Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Коркош Вячеслав Сергеевич

Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами
<
Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Коркош Вячеслав Сергеевич. Молекулярное моделирование потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот и их взаимодействия с лигандами: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.03.01 / Коркош Вячеслав Сергеевич;[Место защиты: Институт эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова Российской академии наук].- Санкт-Петербург, 2016

Содержание к диссертации

Введение

1.1. Ионные каналы 9

1.1.1. Общие сведения 9

1.1.2. Потенциал-управляемые ионные каналы 11

1.1.3. Лиганд-управляемые ионные каналы 12

1.1.4. Каналы, активируемые растяжением и теплом 13

1.2. Молекулярная структура ионных каналов как основа классификации 14

1.2.2. Потенциал-управляемые натриевые каналы 19

1.3. Фармакология ионных каналов 22

1.3.1. Фармакология потенциал-управляемых Na-каналов 22

1.3.2. Конотоксины 35

1.3.3. -конотоксины и Na-каналы 40

Глава 2. Методы 42

2.1. Методы исследования ионных каналов 42

2.1.1. Экспериментальные методы 42

2.1.2. Рентгеноструктурный анализ

2.1.4. Молекулярная динамика 48

2.1.5. Метод Монте-Карло 50

2.2. Параметры и методы расчётов, использованные в работе 51

2.2.1. Расчёт энергетически оптимальных конформеров методами молекулярной

механики 51

2.2.2. Гомологическое моделирование и системы ограничителей 52

2.2.3. Анализ лиганд-рецепторного взаимодействия 54

2.3. Программное обеспечение 56

2.3.1. ZMM 56

2.3.2. Прочие 57

Глава 3. Результаты и их обсуждение 58

3.1. Проблемы гомологического моделирования 58

3.1.1. Выбор выравнивания порообразующих спиралей Р-loop каналов 59

3.1.2. Анализ стабилизаторов в структурах каналов 62

3.1.3. Выбор выравнивания S5 и S6 спиралей в гомологических моделях 68

3.1.4. Заключение 71

3.2. Стерические и электростатические факторы блокады ионных каналов 71

3.2.1. Изучение возможных способов связывания лиганда 74

3.2.2. Распределение ионов в области селективного фильтра 77

3.2.3. Влияние Pl1 на энергию связи ионов 79

3.2.4. Заключение 81

3.3. Блокада натриевых каналов ц-конотоксинами 82

3.3.2. Связывание GIIIA 92

3.3.3. Связывание PIIIA 99

3.3.4. Связывание KIIIA 104

3.3.5. Механизм неполного блока ПО

Общее заключение 122

Выводы 124

Список литературы 125

Лиганд-управляемые ионные каналы

Другой класс ионных каналов реагирует на химические сигналы (лиганды), но не реагирует на изменения в мембранном потенциале (Purves, 2012). Наиболее важным из этих лиганд-управляемых ионных каналов в нервной системе является класс каналов, активируемых связыванием нейромедиаторов (Sobolevsky, Rosconi et al., 2009, Lee, Lu et al., 2014). В то время как потенциал-управляемые ионные каналы обычно пропускают только один вид ионов, каналы, активируемые внеклеточными лигандами, обычно менее избирательны, позволяя двум и более типам ионов проходить через пору канала (Green, Lambert et al., 1996). Другие лиганд-управляемые каналы чувствительны к химическим сигналам, возникающим в цитоплазме нейронов и могут быть избирательны к конкретным ионам, таким как калий или хлор, или же могут быть проницаемы для всех физиологических катионов. Примерами каналов, отвечающих на внутриклеточные воздействия являются кальций-активируемые калиевые каналы, катионные каналы, управляемые циклическими нуклеотидами и кислотно-чувствительные ионные каналы (Bassler, Ngo-Anh et al., 2001, Craven and Zagotta, 2006). Основная функция таких каналов - это преобразование внутриклеточных химических сигналов в электрические сигналы. Классическим примером являются каналы, управляемые циклическими нуклеотидами в светочувствительных клетках сетчатки (Becirovic, Nguyen et al., 2014).

Хотя многие из лиганд-управляемых ионных каналов находятся во внешней клеточной мембране, некоторые находятся в мембранах внутриклеточных органелл, таких как митохондрии или эндоплазматический ретикулум. Некоторые из этих внутриклеточных каналов выборочно проницаемы для кальция и регулируют выход кальция из цистерн эндоплазматического ретикулума в цитоплазму, где этот вторичный передатчик может в свою очередь запускать набор клеточных ответов (Pinto, Kihara et al., 2015).

Существуют также классы ионных каналов, которые отвечают на изменение температуры или на деформацию мембраны. Температурно-чувствительные ионные каналы, такие как некоторые члены семейства каналов TRP (Hellmich and Gaudet, 2014, Yue, Xie et al., 2015), вносят вклад в чувствительность к боли и температурам, а также участвуют в воспалительных процессах. Эти каналы зачастую специализируются на определённых температурах, а некоторые активируются при охлаждении. Механо-чувствительные ионные каналы реагируют на механические изменения в плазматической мембране и лежат в основе рецепторов растяжения и нейромышечных рефлексов растяжения (Delmas and Coste, 2013). Одна из специфических форм таких каналов играет ключевую роль в механизме восприятия звука (Delmas and Coste, 2013).

Подытоживая, стоит отметить, что огромное разнообразие ионных каналов позволяет нейронам генерировать электрические сигналы в ответ на изменения в мембранном потенциале, синаптическую передачу и внутриклеточные вторичные передатчики. Таким образом, ионные каналы играют ключевую роль в функционировании нервной системы в целом.

До последнего времени большая часть информации о структуре каналов была получена не напрямую, а посредством изучения свойств этих белков. Существующие классификации каналов основаны именно на таких признаках. Один из подходов к классификации основан на том, чтобы объединять ионные каналы в зависимости от способа регуляции их действия. Именно так систематизированы ионные каналы в предыдущи х разделах. Другой вариант заключается в разделении ионных каналов в соответствии с основным проводимым ионом, однако оба варианта имеют очевидные недостатки.

Например, nAChRs (Itier and Bertrand, 2001) проводит ионы натрия, как и потенциал-управляемые натриевые каналы. Однако он в корне отличается от них по механизму активации, а также по аминокислотной последовательности. Другой пример, который иллюстрирует необходимость создания новой системы классификации, состоит в том, что некоторые каналы, управляемые циклическими нуклеотидами (Kaupp and Seifert, 2002), настолько гомологичны по последовательности потенциал-управляемым каналам, что могут быть эволюционно ближе к ним, чем к лиганд-управляемым каналам. Ещё одним примером служит то, что глутаматные рецеторы (Traynelis, Wollmuth et al., 2010), которые часто относят к семейству лиганд-управляемых ионных каналов, не имеют никакого сходства последовательностей и, следовательно, вероятно, не связаны эволюционно с другими каналами этой группы.

Таким образом, хотя ионные каналы выполняют одну главную функцию, они обладают различным строением и эволюционным происхождением, поэтому имеет смысл выделять семейства каналов, гомологичных друг к другу, то есть имеющих общее эволюционное происхождение и схожие трёхмерные структуры.

Суперсемейство так называемых “P-loop” каналов включает потенциал-управляемые калиевые, натриевые, кальциевые каналы, каналы, активируемые циклическими нуклеотидами, каналы ионотропных рецепторов глутамата, и TRPV каналы (Zhorov and Tikhonov, 2004, Yue, Xie et al., 2015). Несмотря на огромное разнообразие свойств, функций и механизмов активации, все эти каналы имеют главную отличительную особенность - домен, образующий ионную пору в мембране, который формируется четырьмя субъединицами (или псевдосубъединицами в случае эукариотических натриевых и кальциевых каналов). От каждой субъединицы в этом домене присутствует две трансмембранных -спирали (S5 и S6 у потенциал-управляемых каналов), соединенных так называемой Р-петлей (P-loop), которая включает аминокислоты, образующие селективный фильтр (рисунок 1). Наличие этой петли и послужило основанием для классификации – все разнородное семейство называют p-loop каналами (Zhorov and Tikhonov, 2004). Именно в петле, которая формирует самую узкую часть канала расположены остатки, образующие так называемый селективный фильтр – структуру, обеспечивающую выборочное пропускание конкретных ионов. Как и следовало ожидать, аминокислотный состав селективных фильтров различен для каналов, которые пропускают разные ионы.

Фармакология потенциал-управляемых Na-каналов

Метод классической молекулярной динамики (метод МД) — это метод, в котором временная эволюция системы взаимодействующих атомов или частиц отслеживается интегрированием их уравнений движения (Rigden, 2009). Метод молекулярной динамики является одним из наиболее важных инструментов теоретического изучения структуры и динамики биологических макромолекул, жидкостей, газов и других молекулярных систем. Изначально разработанный в теоретической физике, метод молекулярной динамики получил большое распространение в науке о веществе и, начиная с 1970-х годов, в биохимии и биофизике. Метод молекулярной динамики играет важную роль в определении структуры белка и уточнении его свойств. Взаимодействие между объектами может быть описано силовым полем (классическая молекулярная динамика), квантово-химической моделью или смешанной теорией, содержащей элементы двух предыдущих.

В основе метода молекулярной динамики лежит расчёт классических траекторий движения макромолекулы в фазовом пространстве координат и импульсов её атомов. Молекулярно-динамические расчёты позволяют получить информацию о флуктуациях и конформационных изменениях белков, нуклеиновых кислот и других молекул. В настоящее время метод молекулярной динамики повсеместно используется для исследования структурных, динамических и термодинамических характеристик биологических молекул и их комплексов. К задачам, решаемым методом молекулярной динамики, относится изучение стабильности белков, исследование конформационных превращений систем, сворачивания белков, докинга лигандов, изучение процессов ионного транспорта. Важную роль метод молекулярной динамики играет и при установке конечной структуры молекул и комплексов, определённой методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа, а также в фармакологии при разработке новых лекарственных препаратов.

Наборы конфигураций, получаемые в ходе расчетов методом молекулярной динамики, распределены в соответствии с некоторой статистической функцией распределения, например, отвечающей микроканоническому распределению (Микроканоническое распределение Гиббса — распределение вероятностей различных состояний замкнутой макроскопической системы, т. е. системы, не взаимодействующей с окружающими телами и имеющей постоянную энергию).

Методы молекулярной динамики играют одну из ключевых ролей в развитии теоретической биохимии. Исследования методами МД позволили получить огромное количество моделей белков, как ионных каналов, так и прочих. Однако и этот метод связан с определёнными ограничениями, что не позволяет использовать его для любых задач. Во многом это связано с тем, что расчёт требует слишком большого времени и компьютерных мощностей (Rigden, 2009).

Наряду с методом молекулярной динамики используется ещё одна группа квазидинамических методов, объединённых под общим названием «метод Монте-Карло». Метод Монте-Карло отличается от метода молекулярной динамики тем, что каждая следующая конформация молекулы определяется не путём решения уравнений Ньютона, а как результат случайного процесса. Суть этого подхода состоит в сочетании случайных бросков конформации с последующим градиентным спуском в ближайший энергетический минимум. При этом полная конформационная энергия системы (Ек) представляется в виде суммы компонент:

На первом этапе проводится минимизация энергии стартовой конформации (Е0). Затем одна из обобщённых координат системы изменяется случайным образом, и проводится новая минимизация (Е1). Новая конформация принимается в траекторию, если её энергия меньше предыдущей Е1 Е0. В противном случае, вероятность принятия новой конформации равна Больцмановскому фактору от разности энергий сравниваемых конформаций E0 и E1. Если новая конформация принята, следующий шаг делается уже из неё. Температура обычно принимается 600 или 1000К. Таким образом, за счёт случайного изменения конформации система может перейти в новый энергетический минимум. Кроме того, возможность принятия конформера с повышением энергии обеспечивает более широкое исследование всего конформационного пространства. При МСМ поиске все низкоэнергетические конформации накапливаются для последующего анализа. Расчет прекращается после того, как определенное число минимизаций не приводит к понижению энергии системы (Тихонов, 2004).

Таким образом, в настоящее время только комплексное исследование способно значительно углубить и развить существующие представления о строении и функционировании ионных каналов. Сочетание экспериментальных и теоретических подходов представляется особенно продуктивным. Простое накопление опытных данных без теоретического анализа в рамках молекулярных или кинетических моделей не сулит существенного прогресса. В то же время моделирование, не являющееся обобщением всего набора доступных данных, остаётся ограниченным и не способствует дальнейшему прогрессу в экспериментальных исследованиях. Если же экспериментальные и теоретические подходы используются параллельно, в рамках единого проекта, их взаимодействие происходит непрерывно, и модельно-теоретическая работа становится непосредственным продолжением классических экспериментов, а подчас и исходным пунктом для планирования новых экспериментов и подходов.

Во всех расчётах использовалось приближение атом-атомных потенциалов, при котором квантовые эффекты игнорировались. При этом подходе валентная структура системы принимается неизменной, то есть такие процессы, как протонирование/депротонирование, переходы между энантиомерами, разрыв и образование ковалентных связей не могут быть смоделированы. Однако для обратимого связывания лигандов, что и служило главной расчётной задачей, приближение атом-атомных потенциалов является приемлемым компромиссом между точностью и скоростью.

Молекулярная динамика

Точное число ионов натрия, которые могут одновременно находиться в поре канала, неизвестно. Поэтому для поиска оптимальных вариантов распределения ионов в канале было решено провести поэтапное изучение распределения в случае с разным количеством ионов в системе. В первом приближении в систему был добавлен только один ион. Для оценки его вероятного местоположения было создано 40 стартовых позиций иона равномерно по всей оси канала в области селективного фильтра и проведена МК-минимизации его положения. Если посмотреть на полученное распределение возможных положений иона вдоль оси канала, то видно, что наблюдается одна предпочтительная позиция для иона – в области глутаматов селективного фильтра (рисунок 26). Эта позиция хорошо соответствует данным о карте электронной плотности в селективном фильтре (Bagneris, DeCaen et al., 2014).

Зная расположение одного иона в канале, можно усложнить задачу. Добавим второй ион в систему, распределив его стартовые положения так же, как и для одного иона, вдоль оси канала в области селективности фильтра. При этом первый ион находится в системе в оптимальном положении. Но при этом мы минимизировали положение не только «нового» иона, но и первого, чтобы учесть ион-ионные взаимодействия, которые несомненно играют важную роль в распределении ионов в канале.

Расчёты показали, что первый ион по-прежнему занимает свою позицию возле EP50 (будем называть такую позицию иона сайтом I), в то время как второй ион находится глубже в канале (рисунок 26), рядом с входом в центральную полость (назовём это сайт II). Опять же, существование такого сайта хорошо согласуется с данными по электронной плотности ионов в рентгеновской структуре. На следующем этапе был добавлен третий ион и расчеты были повторены, как описано выше (рисунок 26). Увеличение ион-ионного отталкивания привело к сглаживанию пиков оптимальных позиций I и II и к появлению третьего населенного сайта с внеклеточной стороны селективного фильтра (III сайта). При добавлении еще одного, четвёртого иона, ситуация существенно не изменилась, за исключением появления пика распределения в глубине центральной полости и увеличение популяции на I и III сайтах. Однако ионы, находящиеся вдалеке от селективного фильтра, нас не интересуют, поскольку лиганд воздействует на них слишком слабо.

Таким образом, расчёты показали, что распределения ионов в селективном фильтре существенно не различаются для систем, содержащих три и четыре иона, достаточно остановиться на трёх ионах для анализа действия лиганда. Рисунок 26. Распределение ионов в канале NavMs. Сверху: распределение ионов вдоль оси канала при наличии одного, двух и трёх ионов в канале. Увеличение количества ионов в модели приводит к незначительному расширению пиков и появлению дополнительных пиков вне канала (на дальних участках оси). Снизу: усреднённая энергия ионов в системе в отсутствии (красным) и при наличии (чёрным) лиганда. Зелёным показана разность энергий.

Для того, чтобы оценить вклад электростатического воздействия, оказываемого лигандом на ионы, необходимо рассмотреть две различные системы: в присутствии лиганда и без него. Энергетика для каждой конформации была пересчитана при наличии в системе лиганда PL1. В качестве модели посадки лиганда использовалась полученная ранее модель с горизонтальной посадкой, оптимизированная для получения наилучшей моды связывания с каналом. На рисунке 26 показаны графики распределения средней энергии ионов для различных положений вдоль оси канала в отсутствии лиганда, в присутствии лиганда и разность между энергиями, что позволяет оценить вклад Pl1 в энергетику ионов в разных позициях. Для ионов, расположенных вблизи кольца Ep5, электростатический эффект присутствия лиганда был незначителен. Но для ионов в сайте II (около полости) расстояние до центра аминогруппы Pl1 составляла порядка 3 – 4 . Соответственно, электростатическое отталкивание увеличивается до 1,3 – 1,5 ккал / моль.

Абсолютное значение этого отталкивания зависит от диэлектрической функции и ее параметров. Поэтому необходимо сравнить это отталкивание с другими электростатическими взаимодействиями. В таблице 2 показана энергия взаимодействия ионов с различными остатками канала в модели. Основной вклад в удержание ионов в канале вносят Тp48, Qp45 и Ep50. Из представленных данных видно, что увеличение электростатического отталкивания, путём включения PL1 в модель, может значительно изменить общую энергию иона в положении II. В целом суммарная энергия электростатического взаимодействия изменяется от -4,8 до -3,4 (изменение энергии на 31%).

Следует отметить, что результаты находятся в соответствии с многочисленными наблюдениями. Например, было показано, что наличие ионов К+ внутри и вне клетки приводит к снижению блокады тетраэтиламмонием (Spassova and Lu, 1999, Thompson and Begenisich, 2003). Стоит также отметить, что эффект ионов четвертичного аммония отличается для разных калиевых каналов (например, Kir, Shaker и KcsA), что может быть объяснено различным сродством сайтов в каналах к ионам калия, что приводит к различиям в заселённости сайтов в течение цикла проводимости (Kutluay, Roux et al., 2005). Позднее было показано, что связывание тетрабутиламмония в канале KcsA зависит от заселённости селективного фильтра (1/3 или 2/4 сайтов) ионами калия (Faraldo-Gomez, Kutluay et al., 2007). Полученные же данные по NavMs и Pl1 предлагают аналогичное объяснение антагонизма между ЛА и ионами натрия.

Подытоживая, проведённое исследование методами молекулярного моделирования позволило продемонстрировать, что связывание лиганда PL1 в канале NavMs может повлиять на заселённость селективного фильтра ионами не только стерически (как предлагается авторами работы (Bagneris, DeCaen et al., 2014)), но также электростатически (когда ни одна из частей лиганда не входит непосредственно в селективный фильтр).

Это не означает, что модель (Bagneris, DeCaen et al., 2014) является ошибочной. Как видно из приведённых рассуждений, для конкретного препарата и конкретного канала стерическое смещение действительно возможно. Тем не менее, даже в данном случае мы видим, что возможно предложить альтернативное объяснение экспериментальным данным. Поэтому вряд ли стоит предполагать, что стерический механизм воздействия лиганда является универсальным для молекул локальных анестетиков. В частности, подобный механизм не может быть реализован для молекул местных анестетиков в эукариотических натриевых каналах, потому что в этих молекулах обычно отсутствуют длинные участки, идущие от аминогруппы. Поэтому подобные лиганды просто слишком малы для проникновения в селективный фильтр и для них возможен только электростатический механизм воздействия. Как видно из примера Pl1 и NavMs, электростатический вклад лиганда может быть достаточно значительным, по сравнению с другими электростатическими взаимодействиями в канале.

Полученные результаты хорошо согласуются с данными, ранее полученными для гомологических моделей эукариотических натриевых каналов. Однако точность гомологических моделей всегда ограничена и выводы, сделанные из подобных исследований, всегда носят более или менее гипотетический характер. В данном случае использовалась реальная структура атомарного разрешения, в которой существуют чёткие ограничения, накладываемые на положение лиганда, и, что особенно важно, на положение его аминогруппы, которая играет ключевую роль в электростатическом отталкивании. Именно использование подобных экспериментальных данных позволяет получать результаты, которые более надежны, нежели чисто гомологическая модель.

Выбор выравнивания S5 и S6 спиралей в гомологических моделях

На следующем этапе был проведен анализ серии мутантов, для которых имеются данные о неполном блоке (McArthur, Ostroumov et al., 2011). Для этого исследования был выбран метод случайной генерации, описанный выше, поскольку он является менее затратным с точки зрения времени расчетов. Аналогичные непрерывные ионные распределения были получены для мутантов KIIIA и PIIIA, которые лишь частично блокируют канал. И напротив, для GIIIA, что данные мутации не приводят к мутантов (K9A, K11A, K16A, R19A) и для R20A мутанта PIIIA (McArthur, Ostroumov et al., 2011), распределения ионов были аналогичны случаю с GIIIA, то есть два региона с ионами разделены зоной, где ионы отталкиваются от токсина (рис 51). Полученные результаты согласуются с экспериментальными данными, которые показываютчастичному блоку.

Распределение ионов в канале при наличии различных мутантов -конотоксинов. Жёлтым показаны возможные положения ионов во внешнем вестибюле канала.

Для анализа полученных результатов, был составлен список контактов между каналом и токсином для оригинального токсина и его мутантов (таблица 7). Было обнаружено, что непрерывные распределения ионов в моделях наблюдаются, тогда, когда по крайней мере один из наружных карбоксилатов не участвует во взаимодействии с основными остатками токсина. Таким образом, KIIIA, который содержит только 3 основных остатка, не в состоянии полностью блокировать ток через канал. GIIIA и PIIIA, которые полностью блокируют ток, специфически взаимодействуют со всеми четырьмя внешними карбоксилатами. Модели, включающие в себя мутанты токсинов, где любой из наружных карбоксилатов не связан специфическими взаимодействиями с токсином, приводят к частичному блоку. Если внешний карбоксилат может образовывать солевые мостики с двумя или более основными остатками токсина, мутация одного основного остатка не освобождает карбоксилат, который остаётся электронейтральным и, следовательно, непривлекательным для ионов натрия. В таких случаях по-прежнему наблюдается полный блок. Например, аланиновая замена R19 в GIIIA не приводит к появлению остаточного тока (McArthur, Ostroumov et al., 2011), потому что K16 и K11 могут взаимодействовать с D1532, который взаимодействует с R19 в природном GIIIA.

Таким образом, можно предположить, что решающую роль в механизме ионного тока через канал играют внешние карбоксилаты. Эти остатки, вероятно, служат в качестве промежуточных сайтов связывания для ионов, движущихся из внеклеточного пространства к селективному фильтру (рисунок 52). Если по крайней мере один из наружных карбоксилатов свободен, то ток ионов через канал возможен, хотя и снижается в зависимости от количества свободных сайтов. Эта модель согласуется с экспериментальными данными (McArthur, Ostroumov et al., 2011, McArthur, Singh et al., 2011) и с предыдущими моделями (Tikhonov and Zhorov, 2007).

Схематическая модель механизма блокады ионного тока через канал. Красным показаны внешние карбоксилаты и отрицательно заряженный остаток в селективном фильтре. Жёлтым обозначены ионы, стрелочками показано их движение через канал. Оранжевым изображены конотоксины, голубым – остаток в селективном фильтре и тетродотоксин. Предложенная схема позволяет сделать обоснованные предположения о молекулярном механизме этого эффекта. В отличие от TTX и ему подобных малогабаритных лигандов, -конотоксины не проникают в узкую часть поры и, таким образом, не блокируют её стерически. Согласно модели, конотоксины блокируют ток путём электростатического взаимодействия и нейтрализации внешних карбоксилатов. Если все четыре внешних карбоксилата участвуют во взаимодействии с токсином, то канал теряет свою способность проводить ионы, что приводит к полному блоку. Если некоторые из внешних карбоксилатов остаются свободными, токсин только частично перекрывает ток. Эта предложенная схема (рисунок 52), согласуется с данными, согласно которым мутации внешних карбоксилатов уменьшают проводимость канала. Хотя основным фактором, влияющим на наличие или отсутствие остаточных токов, согласно модели, являются электростатические взаимодействия, величина остаточного тока, очевидно, также зависит и от стерических эффектов.

На заключительном этапе тестирования разработанной модели неполного блока был проведен ряд расчетов для серии мутантов R13 в GIIIA. R13 особенно интересен тем, что этот остаток непосредственно проникает в пору, взаимодействия с каналом вплоть до селективного фильтра. Размер боковой цепи остатка в этом положении в значительной степени определяет количество ионов, которые вытесняются из кольца внешних карбоксилат, что согласуется с данными (Hui, Lipkind et al., 2002). Замены R13 в GIIIA систематически изучены в работе (Hui, Lipkind et al., 2002). Было показано, что величина остаточного тока зависит от размера и заряда/полярности замены. Чтобы воспроизвести эти результаты, были получены мутации R13 на K, Q, W, Q, N, А, Е и D, и подсчитаны распределения ионов, как описано выше. Результаты представлены на рисунке 53.

Ионные распределения для всех мутантов непрерывны, что говорит в пользу (в соответствии с описанными выше результатами) наличия некоторого остаточного тока. Чтобы получить количественное соотношение с экспериментальными данными (Hui, Lipkind et al., 2002) был построен график количества ионов на оси координат z = 8 (эта точка соответствует разрыву для случая с оригинальным токсином) против остаточного тока (рисунок 53). Результаты расчетов показывают хорошую корреляцию с экспериментом (R = 0,96, р = 3,4 10-5). Таким образом, предложенная модель воспроизводит не только качественный эффект присутствия или отсутствия остаточного тока, но даже величину этих токов.

График распределения ионов в канале при наличии различных мутантов -конотоксинов. Сверху: графики распределения ионов вдоль оси канала для разных мутантов -конотоксинов; снизу: корреляция между током ионов через канал и количеством ионов в области селективного фильтра в моделях. В данной работе методами компьютерного молекулярного моделирования было проведено исследование, целью которого было получение структурного объяснения механизмов взаимодействия -конотоксинов с потенциал-управляемым натриевым ионным каналом эукариот Nav1.4. Основным результатом является разработка модели молекулярного механизма неполного блока.

На данный момент известно большое количество блокаторов потенциал-управляемых натриевых каналов эукариот. Из всего объема медицинской фармакологии порядка 10% соединений имеют мишенями именно ионные каналы. Это анестетики, анальгетики, антиаритмики и множество других классов фармакологических агентов. Однако подавляющее большинство из известных блокаторов приводит к полному блоку ионного тока через канал, что затрудняет их использование в медицинских целях. Передозировка таких блокаторов, как тетродотоксин, может вызвать негативные эффекты вплоть до летального исхода.

Используемые для обезболивания локальные анестетики — тоже блокаторы именно этих каналов. Их основное отличие от тетродотоксина состоит в том, что они действуют только в высоких концентрациях — иначе говоря, только вблизи места укола. Локальные анестетики препятствуют возникновению потенциалов действия, а значит, и передаче в мозг болевых сигналов.

Потенциально лиганды, вызывающие неполный блок натриевых каналов, имеют огромную фармакологическую ценность. Применение таких препаратов позволит снижать чувствительность ионных каналов, не нанося непоправимых повреждений организму. Вероятность отрицательных эффектов от передозировки также значительно снижается.