NaHS на экзоцитоз секреторных гранул, содержащих гормон роста и пролактин, в GH3 клетках 62
4.1.5. Влияние блокаторов Са2+-активируемых К каналов и К(АТФ) каналов на процессы базального и вызванного экзоцитоза 65
4.2.Влияние NaHS на спайкование тригеминального нерва и возбудимость нейронов тригеминального ганглия 66
4.2.1. Эффекты NaHS на электрическую активность тригеминального нерва 67
4.2.2. Влияние NaHS на мембранный потенциал и выходящие калиевые токи в нейронах тригеминального ганглия 68
4.2.3. Влияние NaHS на TRPV1 токи в тригеминальных нейронах 70
4.2.4. Влияние NaHS на внутриклеточную концентрацию ионов Ca2+ в изолированных тригеминальных нейронах 73
5. Обсуждение результатов 76
5.1. H2S вызывает гиперполяризацию, угнетение Са2+ осцилляций и экзоцитоза секреторных гранул в культуре GH3 клеток гипофиза крысы 77
5.3. H2S модулирует возбудимость ноцицептивных тригеминальных нейронов крысы 83
Выводы 89
Список литературы 90
- Некоторые физиологические эффекты и мишени действия H2S в возбудимых тканях
- TRPA1 рецепторы и H2S
- Влияние NaHS на TRPV1 токи в тригеминальных нейронах
- H2S модулирует возбудимость ноцицептивных тригеминальных нейронов крысы
Некоторые физиологические эффекты и мишени действия H2S в возбудимых тканях
H2S вовлечен в регуляцию многих физиологических процессов, связанных с регуляцией гомеостаза, иммунитета, передачи нервных импульсов в клетках центральной и периферической нервной системы. Основным H2S продуцирующим ферментом в сердечно-сосудистой системе является ЦГЛ, которая экспрессируется в гладкомышечных клетках сосудов [Elsey, 2010].
Электрофизиологические эксперименты показали, что H2S усиливает АТФ-зависимый калиевый ток в гладкомышечных клетках сосудов, вследствие связывания с серосодержащими группами белков каналов. Активация К(АТФ) каналов приводит к выходу ионов К+ из клетки и последующей гиперполяризации мембраны гладкомышечных клеток, при этом понижается концентрация ионов Са в результате ингибирования потенциал-зависимых Са2+ каналов, и, таким образом стенки сосудов расслабляются [Wang, 2004]. В нормальных физиологических состояниях К(АТФ)-каналы активируются при снижении АТФ внутри клетки.
H2S регулирует гемодинамику, воздействуя на барорецепторные рефлексы (рис.2), снижает сократительную способность сердечной мышцы и замедляет частоту сокращений сердца. При гипоксии происходит гибель кардиомиоцитов в желудочках сердца, а H2S повышает жизнеспособность этих клеток за счет активации К(АТФ) каналов. Также было показано, что H2S стимулирует ангиогенез за счет усиленной миграции эндотелиальных клеток [Elsey, 2010].
Впервые синтез H2S с помощью ЦБС был выявлен в мозге крысы в 1996 г, а именно, в гиппокампе, мозжечке, коре и стволе (рис.2). В гиппокампе H2S усиливает токи через НМДА (N-метил-D-аспартат) рецепторы глутамата [Abe, Kimura, 1996]. H2S облегчает индукцию долговременной потенциации в гиппокампе крысы, которая заключается в усилении ответа постсинаптического нейрона после кратковременной высокочастотной стимуляции пресинаптического нейрона. Эффекты H2S на НМДА токи в гиппокампе зависят от возраста животного. У неонатальных крыс H2S снижает, тогда как у молодых крыс стимулирует НМДA вызванные токи в пирамидных нейронах гиппокампа, и эти эффекты не предотвращаются ингибированием аденилатциклазы. Было показано, что H2S снижал токи через НМДA рецепторы, состоящие из рекомбинантных GluN1/2B субъединиц, и усиливал токи через GluN1/2A НМДA рецепторы, что объясняет действие H2S в зависимости от возраста [Yakovlev et al., 2017].
Концентрация ионов Ca2+ в клетке ([Ca2+]i) является критическим фактором для нормальных взаимодействий между нейронами и глией и регуляции синаптической пластичности. Было обнаружено, что H2S способен регулировать Ca2+ сигнализацию во всех типах клеток головного мозга, а именно, нейронах, микроглии и астроцитах [Nagai et al., 2004; Parri, 2001; Tan, 2010] (рис.3). В периферической нервной системе показано стимулирующее влияние H2S на капсаицин-чувствительные сенсорные нервные окончания, стимуляция которых приводит к секреции вещества P и нейрокинина А [Patacchini et al., 2005]. Было показано, что в эффектах H2S принимают участие аденилатциклазная система, внутриклеточный Са2+, продемонстрирована роль H2S в процессах экзоцитоза синаптических везикул, приводящая к увеличению спонтанного и вызванного высвобождения медиатора [Герасимова, 2008; Герасимова, 2013, Gerasimova, 2015].
Генетические нарушения ферментов синтеза H2S или недостаток витаминов В6, В12, фолиевой кислоты приводят к повышению уровня гомоцистеина в клетках, гипергомоцистеинемии, вызывающего нарушения развития нервной системы в онтогенезе, сердечно-сосудистым патологиям, нейродегенеративным заболеваниям [Obeid et al., 2007; Kalani et al., 2013]. В ряде исследований было обнаружено, что соотношение концентраций эндогенных тиолов – H2S и гомоцистеина регулирует нормальное функционирование клеток. Оказалось, что высокие дозы гомоцистеина вызывают оксидативный стресс в организме [Outinen et al., 1999], тогда как H2S в низких дозах наоборот проявляет протекторное действие, заключающееся в снижении оксидативного стресса, дефицита памяти, нейродегенерации, нейровоспаления, цереброваскулярных нарушений [Kimura, 2004; Yonezawa et al., 2007; Yang et al., 2008; Kamat et al., 2013; Yakovleva et al., 2018]. Известно, что H2S обладает протекторными антиоксидантными свойствами. Пониженный синтез H2S обуславливает нарушения функций почек при гипергомоцистеинемии, а введение донора H2S предотвращает эти повреждения [Sen et al., 2010].
Сплошными стрелками показано активирующее, а пунктирными — ингибирующее влияние H2S на ионные каналы, ферменты, процесс клеточного дыхания. АЦ — аденилатциклаза, фермент, продуцирующий циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), который, в свою очередь, активирует протеинкиназу А (ПКА), НМДА — N-метил-D-аспартат [Ситдикова, 2010].
Таким образом, H2S обладает многочисленными по функциям эффектами на организм, в том числе участвует в регуляции метаболизма, редокс-статуса, кардиопротекции, расслабления сосудов, контроля дыхания, нейромодуляции [Beard, 2011], эндогенно связывает активные формы кислорода [Whiteman et al., 2005], подавляет оксидативный стресс, предохраняет эндотелиальные клетки мозга от стресса, вызванного метионином [Wang, 2012].
Нарушение различных метаболических процессов сопровождается снижением концентрации медиатора, что, в свою очередь, приведет к развитию различных неврологических расстройств.
TRPA1 рецепторы и H2S
TRPA1, единственный тип TRPA семейства, впервые клонированный из фетального фибробласта легкого человека, широко экспрессируется у млекопитающих, где он был обнаружен в волосковых клетках, поджелудочной железе, сердце, мозге [Atoyani et al., 2009], мочевом пузыре [Streng et al., 2008], артериях [Earley, 2009], энтерохромаффинных клетках [Nozawa et al., 2009]. Впервые TRPA1 был охарактеризован как рецептор, воспринимающий низкую температуру, вызывающую боль [Story et al., 2003] и позже была предложена его роль в механочувствительности [Kwan et al., 2006]. Большое число исследований показывают, что TRPA1 играют ключевую роль в обнаружении острых и раздражающих соединений, включая такие, которые содержатся в различных пряных продуктах, такие как аллил изотиоцианат (горчичное масло) в хрене [Jordt et al., 2004], аллицин и диаллилдисульфид в чесноке [Bautista et al., 2005], циннамальдегид в корице [Bandell, 2004]. Кроме того, экологические раздражители и промышленные загрязнители являются активаторами TRPA1 [Bang, 2007; Bessac, 2008; Wang, 2010].
TRPA1 рецепторы экспрессируются в периферических сенсорных нейронах [Jordt et al., 2004], включая иннервирующих толстую кишку [Bautista et al., 2013], дыхательные пути, которые сигнализируют о раздражении дыхательной системы [Fajardo et al., 2008; Nassini et al., 2010]. TRPA1 также связан с механочувствительностью, способствуя механической гиперчувствительности афферентов после воспаления [Zygmunt et al., 2014].
TRPA1 экспрессируюшие нейроны также экспрессируют другие типы TRP каналов, в частности TRPV1, и сенсорные нейропептиды - вещество P (SP), нейрокинин A (NKA), кальцитонин ген-связанный пептид (CGRP). Во многих случаях TRPA1 и TRPV1 рецепторы колокализуются в периферических нервных окончаниях. Так, в мочевом пузыре крысы, TRPA1 представлен в немиелинизированных сенсорных нервных волокнах, которые экспрессируют TRPV1 [Streng et al., 2008]. Рецепторы TRPA1 обнаружены также в гангиях дорсальных корешков и тройничного ганглия грызунов [Jordt et al., 2004; Bautista et al., 2005; Patacchini et al., 2005].
Известно, что TRPA1 рецепторы активируются широко используемыми цистеин-модифицирующими алкилирующими агентами, такими как йодацетамид (IA; стандартный реагент в массспектрометрии) и 2-аминоэтил метанэтиосульфонат (MTSEA) - реагент, образующий дисульфидные связи с цистеинами [Fearon et al., 1999; Eggler et al., 2005; Macpherson et al., 2007]. N гидроксил сукцинимид (NHS), лизин модифицирующий агент не активировал TRPA1 [Grabarek et al., 1990].
В ряде экспериментов было показано участие воспалительного медиатора H2S в активации капсаицин-чувствительных нейронов в изолированном мочевом пузыре крысы, механизм которого еще не ясен [Patacchini et al., 2005]. Стренг и другие [Streng et al., 2008] показали, что H2S вызывает активацию TRPA1 человека и мыши, экспрессированных клетках яичника китайского хомячка, предполагая, что TRPA1 является молекулярной мишенью для H2S в мочевом пузыре. Воспаление мочевого пузыря может вызвано активацией TRPA1 [Cox, 1979; McMahon et al., 1987] и потенциальными патогенами (например, Escherichia coli), которые могут образовывать H2S [Hjerling-Leffer, 2007]. H2S, вероятно, способствует возникновению симптомов во время инфекций мочевого тракта [Streng et al., 2008].
В нейронах ганглия задних корешков было показано, что кратковременная аппликация NaHS (1 мM) вызывала достоверное увеличение концентрации внутриклеточного Ca2+ ([Ca2+]i)). Однако, эти нейроны отвечали и на капсаицин, и на горчичное масло - агонисты TRPV1 и TRPA1 каналов, соответственно. NaHS-вызванное увеличение [Ca2+]i было ингибировано удалением внеклеточного Ca2+ и антагонистом TRPA1, но не антагонистом TRPV1 каналов или потенциал-зависимых Ca2+ каналов. Эти данные указывают на то, что H2S стимулирует сенсорные нейроны через активацию TRPA1 каналов. Таким образом, активация TRPA1 каналов может лежать в основе различных физиологических эффектов эндогенного H2S [Miyamoto et al., 2011].
Таким образом, несмотря на интенсивные исследования физиологических эффектов и механизмов действия H2S, полученные данные противоречивы, а клеточные мишени его действия в возбудимых клетках окончательно не определены. В эндокринных клетках поджелудочной железы H2S снижал секрецию инсулина, в гипоталамусе Н2S снижал K+-вызванную секрецию кортикотропин-рилизинг гормона, тогда как в хромафинных клетках H2S усиливал экзоцитоз катехоламинов. В соматотрофах гипофиза было ранее показано активирующее влияние H2S на ВК-каналы, однако, эффекты на мембранный потенциал и экзоцитоз гормонов не исследованы. В нейрональных клетках эффекты H2S также неоднозначны, и зависят от экспрессии мембранных рецепторов, их строения, редокс статуса. Несмотря на предположения об активирующем влиянии H2S на TRPV1 рецепторы, прямые эффекты H2S на TRPV1 токи, зарегистрированные с помощью электрофизиологических методов, отсутствуют. Поэтому в нашей работе мы изучали влияние донора H2S на мембранный потенциал, калиевые токи, болевые TRP рецепторы, Са2+ сигнализацию в двух модельных системах возбудимых клеток: линии клеточной культуры гипофиза крысы (GH3 клетки) и изолированных нейронах тригеминального ганглия.
Влияние NaHS на TRPV1 токи в тригеминальных нейронах
TRPV1 каналы являются одними из ключевых рецепторов, опосредующих активацию тригеминальных нейронов в ответ на различные физиологические стимулы. Анализировали влияние донора H2S на TRPV1 токи, вызываемые локальной аппликацией агониста капсаицина в концентрации 1 мкМ в течение 2 секунд. Ответы регистрировали при потенциале фиксации -70 мВ в конфигурации «на клетке». Для предотвращения десенситизации, агонист добавляли с интервалом в 5 минут.
Аппликация агониста TRPV1 рецепторов капсаицина (1 мкM) вызывала входящие токи в 22 нейронах из 31 с амплитудой 1345.84 ± 330.17 пA (n = 22) (рис.12А,В). Предварительная перфузия тригеминальных нейронов раствором, содержащим NaHS (100 мкM) в течение 5 мин вызывала увеличение TRPV1 токов в 14 клетках от 1578.36 ± 501.52 пA до 2357.31 ± 715.05 пA (n=14, p 0.05) с последующим снижением токов после 10 и 15 минут аппликации NaHS (рис.12А,В). В 8 клетках мы наблюдали снижение капсаицин-вызванных токов от 938.93 ± 211.46 пA до 616.73 ± 159.87 пA (n=8, p 0.05) (рис.12Б,Г).
Активирующее влияние NaHS на TRPV1 токи может опосредоваться восстановлением дисульфидных связей в составе субъединиц канала. Так, было показано, что сульфгидрильный восстанавливающий агент дитиотреитол (ДТТ) усиливает активность TRPV1 при применении в миллимолярных концентрациях во внеклеточном растворе в условиях «на клетке» [Susankova et al., 2006]. Действительно, предварительная аппликация ДТТ предотвращала увеличение амплитуды токов в ответ на аппликацию NaHS. В контроле с ДТТ во внеклеточном растворе амплитуда TRPV1 токов составила 1279.3 ± 396.33 пA. Последующая аппликация NaHS вызывала снижение токов после 5 минуты до 929.6 ± 436.41 (n=5, p 0.05); после 10 минуты – до 430.7 ± 201.52 пA; после 15 минуты - до 442.94 ± 202.98 пA (n=5, p 0.05) (рис.13).
Чтобы исследовать прямой эффект NaHS на TRPV1 рецепторы NaHS (100 мкM) апплицировали локально на клетку через систему быстрой перфузии в течение 2 секунд. Оказалось, что NaHS вызывал входящие токи в тригеминальных нейронах амплитудой 413.29 ± 113.53 пA (n=12) (рис.14), причем эти же нейроны отвечали и на аппликацию капсаицина. Антагонист TRPV1 рецепторов капсазепин (10 мкM) ингибировал токи, вызываемые NaHS и капсаицином, которые восстанавливались после отмывки контрольным раствором (n=5) (рис.14А). Антагонист TRPA1 рецепторов HC-030031 (50 мкM) не влиял на токи, вызываемые NaHS и капсаицином (рис.14Б). Эти данные предполагают, что NaHS напрямую активирует TRPV1 рецепторы и вызывает входящие токи, которые увеличивают возбудимость тригеминальных нейронов.
Представлены ответы, вызванных аппликацией капсаицина (1 мкM, Caps, 2 с) и NaHS (100 мкM, 2 с) в контроле и после ингибирования TRPV1 рецепторов капсазепином (10 мкM) (A). После отмывки контрольным раствором ответы на капсаицин и NaHS восстанавливались (Б, контроль) и сохранялись в условиях ингибирования TRPA1 рецепторов блокатором HC 030031 (50 мкM) Ответы в А и Б регистрировались на одной и той же клетке.
H2S модулирует возбудимость ноцицептивных тригеминальных нейронов крысы
Тригеминальная система непосредственно участвует в проведении сенсорной и ноцицептивной информации, а активность тригеминального нерва лежит в основе инициации боли при мигрени. Поэтому исследование активности менингиальных афферентов и возбудимости тригеминальных нейронов часто используют для изучения молекулярных основ острой и хронической боли, в том числе головной боли и мигрени; исследования структуры и функций P2X, TRPV1 и других рецепторов [Durham, 2003]. В нашей работе использовали электрофизиологические и флуоресцентные методы для изучения влияния NaHS на спайкование тригеминального нерва, мембранный потенциал, выходящие калиевые токи, TRPV1 рецепторы и внутриклеточную концентрацию ионов Са2+.
Донор NaHS в концентрациях 100 и 300 мкМ вызывал увеличение частоты спайкования тригеминального нерва, что предполагает его участие в передаче ноцицептивной информации. Для выявления клеточных механизмов действия NaHS использовали изолированные нейроны тригеминального ганглия. Показано, что, ЦБС экспрессируется в тригеминальных нейронах крысы [Feng et al., 2013], и эта экспрессия повышается при воспалении с последующим увеличением возбудимости путем уменьшения калиевой проводимости [Miao et al., 2014]. В наших экспериментах NaHS в концентрациях 100 и 300 мкМ не вызвал достоверного изменения мембранного потенциала покоя, и только в высоких миллимолярных концентрациях наблюдалась деполяризация мембраны.
Также в используемых концентрациях мы не выявили его влияния на выходящие калиевые токи. По-видимому, деполяризация нейронов и эффекты на калиевую проводимость проявляются при повышении его продукции, например, в условиях воспаления, приводящее к увеличению нейрональной возбудимости. Действительно, было показано, что гипералгезия, вызванная воспалением, опосредуется повышенной регуляцией экспрессии гена ЦБС и что ЦБС-H2S путь повышает возбудимость путем подавления К+ токов. При этом, введение ингибитора ЦБС снижало возбудимость, усиливая К+-токи и ослабляя болевые ответы. Эти данные подтверждают проноцицептивную роль H2S при воспалительных болях [Miao et al., 2014].
TRPV1 и TRPA1 рецепторы широко экспрессируются в полимодальных болевых рецепторах (ноцицепторах) и играют ключевую роль в инициации воспаления и интеграции болевых химических и физических стимулов. Активация этих рецепторов в менингиальных нервных окончаниях вызывает освобождение вазоактивного нейропептида CGRP и вещества Р, вовлеченных в различные формы мигрени и головных болей [Caterina et al., 2000]. Классическим агонистом TRPV1 рецепторов является капсаицин, кратковременная аппликация которого вызывала входящие токи в условиях фиксации потенциала. Было описано, что в нейронах ганглиев дорсальных корешков (DRG) ЦБС колокализован с TRPV1 рецепторами [Xu et al., 2009].
Инкубация тригеминальных нейронов в NaHS вызывала двойной эффект на капсаицин-вызванные токи. В 63% случаях NaHS вызывал увеличение амплитуды токов в течение первых минут с последующей десенситизацией, что можно объяснить восстановлением дисульфидных связей H2S [Abe, Kimura, 1996; Sitdikova et al., 2010]. Действительно сульфгидрильный окислительно-восстановительный агент ДTT в наших экспериментах предотвращал этот эффект NaHS. Ранее было показано, что ДTT усиливает токи как через нативный, так и рекомбинантный TRPV1 каналы крысы, действуя на внеклеточно локализованные сайты [Susankova et al., 2006]. Напротив, окислительные агенты, такие как тимеросал, снижают капсаицин-вызванную активность TRPV1 путем окисления внеклеточных сульфгидрильных остатков. В 36% клеток наблюдалось постоянное снижение TRPV1 опосредованных токов без начальной потенциации, что может быть объяснено быстрой десенситизацией TRPV1 рецепторов. Это предположение поддерживается вариабельностью десенситизации капсаицин индуцированных ответов в различных клеточных фракциях. Действительно, в тригеминальных нейронах было описано существование нескольких пулов TRPV1 рецепторов с быстрой и медленной кинетикой токов и различными скоростями десенситизации [Akopian et al., 2007; Storti et al., 2015; Zacharov et al., 2015], которые определяются липидной средой, связыванием с кавеолином, функциональным состоянием, включающим редокс статус или фосфорилирование [Storti et al., 2015]. Кроме того, кинетика TRPV1 токов зависит от ко-экспресии с TRPA1 каналами, которые, вероятно, участвуют в регуляции внутриклеточного Са2+ или других внутриклеточных посредников, которые влияют на десенситизацию TRPV1 рецепторов [Masuoka et al., 2017].
Более того, локальная кратковременная аппликация NaHS на тригеминальные нейроны подобно капсаицину, вызывала входящие токи, которые блокировались антагонистом TRPV1 рецепторов капсазепином, но были нечувствительны к блокатору TRPA1 рецепторов HC-030031. Эти данные указывают на прямое активирующее действие NaHS на TRPV1 рецепторы. Наши результаты свидетельствуют о том, что H2S является новым эндогенным агонистом TRPV1 рецепторов в соме тригеминальных нейронов.
Флуоресцентные исследования показали, что NaHS вызывает увеличение внутриклеточного уровня Ca2+ в 41% исследованных тригеминальных нейронов, однако, только 59% H2S-чувствительных нейронов также отвечали на капсаицин, что указывает на вариабельность молекулярных мишеней NaHS. Действительно, в некоторых нейронах повышение уровня Са2+ наблюдалось и после ингибирования TRPV1 рецепторов капсазепином. В некоторых капсаицин-нечувствительных нейронах NaHS также вызывал Са2+ ответы, которые блокировались ингибитором TRPA1 рецепторов HC-030031, что указывет на то, что TRPA1 рецепторы также могут являться мишенью действия H2S, что подтверждаются и другими некоторыми исследованиями. Так, в нейронах ганглиев дорсальных корешков аппликация NaHS вызывала заметное увеличение [Ca2+]i, и этот эффект был блокирован антагонистами TRPA1, но не TRPV1 рецепторов [Miyamoto et al. et al., 2011; Andersson et al., 2012]. Кроме того, NaHS вызывал входящие токи путем активации TRPA1 рецепторов, экспрессируемых в CHO клетках [Andersson et al., 2012; Ogava et al., 2012]. Однако следует отметить, что в этих исследованиях были использованы высокие концентрации NaHS (1-5 мM), которые не являются физиологическими и могут активировать TRPA1 рецепторы опосредованно путем образования активных форм кислорода [Andersson et al., 2008]. Действительно, H2S в высоких концентрациях ингибирует цитохром с оксидазу и окислительное фосфорилирование [Beauchamp et al., 1984], что приводит к истощению ATФ и накоплению молочной кислоты, образованию активных форм кислорода, которые активирует TRPA1 [Andersson et al., 2008; Wang et al., 2011]. Поэтому, возможно, что в патофизиологических условиях таких, как воспаление, повышенная экспрессия ЦГЛ или ЦБС и биосинтез H2S приводит к активации TRPA1 рецепторов [Bhatia et al., 2005; Li et al., 2005; Miao, 2014].
Другой вопрос относится к механизму активации TRPA1 рецепторов при действии H2S. Основной механизм активации TRPA1, по-видимому, связан с окислением реактивных цистеиновых остатков, тогда как восстанавливающие агенты вызывали ингибирование TRPA1 [Macpherson et al., 2007]. H2S, как известно, является восстанавливающим агентом, и поэтому не может окислять тиольные группы белков без промежуточных соединений [Greiner et al., 2013]. Недавно было показано, что в водных растворах доноры H2S в высоких концентрациях образуют полисульфиды. Эти полисульфиды, по всей видимости, являются промежуточными видами в тиольном окислении многочисленных белков, которые, как описывалось в предыдущих исследованиях, S-сульфгидрируются при действии H2S [Greiner et al., 2013]. Более того, недавние исследования показали, что полисульфиды образуются и при химическом взаимодействии H2S и NO [Kimura et al., 2013; Hatakeyama et al., 2015; Miyamoto et al. et al., 2017]. Возможно, что эффективной молекулой, активирующей TRPA1, являются полисульфиды. В нашем исследовании использовались низкие концентрации NaHS (100 мкM, эффективная в виде газа - 11 мкM), которые вероятно недостаточны для генерации полисульфидов. В одной из недавних работ было показано, что провоспалительный цитокин IL-1 усиливает H2S вызванное повышение уровня Ca2+, опосредованное TRPA1, за счет образования полисульфидов, что может быть вовлечено в патогенез воспалительного процесса [Ujike et al., 2018].
Таким образом, ЦБС-H2S сигнальный путь играет важную роль генерации и проведении в ноцицептивной информации в тригеминальных системе в физиологических условиях. H2S вызывает активацию менингиальных афферентов и тригеминальных нейронов в основном за счет активации TRPV1 рецепторов и увеличения внутриклеточного уровня Ca2+. В высоких концентрациях H2S способен увеличить возбудимость тригеминальных нейронов путем деполяризации мембраны и снижения выходящих К+ токов, а также активации TRPA1 рецепторов через образование полисульфидов. Эти эффекты могут привести к возникновению нейропатической боли, аллодинии и гипералгезии при воспалении, при котором наблюдается повышенная экспрессия гена ЦБС [Miao et al., 2014, Zhu et al.,2015].