Молекулярные механизмы модуляции эффекта антидиуретического гормона в осморегулирующем эпителии Парнова, Римма Германовна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Необходимым условием существования всех живых существ является обеспечение водно-солевого гомеостата. Его основными параметрами, на которые направлена физиологическая регуляция, являются обеспечение постоянства концентрации ионов, осмотического давления и объемов жидкостей внутренней среды (Smith, 1959; Гинецинский, 1963,- Нагочин, 1983). У наземных позвоночных особенно остро стоит проблема сохранения воды в организме, для решения которой в процессе эволюции возникли механизмы точного контроля количества реабеорбируемой воды и способности к осмотическому концентрированию выводимой жидкости. У всех наземных позвоночных регуляции процесса реабсорбции воды осуществляется в почке, а у наземных амфибий эту функцию выполняют также кожа и мочевой пузырь.

Возможность регуляции реабсорбции и способность к осмотическому концентрированию выводимой жидкости обусловлена наличием барьеров для движения осмотически свободной воды и выработкой горуюпов, регулирующих проницаемость этих барьеров. Таким барьером является специализированный плотный эпителий, присутствующий в дистальних отделах пефрона наземных позвоночных, в коже и мочевом пузыре амфибий, и характеризующийся чрезвычайно низким уровнем осмотической проницаемости. Транспорт воды в этих эпителиях регулируется изменением свойств апикальной мембраны клеток, которые обеспечивают осмотическую проницаемость или непроницаемость эпителия. Регуляция транспорта воды по осмотическому градиенту в осморегулирующих органах осуществляется антидиуретическим гормоном, представленным у млекопитающим аргшшн-вазопрессином (АВП)¹, а у остальных позвоночных - аргинин-вазотоцином.

Изменения свойств апикальной мембраны при действии АДГ, которые приводят к увеличению ее осмотической проницаемости, являются результатом действия сложного многокомпонентного каскада молекулярных событий, начинающихся со взаимодействия гормона с различными типами рецепторов на базо латеральной мембране клетки, накоплением цАМФ и заканчивающиеся встраиванием Структур, содержащих водные каналы, в апикальную мембрану (см. Иванова, Наточин, 1987; Abramow et al., 1987; Bourguet et al., 1989; Scorecki et al., 1992). Многие основополагающие открытия в механизме действия АДГ, такие как выявление роли цАМФ (Orloff & Handler, 1962), обнаружение в апикальной мембране внутримембранных агрегатов частиц (Chevalier et al., 1974), были выполнены на изолированном мочевом пузыре амфибий - замечательной экспериментальной

¹ Сокращения, употребляемые в тексте: АВП - аргинин-вазопрессин, АДГ - антидиуретический гормон, АК - арахидоновая кислота, БСА - бычий сывороточный альбумин, ВМЧ - внутримембранные частицы, ДАГ - диацилглицерин, ДМСО - диметилсульфоксид, ИБМК - З-изобутил-1-метилксантин, ИТФ - инозиг-грифосфат, КТ - коклюшный токсин, ПГЕ2 - простагландин Ег, ПКС - протеинкиназа С, СЖК - свободные жирные кислоты, ТСХ - тонкослойная хроматография, ФИ - фосфатидилинозит, ФИФ - фосфа-тидилинозит-4-фосфат, ФИФ₂ - фосфатидилинозит-4,5-дифосфат, ФЛАг - фосфолилаза Ai, ФМА - форбол-12-миристат, 13-ацетат, ФС - фосфатидисерин, ФХ - фосфатидилхо-лин, ФЭА - фосфатиднлэтаноламин.

модели осморегулирующего эпителия. Принципиальное сходство молекулярной и структурной организации реализации эффекта АДГ в гранулярных клетках мочевого пузыря амфибий и основных клетках собирательных трубок почки млекопитающих, значительно более труднодоступных для исследований, обеспечило этому объекту успех и популярность в изучении процессов транспорта воды и ионов.

В любой клетке основными событиями преобразования внеклеточного сигнала являются изменение свойств протеинкиназ, уровня свободного [Са²⁺| и экспрессии генов. Однако, количественный эффект реализации действия гормонов связан с активацией системы огромного числа внутриклеточных модуляторов, локально и обратимо изменяющих передачу наружного сигнала. Как правило, регуляция наиболее важных физиологических параметров контролируется по крайней мере двумя системными факторами, например, уровень глюкозы - инсулином и глюкагоном, баланс кальция - кальцитонином, паратгормоном и активными формами витамина D? , натрия - альдостероном и натрийуретическим фактором и т.д. Поскольку АДГ является единственным гормоном, способным увеличивать осмотическую проницаемость осморегулирующего эпителия, и, по-видимому, отсутствует гормон противоположного эффекта - диуретический, потребность в точной регуляции количества рсабсорбируемой воды создает необходимость в механизмах модуляции гормонального сигнала, локализованных в самой клетке-мишени. В основе этих механизмов лежит перекрестное влияние и взаимодействие систем вторичных посредников и их эффекторов, которое обеспечивает как тонкую регуляцию эффекта самого АДГ, так и модулирующее действие других биологически активных веществ (стероидов, простагландином, катехоламинов и др.).

В последние годы была получена детальная информация о тонкой химической структуре начальных и конечных звеньев развития гидроосмотической реакции -были клонированы рецепторы АВП и белки, образующие водные каналы (Morel et al., 1992; BinAattmer et al., 199 Agre -et -aL, 1993). Однако, яесмотрт на ошеломляющие успехи молекулярной биологии, прекративших многолетние дискуссии о природе транспорта воды, сложность физиологической регуляции на уровне клетки определяется всем тем каскадом взаимосвязанных молекулярных событий, которые происходят между "входом" « "выходом" сигнала. Наглядным подтверждением этому служит огромная индивидуальная вариабельность, обнаруживаемая в экспериментах на изолированных осморегулирующих органах, при которой на одну и ту же дозу АДГ реакция может отличаться в десятки раз, следовательно, сама-клетка, транспортирующая воду, заключает в себе те свойства, которые определяют ее функциональную реакцию на гормон.

Для того, чтобы понять, какие молекулярные механизмы лежат в основе модуляции гормонального сигнала на уровне клетки, необходимо исследовать системы различных вторичных посредников в передаче внешнего сигнала, понять их функциональную роль и механизмы перекрестного влияния, выявить внутриклеточные и аутокринные регуляторы, от которых зависит количественная реализация эффекта гормона. Исследование этих вопросов, которому посвящена настоящая работа, представляется необходимым в связи с важнейшей ролью процесса реабсорбции воды и его регуляции в обеспечении водно-солевого гомеостаза, и огромным функциональным значением молекулярных механизмов модуляции сигнала в осморегулирующем эпителии, от которых зависит реализации функционального эффекта гормона.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы послужило исследование молекулярных механизмов модуляции эффекта антидиуретического гормона в регуляции транспорта воды в изолированном мочевом пузыре лягушки Rana t em рог aria L. Основное внимание было сосредоточено на изучении системы вторичных посредников, и их функциональной роли в реализации эффекта антидиуретического гормона, поиску внутриклеточных и ауто- , паракринных регуляторов действия гормона. Соответственно, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность участия Са²⁺ /фосфоинозитндной системы передачи сигнала и выявить ее функциональную роль в механизме действия АДГ на увеличение осмотической проницаемости.

2. Исследовать роль свободных жирных кислот как модуляторов гидроосмотического действия АДГ , выявить возможные способы осуществления этой модуляции и ее локализацию, а также источники и механизмы высвобождения свободных жирных кислот.

3. В связи с обнаруженным нами феноменом увеличения осмотической проницаемости в отсутствии АДГ, выявить молекулярные механизмы его осуществления и исследовать роль аутакоидов в регуляции проницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки.

Научная новизна работы. Впервые была показана активация гидролиза фосфатиди-линозит-4,5-дифосфата, образования ииозиттрисфосфата, 1,2-днацнлглицерина и высвобождения свободной арахидоновой кислоты при стимуляции АДГ осморегу-лирующего эпителия. Использование специфических антагонистов вазопресенно-вых рецепторов и применение ингибиторов фосфоинозитид-специфичнон фосфоли-пазы С показало, что образующиеся молекулы выполняют функцию негативных модуляторов осмотической проницаемости, действие которых локализуется, главным образом, на этапах, предшествующих образованию цАМФ. С действием фосфоинозитидной системы передачи сигнала в значительно степени связана наблюдаемая при действии АДГ активация биосинтеза простаглапдипа Е. Выявлено, что свободная арахидоновой кислоты, повышение уровня которой происходит при действии АДГ, происходит главным образом, из фосфатидилэтаноламин и 1,2-диацилглицерина, что является результатом активации фосфолипазы Аз и фосфо-липазы С/ДАГ-липазы, соответственно. Впервые показано, что арахидоновая кислота является не только предшественником биосинтеза простагландииов, по и обладает функциональными эффектами как самостоятельный модулятор действия АДГ, помимо этого, выявлено действие жирных кислот иной структуры.

Впервые обнаружен факт повышения осмотической проницаемости эпителия изолированного мочевого пузыря лягушки в отсутствии нейрогнпофизарного контроля в условиях смены серозного раствора Рянгера. Показано, что рост водной проницаемости в этом случае обусловлен теми же молекулярными механизмами, что и при действии АДГ - активацией аденилатциклазы, накоплением цАМФ и появлением в апикальной мембране агрегатов внутримембранных частиц. В работе представлены доказательства, что в отсутствии гормона свойства эпителия в отношении его осмотической проницаемости зависят от уровня синтеза и секреции простаглаидина Ег.

Практическое значение работы. Использование в качестве объекта мочевого пузыря лягушки позволяет экстраполировать полученные данные иа проблему

молекулярных механизмов осморегуляции в дистальных отделах нефрона почки человека. Одним из наиболее частых и тяжелых поражений функции почки является нарушение осмотического концентрирования мочи. Известно, что в основе этой патологии лежат процессы нарушения молекулярного действия антидиуретического гормона на разных этапах его реализации. Полученные результаты, касающиеся различной роли систем вторичных посредников в функциональном эффекте вазо-прессина, и выявление модуляторов его действия дают возможность поиска новых подходов в изучении патологии почки и способов коррекции наблюдаемых нарушений. Данные о различной роли полинепасыщенных жирных кислот в реализации антидиуретического эффекта вазопрессина являются перспективными с точки зрения влияния липидных диет с различным жирнокислотіїьім составом на водно-солевой обмен у человека.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов" (Суздаль, 1989), VIII Всесоюзной конференции по физиологии почки н водно-еолевого обмена (Харьков, 1989), заседании Ленинградского общества физиологов, биохимиков и фармакологов им.И.М.Сеченова (Ленинград, 1990), Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990), на сателлитном симпозиуме 11-го Межд. конгресса нефрологов "Тубуло-интерстициальиые расстройства" (Иркутск, 1990), Международном конгрессе по патофизиологии (Москва, 1991), Собрании физиологического общества Бельгии (Гент, Бельгия, 1990), 7-ом Европейском коллоквиуме по физиологии почки (Неаполь, Италия, 1992), Европейском почечном форуме (Эрланген, Германия, 1994), Совещании стран СНГ по внутриклеточной сигнализации (Звенигород, 1993), VI Симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), Симпозиуме "Физиология почки и водно-солевого обмена", посвященного 100-летию со дня рожд.А.Г.Гинецинского (Новосибирск, 1995), заседании Отдела молекулярных основ эволюции функций ИЭФиБ им.И.М.Сеченова (Санкт-Петербург, 1996).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на /SO страницах, содержит 39 рисунков, 7 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в сеЪяЗЗб литературных источников.