Введение к работе
Актуальность проблем. Исследование мембранного пздеваре-ния, осуществляющего промежуточные и заключительные стадии гидролиза пищевых веществ, продолжает оставаться одним из наиболее актуальных и важных направлений развития современной гастроэнтерологии. Мембранное пищеварение занимает особое положение в системе гидролитических и транспортных процессов с топкой кишке, будучи акцепторным по отнесению к полостному пшеварению и донорным по отношению к всасыванию. Открытие и изучение мембранного пищеварения (обзоры: Уголев, I960, 1961, 1963, 1967, 1972, 1985; Тимофеева, 1977; Иезуитова, 1979; Валенкевич, 1981; Смирнов, Уголев, 198I; Кулак, 1983; Щербаков, 1934; Уголев, Иезуитова, 1985; Мембранный гидролиз и транспорт, 1986; Membrane Digestion. Hew Facts and Concepts , 1989 И др.) позволило приблизиться к пониманию базисных сторон работы пищеварительного аппарата высших животных и человека. Было показано, что мембранное пищеварение обеспечивает высокие скорости переваривания нутриентов в организме, которые невозможно воспроизвести б условиях in vitro , а также эффективное сопряжение пищеварительных и транспортных процессов. Оно осуществляется на внешней поверхности энтероцитов за счет ферментов двоякого происхождения: адсорбированных из полости кишки (преимущественно панкреатических) и собственно кишечных, .синтезированных в энтероците и встроенных в его апикальную мембрану.
В течение последних лет интенсивно изучается структура и функция ферментов мембран щеточной каймы энтероцитов, нефроци-тов и клеток некоторых других органов (обзоры: Kenny, Maroux, 1982; Brush border membrane, 1983; Уголев, 1985; Molecular and cellular baaia of digestion, 1986; Semenza, 1966; Аїрегз, 1987)
Эти исследования широко проводятся представителями различных наук - биохимиками, физиологами, морфологами и, в особенности, патологами. Разработка этой проблемы необходима не только для понимания процессов ассимиляции пищи в нормальных условиях, но и для интерпретации многих распространенных заболеваний. -Важнейшей стороной проводимых исследований является выяснение механизма мембранного пищеварения на молекулярном уровне.
В результате был достигнут значительный прогресс в определении молекулярной структуры кишечных и почечных гидролаз некоторых видов кивогных. В частности, была определена их амфифиль-ная структура (т.е. было показано, что они состоят из гидрофильной и гидрофобной субъединиц), молекулярная масса, число и молекулярная масса отдельных субъединиц, в ряде случаев - аминокислотная последовательность якорного участка, соединяющего ферменты с мембраной щеточкой каймы. В значительно меньшей степени изучена та сторона физиологии мембранного пищеварения, в задачу которой входит выяснение функций мембранных ферментов в целом, а также функций отдельных субъединиц, их взаимодействия и регуляции. Проблемам молекулярной физиологии мембранного пищеварения были посвящены усилия Лаборатории физиологии питания в течение целого ряда лет.
Цель и задачи исследования. Данная работа концентрируется на изучении молекулярной физиологии некоторых типичных гидролаз, осуществляющих мембранное пищеварение у животных различных видов, в том числе - далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице.
До настоящего времени считалось, что гидрофильная часть мембранных гидролаз выполняет каталитическую функцию, а гидрофобная, пронизывающая липопротеиновую мембрану и выходящая в ци-
топлазму, - якорную (обзор: Horen et al., 1985). Однако в работах Лаборатории физиологии питания, а также в работах проф. Х.Хашена, проф. Г.Ю.Хюттера и их группы (Галле, ГДР) были получены факты, свидетельствующие о существовании значительно более сложных взаимоотношений различных субъедшиц в олигомерной молекуле фермента. В настоящей работе эта проблема была подвергнута детальной проверке.
Для выяснения функциональной роли частей сложной молекулы амфипатическчх ферментов в работе были поставлены следующие задачи: I) выделить и очистить в детергенткой (включающей гидрофильную и гидрофобную части) и протеазной (лишенной гидрофоб-ной части) формах некоторые гидролазы щеточной каймы энтероци-тов у различных^видов животных; 2) сопоставить молекулярные и кинетические характеристики, а также регуляторные свойства этих ферментов в детергентной и протеазной формах, а также ферментов, находящихся в составе клеточных структур; 3) установить роль отдельных компонентов фермент-мембранных комплексов, в том числе гидрофобной части, в регуляции активности пищеварительных ферментов с целью проследить стабильность свойств гидрофобной и гидрофильной частей амфипатических ферментов у животных, находящихся на разных уровнях эволюционного развития.
Теоретическая значимость и научная новизна. В работе подвергнуты существенному пересмотру взгляды на функции отдельных частей молекулы собственно кишечных ферментов энтероцитов. Исследования были проведены с использованием высокоочищенных ферментных препаратов. Полученные данные сопоставлялись со свойствами ферментов, находящихся в составе клеточных структур. Чтобы иметь возможность проследить стабильность свойств различных частей амфипатических ферментов, впервые было проведено комплексное сравнительно-физиологическое исследование ряда собственно
кишечных гидролаз у животных с различным типом питания, а также находящихся на разных уровнях эволюционного развития. При анализе полученных в работе данных оказалось, уто гидрофильная часть фермента имеет не только каталитические центры, но и ре-гуляторные, не одинаковые у разных видов животных. Принципиально новым является обнаружение полифункциональной природы гидрофобной части. При сопоставлении свойств детергентной и протеазной форм ферментов тонкой кишки крыс, кроликов, собак, коров и кишечника форели впервые удалось показать помимо известной якорной, другие важные функции гидрофобной части. Было обнаружено, что гидрофобная часть влияет на кинетические характеристики ферментов, модифицируя их свойства в том же направлении, что и мембрана энтероцига. Эти данные позволили заключить, что гидрофобная часть участвует в поддержании оптимальной конформа-ции фермента и стабилизации его структуры. Важно подчеркнуть, что во многих случаях прослеживается, связь видовых различий во влиянии гидрофобного участка на кинетические характеристики ферментов с адаптивными процессами.
При исследовании влияния целого ряда модификаторов на активность детергентной и протеазной форм ферментов различных видов животных было показано, что гидрофобная часть выполняет ре-гуляторные функции. Установлено, что некоторые регуляторные свойства, обусловленные ее присутствием, являются видоспецифи-ческими, другие, напротив, характерны для всех изученных ферментов. Особенности регуляторних свойств мембранных ферментов в значительной мере определяют функциональную организацию и саморегуляцию естественного полисубстратного пищеварения у различных животных.
Впервые сопоставлялись регуляторные свойства гидролаз тон-
кой и толстой кишки в онтогенезе у ряда животных с разным типом питания. Обнаружены особенности регуляции жтивности ферментов в толстой кишке.
Данные об неидентичности регуляторних свойств мембранных ферментов вместе о предшествующими наблюдениями, полученными в Лаборатории физиологии питания, являются серьезным основанием для заключения о том, что регуляция на уровне активности -один из наиболее фундаментальных механизмов приспособления. По-видимому, ферменты разных видов животных могут различаться как по регуляторным свойствам, так и по свойствам гидрофобного участка. Такие якорные и регуляторные "изотипьі" также следует рассматривать как один из способов приспособления к изменению условий функционирования.
Полученные данные позволяют заключить,- что амфипатический фермент, включенный в мембрану энтероцита, имеет три участка, подвергающихся регуляторным воздействиям: I) гидрофильную головку фермента, 2) внутримембранный гидрофобный пептид, 3) участок гидрофобной части, выступающий на цитоплазматическую сторону апикальной мембраны.
Практическое значение. Для понимания закономерностей ассимиляции пищи у человека в норме и при различных формах патологии важное значение имеет углубленный анализ локализации регуляторних центров ферментных систем апикальной мембраны энте-роцитов, так как определение регуляторних свойств пищеварительных ферментов в ряде случаев позволяет проводить более раннюю диагностику некоторых форм патологии. В частности, в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф.Владимирского используется метод ранней диагностики энтерита и энтероколита по изменению регуляторних характеристик фер-
ментов, осуществляющих мембранное пищеварение, разработанный на основании исследований, проведенных в Лаборатории физиологии питания.
За работу "Вариабельность интегральных мембранных ферментов" была присуждена премия Университета им.Мартина Лютера (ГДР), а данные используются в лекционных курсах этого Университета.
Полученные в экспериментальном исследовании результаты использованы при разработке метода профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.
Полученные в работе данные использованы при написании глав в ряде монографий: А.М.Уголев: "Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Элементы современного функционализма" (Л.: Наука, 1985); "Мембранный гидролиз и транспорт. Новые данные и гипотезы" (Л.: Наука, 1986); "Membrane Digestion. New Pacts end Concepts" (M.: пік, 1989); "Адаптационно-компенсаторные процессы на примере мембранного гидролиза и транспорта" (Л.: Наука, в печати).
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1-ом билатеральном советско-чехословацком симпозиуме "Пищеварительные ферменты" (Ужгород, 1976), Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты мембранного пищеварения" (Рига, 1978); Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Астрахань, 1979; Севастополь, 1982); ХП конгрессе биохимического общества ГДР (Галле, 1979); Всесоюзных совещаниях, посвященных памяти академика Л.А.Орбели (Ленинград, 1982, 1986); симпозиуме "Кишечное пищеварение" (Лейпциг, 1985); ХІУ Всесоюзной конференции по физиологии пищеварения и всасывания (Терно-поль, 1986), семинарах Института питания АН ГДР (Потсдам, 1981)" и Института клинической биохимии Университета им.М.Лютера (Галле, ГДР, 1984, 1987); заседании Отдела физиологии висцеральных
систем Института физиологии им.И.П.Павлова АН СССР (Л., 1986); 7-й билатеральной (Бельгия - ГДР) медицинскоА неделе "Проблемы в гастроэнтерологии" (Брюссель, 1988).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав с описанием результатов экспериментов, общего заключения, выводов, указателя литературы, рисунков (47) и таблиц (30). По теме диссертации опубликовано 39 работ, из них 5 - главы в монографиях.