Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1. Функциональная взаимосвязь щитовидной железы и системы крови
1.1 Влияние тиреоидных гормонов на клетки и органы системы крови 13
1.2 Функциональная взаимосвязь тиреоидного статуса, иммунного статуса и системы крови 22
1.3 Патогенетическое значение стресса в структурно-функциональных изменениях клеток и органов системы крови 27
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Экспериментальные модели и группы белых крыс .35
2.1.1 Экспериментальные группы крыс 35
2.1.2 Экспериментальная модель гипотиреоза и схема введения мерказоли ла .36
2.1.3 Модель иммобилизационного стресса .37
2.2 Характеристика даларгина, доза и схема введения .38
2.3 Материалы для исследования 39
2.4 Методы исследования
2.4.1 Методы цитологического исследования 40
2.4.2 Морфометрические методы исследования .41
2.4.3 Биохимические методы исследования 41
2.4.4 Определение концентрации тиреоидных гормонов 43
2.5 Методы статистической обработки результатов 43
Глава 3 Тиреоидный статус и процессы липопероксидации при стрессе в условиях гипотиреоза и возможность их коррекции (собственные результаты)
3.1 Уровень тиреоидных гормонов в плазме крови, масса тела и щитовидной железы у стрессированных и не стрессированных крыс с гипотирео зом 44
3.2 Динамика уровня продуктов ПОЛ в плазме крови и селезенке стрессиро-ванных и не стрессированных крыс в условиях гипотиреоза 48
3.3 Коррекция даларгином тиреоидного статуса и активности ПОЛ у стрес-сированных и не стрессированных крыс с гипотиреозом .54
Глава 4 Влияние гипотиреоза и стресса на состояние эритроидного ростка и красной пульпы селезенки и его коррекция даларгином
4.1 Эритроидное звено системы крови у стрессированных и не стрессирован ных крыс с гипотиреозом .64
4.1.1 Изменения в эритроидном ростке, составе эритроцитов крови и красной пульпе селезенки под влиянием гипотиреоза .64
4.1.2 Влияние стресса на эритроидный росток и состояние красной пульпы селезенки у крыс с гипотиреозом 74
4.2 Влияние даларгина на эритроидное звено системы крови у стрессирован ных и не стрессированных крыс с гипотиреозом 81
4.2.1 Изменения в эритроидном звене у не стрессированных крыс с гипотиреозом под влиянием даларгина 81
4.2.2 Изменения в эритроидном звене у стрессированных крыс с гипотиреозо мпод влиянием даларгина .88
Глава 5 Изменение тромбоцитопоэза, миелопоэза, состава гранулоци-тов периферической крови при гипотиреозе и стрессе и влияние на них дала-ргина
5.1 Изменения количества мегакариоцитов в красном костном мозге у стрес-сированных и не стрессированных крыс с гипотиреозом, получавших и не получавших даларгин 95
5.2 Изменения в миелоидных ростках и лейкоцитарной формуле у стрессиро-ванных и не стрессированных крыс с гипотиреозом 97
5.3 Влияние даларгина на миелоидное звено системы крови у стрессирован-ных и не стрессированных крыс с гипотиреозом 111
Глава 6 Состояние агранулоцитов периферической крови, их гемопо-эза в красном костном мозге и белой пульпе селезенке при гипотиреозе и стрессе и влияние на них даларгина
6.1 Изменения в агранулоцитарных ростках и белой пульпе селезенки у стрессированных и не стрессированных крыс с гипотиреозом 128
6.2 Влияние даларгина на агранулоцитаное звено системы крови у стрессиро ванных и не стрессированных крыс с гипотиреозом 143
Заключение .157
Выводы .167
Список литературы
- Функциональная взаимосвязь тиреоидного статуса, иммунного статуса и системы крови
- Экспериментальная модель гипотиреоза и схема введения мерказоли ла
- Динамика уровня продуктов ПОЛ в плазме крови и селезенке стрессиро-ванных и не стрессированных крыс в условиях гипотиреоза
- Влияние стресса на эритроидный росток и состояние красной пульпы селезенки у крыс с гипотиреозом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Система крови поддерживает гомеостаз, обеспечивает защитные реакции организма (воспалительную и иммунную) и снабжение организма кислородом, поэтому выявление и оценка ее состояния в экстремальных и патологических условиях, включая гипотиреоз и стресс, остается актуальным и сегодня.
Для многих регионов мира, в том числе, для Восточной Сибири, характерно недостаточное содержание йода в биосфере, что является причиной возникновения гипотиреоидного состояния, которое сопровождается снижением основного обмена на 25-40% и развитием тканевых отеков (R. Malik, 2002; С.И. Доломатов, 2002; Э.П. Касаткина, 2003). Среди эндокринных заболеваний гипотиреоз составляет от 0,2 до 2% (J.G. Hollowell, 2002). Гипотиреоз оказывает непосредственное влияние на функционирование почти всех органов и систем организма (J.L. Volumenie, 2000; G. Canaris, 2000; J.T. Dunn, 2000; Y. Bando, 2002; О.К. Хмельницкий, 2006; В.Н. Козлов, 2006; С.Б. Гармаева, 2006; В.Я. Хрыщанович, 2008). Изменение состояния системы крови при гипотиреозе может оказаться дополнительным патогенетическим фактором в развитии этого заболевания. Вместе с тем, на сегодняшний день этот аспект проблемы гипотиреоза изучен недостаточно как в медицине, так и в ветеринарии. Известны лишь единичные работы, посвященные исследованию периферической крови при гипотиреоидном состоянии у сельскохозяйственных животных (В.Н. Вольвачев, 2000; А.А. Оножеев, 2000; Т.А. Балтухаева, 2006). Учитывая вышеизложенное, исследование состояния системы крови при гипотиреоидном состоянии у животных остается актуальным.
Не менее важным аспектом этой проблемы является изучение адаптационных возможностей организма (реализации стресс-реакции) в условиях гипотиреоза. Стресс требует мобилизации энергетических запасов, тогда как гипотиреоз, наоборот, создает энергодефицит. Из этого следует, что адаптационные возможности организма при гипотиреозе могут быть изменены, но не известно, как это может отразиться на морфофункциональном состоянии разных звеньев системы крови и их резервных и компенсаторных свойствах. Изучение этих вопросов может создать основу для поиска путей коррекции патологических изменений в организме при гипотиреозе, альтернативных или дополняющих общепринятую заместительную терапию основного заболевания.
В последнее время существенно возрос интерес исследователей к
биологически активным веществам, в частности, к регуляторным пептидам в
связи с перспективами их практического применения. Одним из таких
регуляторных пептидов, оказывающих воздействие на метаболические процессы,
является синтетический аналог лей-энкефалина даларгин, обладающий широким
спектром биологической активности. Установлено, что даларгин оказывает
иммуномодулирующее воздействие, обладает антистрессорной активностью,
стресс-лимитирующим, антигипоксическим действием, восстанавливает
нарушенные морфофункциональные свойства крови (R.A. Rizza, 1980; V.R. Lavis, 1980; П.Д. Горизонтов, 1983; M.J. Muller, 1984; И.Е. Голуб, 1989; Л.Г.
Прошина, 1988; В.А. Косолапов и др. 1988; М.Г. Пшенникова, 1992; N.H. Kalin, 1994; Г.И. Козинц, 1997; Н.К. Кличханов и др. 2010). В связи с этим, исследование эффектов даларгина с целью коррекции нарушений в системе крови при гипотиреоидном состоянии и стрессе является перспективным.
Цель работы и задачи исследования
Цель исследования - выявление изменений структурно-функциональных компонентов системы крови белых крыс при стрессе и гипотиреозе, а также установление возможности коррекции выявленных нарушений с помощью синтетического аналога лей-энкефалина (даларгина)
Задачи:
1. Оценить у белых крыс тиреоидный статус и процессы липопероксидации
при стрессе и экспериментальном гипотиреозе и возможность их коррекции.
2. Выявить нарушения в эритроидном звене системы крови и в красной
пульпе селезенки при стрессе в условиях гипотиреоза.
3. Изучить возможность коррекции выявленных нарушений в эритроидном
звене системы крови с помощью курса инъекций даларгина.
-
Выявить изменения в лейкоцитарной формуле, в мегакариоцитарном и лейкоцитарных ростках системы крови белых крыс при стрессе в условиях гипотиреоза.
-
Изучить возможность коррекции выявленных нарушений в лейкоцитарной формуле, в мегакариоцитарном и лейкоцитарных ростках системы крови с помощью курса инъекций даларгина.
Методы исследования
В экспериментальном диссертационном исследовании использованы белые крысы, которые являются традиционным и удобным объектом для выявления биологических закономерностей и соответствуют по своему метаболизму всеядным сельскохозяйственным животным. В соответствии с поставленными задачами, применялись экспериментальные модели гипотиреоза и иммобилизационного стресса, цитологические методы (абсолютное и относительное количество клеток периферической крови, осмотическая резистентность эритроцитов, относительное количество клеток костного мозга, индексы пролиферации и созревания клеток системы крови), морфометрические методы (масса селезенки, объемная доля в % красной и белой пульпы, количество гемосидерина с пересчетом на массу), имму-ноферментные методы (концентрация тиреоидых гормонов в крови), биохимические методы (концентрация продуктов перекисного окисления липидов и антиокислительная активность крови), методы статистического анализа.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Система крови белых крыс реагирует на гипотиреоз лимфатизацией красного костного мозга, торможением эритропоэза, стойким снижением резистентности эритроцитов с истощением их резерва, а также продолжительной эозинопенией, колебанием численности нейтрофилов и лимфоцитов в крови, активацией центрального лимфопоэза, мегакариоцито- и базофилопоэза, депрессией периферического лимфопоэза на фоне уменьшения уровня тиреоидных гормонов в 5-6 раз и активации процессов липопероксидации.
-
Стресс при гипотиреозе у крыс увеличивает активность липопероксидации и лимфатизацию костного мозга, тормозит нейтрофило- и эозинофилопоэз, вызывает кратковременную лимфо- и нейтропению, но при этом увеличивает уровень ти-реоидных гормонов, сокращает период эозинопении, повышает устойчивость эритроцитов, нормализует их созревание и костномозговой резерв, уменьшает депрессию периферического лимфопоэза.
-
Даларгин в условиях гипотиреоза снижает активность липопероксидации, уменьшает лимфатизацию костного мозга, нормализует количество мегакариоци-тов, стимулирует нейтрофилопоэз. Кроме того, у нестрессированных крыс он нормализует уровень тиреоидных гормонов в крови, устраняет эозинопению и нарушения в эритроидном звене, но вызывает устойчивую нейтро- и лимфопению и торможение эозинофилопоэза, а у стрессированных крыс уменьшает в 2-3 раза разрушение эритроцитов в селезенке, стимулирует эритропоэз, центральный и периферический лимфопоэз, устраняет нейтро- и лимфопению, препятствует торможению эозинофилопоэза.
Научная новизна
В процессе проведения исследования получены новые научные результаты.
У гипотиреоидных белых крыс в периферической крови выявлено снижение осмотической резистентности эритроцитов, продолжительная эозинопения, периодическая нейтропения и лимфопения, в костном мозге - увеличение количества малых лимфоцитов, торможение эритропоэза и активация центрального лимфопоэза, мегакариоцито- и базофилопоэза, а в селезенке – накопление продуктов липопе-роксидации, повышенное количество гемосидерина и уменьшение размеров селезеночных телец. Приоритетными являются данные о способности даларгина нормализовать уровень тиреоидных гормонов в крови, корригировать в условиях гипотиреоза процессы липопероксидации, уменьшать лимфатизацию костного мозга, восстанавливать костномозговой резерв эритроцитов, нормализовать мегакариоци-топоэз, стимулировать нейтрофилопоэз, моноцитопоэз и фагоцитарную активность моноцитов/макрофагов.
Впервые выявлены позитивные и негативные эффекты стресса в условиях гипотиреоза. Позитивные эффекты проявляются в увеличении уровня тиреоидных гормонов в крови, сокращении периода эозинопении, повышении устойчивости эритроцитов и нормализации их созревания, увеличении размеров селезеночных телец и их реактивных центров. Негативные эффекты стресса заключаются в гиперактивации процессов липопероксидации, увеличении лимфатизации костного мозга, торможении нейтрофило- и эозинофилопоэза.
Показано, что введение даларгина крысам с гипотиреозом перед иммобили-зационным стрессом снижает активацию процессов липопероксидации, уменьшает лимфатизацию костного мозга, уменьшает в 2-3 раза разрушение эритроцитов в селезенке, стимулирует эритропоэз, нейтрофилопоэз, центральный и периферический лимфопоэз, препятствует торможению эозинофилопоэза.
Степень обоснованности и достоверности полученных результатов
Полученные результаты обоснованы достаточным количеством наблюдений, использованием современных методов и оборудования. Высокая степень до-
стоверности обеспечена статистической обработкой и анализом результатов исследования. Автором лично выполнены все эксперименты, обработан экспериментальный материал и проведены статистическая обработка результатов, их научный анализ и обсуждение.
Практическая ценность новых научных результатов
Практическая ценность работы состоит в том, что установлено негативное влияние гипотиреоидного состояния на систему крови, выражающееся в изменении соотношения ее структурных элементов и функциональных возможностей. При этом наиболее значительно страдает эритроидное звено (снижается устойчивость эритроцитов, усиливается их разрушение и истощается костномозговой резерв на фоне лимфатизации костного мозга), тогда как лейкоцитарное звено сохраняет свой гемопоэтический потенциал, за исключением периферического лимфопоэза.
Выявлено, что стресс в условиях гипотиреоза оказывает позитивное влияние на эритроидное звено системы крови (повышает устойчивость эритроцитов, нормализует их созревание и костномозговой резерв) и негативное влияние на лейкоцитарное звено (тормозит нейтрофило- и эозинофилопоэз), но при этом уменьшает депрессию периферического лимфопоэза, несмотря на гиперактивацию процессов липопероксидации.
Практическая ценность и новизна заключаются в доказательствах возможности коррекции выявленных нарушений с помощью введения синтетического энкефалина даларгина, который эффективно снижает активность липопероксида-ции и уменьшает лимфатизацию костного мозга, устраняет нарушения в эритро-идном звене, мегакариоцитарном и базофильном ростках, стимулирует нейтрофи-лопоэз и оказывает модулирующее действие на эозинофило- и лимфопоэз (у не-стрессированных крыс тормозит эозинофилопоэз, слабо влияя на лимфопоэз, а у стрессированных крыс, наоборот, препятствует торможению эозинофилопоэза и стимулирует центральный и периферический лимфопоэз).
Реализация и внедрение результатов исследований
Результаты исследований используются в научно-исследовательской работе аспирантов, ветеринарных врачей, биологов при написании монографий, соответствующих разделов учебных пособий по системе крови и внедрены в учебный процесс Бурятского государственного университета, Иркутского государственного медицинского университета, Бурятской ГСХА, Восточно-Сибирского государственного технологического университета.
Апробация и публикации
Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры паразитологии факультета ветеринарной медицины БГСХА (Улан-Удэ, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных» (Улан-Удэ, 2008); Международной научно-практической конференции «Современная деятельность сельскохозяйственных товаропроизводителей и научных организаций в развитии АПК Центральной Азии» (Иркутск, 2008); Международной научно-
практической конференции «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса» (Троицк, 2008); Международной заочной научно-практической конференции «Естественные науки: актуальные вопросы и тенденции развития» (Новосибирск, 2011); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (Москва, 2012); на XII Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной биологии и здоровья человека», посвященная 100-летию ННУ им. В.А. Сухомлинского (Николаев, 2012), на III Международной дистанционной научно-практической конференции «Фундаментальная наука и технологии – перспективные разработки» (North Charleston, USA, 2014). По теме диссертации опубликовано 23 научные работы, в том числе 13 работ в изданиях рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации
Функциональная взаимосвязь тиреоидного статуса, иммунного статуса и системы крови
Щитовидная железа за счет вырабатываемых тиреоидных гормонов тироксин -Т3 и трийодтиронин -Т4 оказывает влияние на организм, обеспечивая нормальное функционирование большинства органов. Существенное влияние они оказывают и на систему крови, причем это воздействие взаимосвязано с влиянием эндокринных и других желез (надпочечников, гипофиза, половых желез), нервной и иммунной систем, что позволяет организму адекватно реагировать на постоянно изменяющиеся условия внешней и внутренней среды [17, 45, 321]. Попав в кровоток, 99% тироксина и трийодтиронина связываются с белками плазмы крови, синтезируемыми печенью: в большей степени с тироксинсвязывающим глобулином и в меньшей степени с тирок-синсвязывающим преальбумином и альбумином, которые являются их переносчиками. Тироксин и трийодтиронин поступают в ткани медленно, особенно тироксин, так как обладает высоким сродством к транспортным белкам плазмы крови. Примерно 6 суток необходимо для того, чтобы половина присутствующего в крови Т3 поступило в кровь, а для Т4 необходимо около 1 суток. Попав в клетки, гормоны ЩЖ снова связываются с белками, причем Т3 более прочно, чем Т4, из этого следует, что эти гормоны хранятся в самих клетках-мишенях, где они медленно используются в течение нескольких суток или недель. В тканях эти комплексы распадаются, освобождая тироксин и трийодтиронин. Тироксин в комплексе с глобулином обладает большей стабильностью, чем связанный с альбумином и преальбумином. Образование таких комплексов защищает гормоны ЩЖ от инактивации в почках [101]. При этом образуется своеобразная буферная система между ЩЖ и перифрией. Эти процессы обратимы, так как биологической активностью обладают только свободные (не связанные с белком) гормоны [16].
Содержащийся в крови в небольшом количестве свободный Т3 определяет тиреоидное состояние организма: гипо- и гипертиреоз. Тиреоидные гормоны регулируют уровень базального метаболизма всех клеток. Содержание свободных Т4 и Т3 в плазме поддерживается на постоянном уровне, и поэтому разные ткани подвергаются воздействию одних и тех же концентраций тиреоидных гормонов. Вместе с тем, концентрации свободных форм гормонов в различных тканях отличаются друг от друга в зависимости от активностей транспорта и дейодиназы [406, 435]. Дейодирование осуществляется специфическими ферментами – дейодиназами [398], 5-дейодиназа удаляет один атом йода из тироксина в 5-ом положении -кольца, и приводит к образованию рТ3, не обладающего гормональной активностью, которые также секретируются в кровь, а функция 5 - дейодиназы заключается в образовании Т3 [16, 101]. Существует корреляция между активностью Т4 и скоростью его дейодирования предполагается, что дейодирование гормонов ЩЖ предшествует их действию [100]. Трийодтиронин дейодируется быстрее, чем тироксин, этим можно объяснить его более высокую активность и более короткий латентный период по сравнению с тироксином [9, 12, 18, 22,]. Удаление атома йода может происходить и в других органах. Установлено, что имеется 5 - дейодиназа в почках, печени и культуре фибробластов. Дейодированию в печени подвержено до 75% метаболизируемого тироксина. В организме разрушение тиреоидных гормонов происходит медленно: период полураспада тироксина около 4 суток, а трийодтиронина – 45 ч. При этом избыток тирео-идных гормонов подвергается разрушению и выведению из организма. Из этого следует, что дейодирование имеет важное значение, не только для деактивации и удаления гормона из организма, но и для достижения им оптимального биологического эффекта [16, 27, 273].
Таким образом, длительный латентный период и большая продолжительность действия тиреоидных гормонов объясняется не только их связыванием с белками плазмы, а также с внутриклеточными протеинами и, как следствие - медленным их высвобождением, но и осуществлением функциональных влияний в клетках, присущих гормонам ЩЖ. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что наряду с транспортом тиреоид-ных гормонов белками плазмы крови, основные количества Т4 в организме млекопитающих транспортируются эритроцитами, которые способны депонировать значительное его количество. При этом гормондепонирующая способность эритроцитов млекопитающих имеет выраженную сезонную динамику и зависит от таких факторов как: величина рН, показатель гематокрита и состояние белкового обмена [98].
Главный эффект гормонов ЩЖ заключается в активной транскрипции большого количества генов в ядре. Под влиянием этих гормонов почти во всех клетках организма синтезируется большое количество ферментов, структурных и транспортных белков, что ведет к повышению функциональной активности организма. Начальным этапом механизма действия генной транскрипции является объединение тиреоидных гормонов с ядерными рецепторами. Связываясь с тиреоидным гормоном, рецепторы становятся активными и инициируют процесс транскрипции. Данная реакция в печени и почках подопытных крыс наблюдалась спустя 30 минут после введения Т3, причем среднее время диссоциации связи с рецептором составляла 15 минут для Т3. Однако, биологическая роль Т3 более значима, по сравнению с Т4 в связи с высоким их сродством (в 10 раз) к ядерным рецепторам клеток-мишеней. Известна природа ядерных рецепторов, связывающих Т3, им оказался белок, с молекулярной массой 50500 Да. Связываясь с ядерными рецепторами, тиреоидные гормоны еще больше активируют РНК-полимеразы и матричную активность хроматина, что приводит к активному образованию новых популяций гетерогенной РНК.
Экспериментальная модель гипотиреоза и схема введения мерказоли ла
У гипотиреоидных крыс, процессы ПОЛ на протяжении всего эксперимента активизировались, в крови и органе увеличивалось суммарное количество продуктов липопероксидации, преимущественно, за счет накопления диеновых конъюгатов (рис. 5, 6). На 2 сутки концентрация ДК в селезенке проявляла тенденцию к нарастанию, а в плазме крови увеличивалась в 2,1 раза, по сравнению с группой интактных крыс. При этом концентрация МДА не изменялась ни в плазме крови, ни в органе. Представленные данные свидетельствуют, что после прекращения введения мерказолила в первые двое суток превращение ДК в МДА было существенно заторможено, а избыток ДК вымывался из селезенки в кровь. На 7 сутки в селезенке уровень ДК повышался в 2,39 раза (рис. 5), а в крови оставался по-прежнему высоким (рис. 6).
Концентрация МДА при этом в крови не отличалась от нормы, а в селезенке увеличивалась на 33% (в 1,3 раза) по сравнению с нормальным значением. К концу наблюдения (через месяц) концентрация ДК в плазме крови возросла в 2,5 раза, в селезенке в 2,8 раза. Уровень МДА в селезенке увеличился еще больше - в 1.6 раза, но в плазме крови он оставался в диапазоне нормы, что может быть свидетельством о замедлении процесса превращения ДК в МДА. Параллельно нарастанию активности процессов ПОЛ в селезенке проявлялась стойкая тенденция к росту антиокислительной активности на протяжении всего эксперимента (рис. 7-Б).
К 7 суткам в крови у крыс с эутиреоидным статусом антиокислительная активность (АОА) увеличилась в 1,4 раза (рис. 7-А, табл. 3 приложения), а в селезенке АОА увеличивалась в 2 раза на 2 сутки (p 0,05, рис. 7-А) и оставалась высокой до конца наблюдения.
В крови у крыс с гипотиреозом на 2 сутки АОА была вдвое ниже, к 7 суткам нормализовалась, но к концу наблюдения снова снизилась (рис. 7-Б). В селезенке АОА проявила волнообразный характер: на 2 сутки – тенденция к повышению к 7 суткам – понижение, а через месяц наблюдений вновь повысилась и превысила норму в 1,6 раза (p 0,05, рис. 7-Б).
Представленные данные свидетельствуют, что в условиях экспериментального гипотиреоза активируются процессы ПОЛ, что сопровождается накоплением в селезенке ДК, замедлением превращения ДК в МДА и ча 51 стичным вымыванием ДК в плазму крови. Антиокислительная активность оказалась высокой в селезенке, но существенно ослабленной в крови. [166].
В течение всего эксперимента процессы липопероксидации у стресси-рованных крыс с гипотиреозом были выше по сравнению с не стрессирован-ными крысами. Это отражается в накоплении ДК и МДА в периферической крови и в селезенке. При этом уровень ДК в периферической крови возрастал на 2 сутки в 1,5 раза и продолжал увеличиваться до конца эксперимента (28 сутки) и превышал в 1,8 раза концентрацию ДК у гипотиреоидных крыс (p 0,05, рис. 8).
Обозначения: Г – гипотиреоз, ГS – стрессированные крысы с гипотиреозом, ДК – диеновые коньюгаты, МДА – малоновый диальдегид
В селезенке уровень ДК возрастал на 2 сутки в 3 раза, а к концу наблюдения (через месяц) превышал концентрацию у не стрессированных крыс с гипотиреозом в 1,6 раза (p 0,05, рис. 9).
Концентрация МДА под влиянием стресса у крыс с гипотиреозом в селезенке возрастала в 1,4 раза, по отношению к не стрессированным крысам, и оставалась повышенной до конца эксперимента (рис. 9). Из полученных данных следует, что при гипотиреозе стресс как и при эутиреозе приводит к гиперактивации процессов липопероксидации в селезенке и при этом не нарушалось превращение ДК в МДА [165, 167, 168]. Рисунок 9 - Изменения содержания ДК и МДА (мМ/л) в селезенке у не стрессированных крыс (Г) и стрессированных крыс с экспериментальным гипотиреозом (ГS), обозначения как на рис. 8
В периферической крови у гипотиреоидных крыс после иммобилизации концентрация малонового диальдегида уменьшалась, а диеновых ко-нюгатов, наоборот увеличивалась, что свидетельствует об активном вымывании диеновых коньюгатов из органа в кровь (рис. 9). Антиокислительная активность в селезенке у стрессированных крыс с гипотиреозом была повышенной и не отличалась от гипотиреоидных крыс (рис. 7-Б, 10, табл. 3 приложения), при этом в плазме крови антиокислительная активность не выходила за пределы нормы, а к концу наблюдения возрасла в 1,5 раза.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что стресс при гипотиреозе вызывает пролонгированную гиперактивацию процессов липопероксидации, что приводит к накоплению диеновых коньюгатов в периферической крови и в селезенке, и стимулирует антиокислительную активность в данном органе. 0,7
У гипотиреоидных крыс в условиях введения даларгина (10 дневный курс, начиная с момента отмены мерказолила) на 2-е сутки проявлялся положительный эффект даларгина, который выражался в существенном уменьшении массы щитовидной железы (в 2,4 раза, таблица 1 приложения) и увеличении продукции тиреоидных гормонов (Т3 в 3 раза, Т4 свободного в 4,4 раза, (р 0,05, таблица 1 приложения), в отличие от крыс, не получавших да 55 ларгин. К 28 суткам наблюдения у не стрессированных крыс с гипотиреозом, получавших даларгин, масса щитовидной железы и концентрация тиреоид-ных гормонов в крови полностью нормализуются. Несмотря на нормализацию гормонпродуцирующей функции щитовидной железы, у гипотиреоид-ных крыс, получавших даларгин, масса тела остается увеличенной до конца наблюдений, а масса селезёнки в течение всего эксперимента остается в диапазоне нормы (табл. 1 приложения).
Динамика уровня продуктов ПОЛ в плазме крови и селезенке стрессиро-ванных и не стрессированных крыс в условиях гипотиреоза
На 7 сутки после иммобилизации при эутиреозе в ККМ численность клеток нейтрофильного ростка и деление бластных форм нормализуются (рис. 54, 55), а созревание сохранялось по-прежнему замедленной, по отношению к интактным крысам (рис. 56). У гипотиреоидных крыс после стресорного воздействия на 7 сутки экс перимента индекс пролиферации (ИП) и индекс созревания (ИС) нейтрофилов еще больше тормозились, и численность клеток нейтрофильного ростка оставалась низкой, но к концу эксперимента (через месяц наблюдений) пролиферация (ИП) бластных форм нормализовалась, а созревание (ИС) ускорилось и окзалось в 1,4 раза больше, чем у интактных крыс (р 0,05), численность клеток нейтрофильного ростка нормализовалось (рис. 54).
Анализ полученных данных позволяет сделать следующие выводы: - по динамике числа лейкоцитов в периферической крови у гипотирео-идных крыс, не подвергавшихся стрессу, не выявлено отклонений от нормального значения, тогда как у стрессированных крыс к 7 суткам наблюдения развивалась кратковременная лейкопения (в отличие от лейкоцитоза при эутиреоидном статусе); - по числу базофилов в периферической крови у всех гипотиреоидных крыс отклонений от нормы не выявлено, но в ККМ численность клеток базо-фильного ряда увеличивалась, причем у не стрессированных крыс - постоянно до конца наблюдений, а у стрессированных крыс - кратковременно (в отличие от снижения его численности при эутиреозе); - у крыс с гипотиреозом в периферической крови с 7 суток наблюдения выявляется эозинопения, которая у не стрессированных крыс имеет устойчивый характер, но не истощает резерв эозинофилов и не стимулирует эозино-филопоэз, тогда как у стрессированных крыс она носит временный характер и сопровождается подавлением эозинофилопоэза (в отличие от стресс-индуцированной эозинопении при эутиреозе, которая развивается в первые сутки, истощает резерв зрелых эозинофилов и компенсаторно стимулирует эозинофилопоэз); - численность нейтрофилов в крови у гипотиреоидных крыс не подвергавшихся иммобилизации изменялась волнообразно (с преобладанием периодов нейтропении) и сопровождалась повышенным содержанием палочко-ядерных (ПЯ)-нейтрофилов, а также увеличением в ККМ депо зрелых нейтрофилов, тогда как у стрессированных крыс наблюдалась кратковременная нейтрофилия, переходящая в устойчивую нейтропению с отсутствием ПЯ-нейтрофилов вследствие торможения нейтрофилопоэза и истощения депо зрелых нейтрофилов, которые восстанавливались только к концу наблюдения.
В совокупности представленные данные позволяют считать недостаток энергии при гипотиреоидном состоянии причиной выявленных отличий в составе гранулоцитов периферической крови и их реакций на стресс, который может частично компенсировать дефицит энергии за счет метаболических влияний катехоламинов и глюкокортикоидов.
Введение даларгина гипотиреоидным крысам (10-ти дневный курс) на 2 и 7 сутки эксперимента вызывает уменьшение в 1,5-1,2 раза количества лейкоцитов в крови, по сравнению с крысами, не получавшими даларгин (р 0,05, рис. 57. табл. 4 приложения). Возможно, это связано с миграцией лейкоцитов в ткани для устранения структурных нарушений в органах. Однако, на 28 сутки наблюдения количество лейкоцитов постепенно увеличивалось до уровня крыс без коррекции даларгином, но все ещё было в 1,29 раза меньше нормального значения.
У гипотиреоидных крыс после иммобилизации, на 2 сутки после инъекций даларгина, количество лейкоцитов в периферической крови, не отли 112 чалось от аналогичных крыс, не получавших даларгин. К 7 суткам количество этих клеток увеличилось в 1,7 раза, по сравнению со стрессированными крысами, не получавшими даларгин (р 0,05, рис. 57), и проявляло тенденцию к увеличению по отношению к норме. Динамика численности лейкоцитов ( 109/л) в периферической крови у не стрессированных и стрессированных крыс с экспериментальным гипотиреозом, с коррекцией и без коррекции даларгином
Обозначения: ГД – не стрессированные крысы с гипотиреозом, с коррекцией даларгином; ГSД - стрессированные крысы с коррекцией даларги-ном; Г – не стрессированные крысы с гипотиреозом, без коррекции даларги-ном; ГS - стрессированные крысы с гипотиреозом, без коррекции даларгином
Из этих данных следует, что у не стрессированных крыс с гипотиреозом введение даларгина вызывает стойкую лейкопению, а у стрессированых крыс, наоборот, увеличение количества лейкоцитов с тенденцией к лейкоцитозу, который у крыс с эутиреозом при стрессе ярко выражен.
Количество эозинофилов у крыс с гипотиреозом в крови на 2 сутки после введения даларгина, уменьшилось в 3,3 раза, в отличие от крыс, не получавших даларгин (р 0,05, рис. 58). К 7 суткам эксперимента постепенно уве 113 личивалось, и к концу наблюдения (28 сутки) нормализовалось и в 1,6 раза превышало значение у крыс, не получавших даларгин (р 0,05; рис. 58). Введение даларгина стрессированным крысам с гипотиреозом на 2 сутки наблюдения приводит к уменьшению в 2,2 раза количество эозинофилов в крови, к 7 суткам их количество нормализовалось и было в 2,3 раза больше, чем у аналогичных крыс без коррекции (р 0,05, рис. 58). Таким образом, введение даларгина не стрессированным и стрессиро-ванным крысам с гипотиреозом ведет к возникновению кратковременной эозинопении с последующей нормализацией количества эозинофилов.
Влияние стресса на эритроидный росток и состояние красной пульпы селезенки у крыс с гипотиреозом
Исследование выполнялось поэтапно, в соответствии с поставленными задачами. Модель гипотиреоза создавалась у половозрелых белых крыс-самцов в течение 2 месяцев путем ежедневного введения с кормом мерказо-лила, блокирующего тиропероксидазу, в дозе 10 мг/кг. В качестве модели стресса применяли апробированную Н. Selye [408] модель нервно-мышечного напряжения – иммобилизацию ненаркотизированных крыс в горизонтальном положении на спине в течение 6 часов однократно. Известно, что при этой модели стресса стадия тревоги продолжается в течение 36-39 часов, после 39 часов развивается стадия резистентности [8]. Для коррекции состояния системы крови был выбран синтетический аналог лей-энкефалина даларгин, обладающий антиоксидантным [135, 211], антистрессорным [211, 220, 285], антигипоксическим [129] и иммуномодулирующим действием [47, 135, 177].
Первый этап проведенного исследования решал 1-ую поставленную нами задачу – оценить у белых крыс тиреоидный статус и процессы липопе-роксидации при стрессе и гипотиреозе и возможность их коррекции.
Установлено, что после отмены мерказолила у крыс формируется ги-потиреоидное состояние, которое характеризуется снижением уровня тирео-идных гормонов в крови на 2 сутки наблюдения в 5 раз - Т3 и в 6,5 раза - свободного Т4, на 28 сутки – в 2,6 и 7 раза соответственно. При этом, под действием мерказолила масса ЩЖ увеличивается до максимальных значений, но после его отмены начинает уменьшаться, тогда, как масса тела возрастает более устойчиво [66, 165].
Продукты ПОЛ у крыс с гипотиреозом активировались, при этом превращение диеновых коньюгатов (ДК) в малоновый диальдегид (МДА) было заторможено, они накапливались в селезенке и частично вымывались в кровь. На 2 сутки наблюдения концентрация ДК в крови увеличивалась в 2 раза, и оставалась повышенной до 28 суток наблюдения, при этом превышала в 2,5 раза норму. В селезенке концентрация ДК увеличивалась с 7 суток наблюдения и к концу эксперимента (28 сутки) была в 2,8 раза больше, чем у интактных крыс. Концентрация МДА в крови в течение 28 суток наблюдения оставалась в диапазоне нормального значения, тогда как в селезенке на 2 сутки наблюдения проявила тенденцию к уменьшению, к 7 суткам увеличивалась и к 28 суткам была в 1,6 раза больше, чем у интактных крыс. Динамика антиокислительной активности (АОА) в крови проявила волнообразный характер: на 2 сутки – тенденция к уменьшению, по сравнению с исходным уровнем, к 7 суткам увеличивалась до диапазона нормы, а к 28 суткам эксперимента вновь проявила тенденцию к уменьшению. В селезенке АОА оставалась в пределах нормы до 7 суток наблюдения, к 28 суткам увеличивалась в 1,6 раза, по отношению к интактным крысам. Таким образом, антиокислительная защита была более высокой в селезенке по сравнению с кровью [166].
У стрессированных крыс, независимо от тиреоидного статуса, в стадию тревоги стресса уровень тиреоидных гормонов увеличивался в 3-6 раз, по сравнению с исходным уровнем (который при эутиреозе соответствовал уровню у интактных крыс, а при гипотиреозе был ниже в 5-6 раз), но при эутиреозе он нормализовался в стадию резистентности (на 7 сутки), тогда как при гипотиреозе оставался ниже нормы до конца наблюдений (28 суток). Так же, независимо от тиреоидного статуса, стресс на протяжении всего наблюдения активировал продукты ПОЛ, которые при гипотиреозе уже имели высокий уровень активности. Так, уже со 2 суток наблюдения концентрация ДК в крови и в селезенке увеличивалась и продолжала повышаться до конца наблюдения (28 сутки) и была больше нормы в 4,5-4,4 раза, соответственно. Концентрация МДА в крови на 2 сутки наблюдения не выходила за пределы нормы, к 7 суткам уменьшилась в 1,7 раза, а к 28 суткам была в 3,7 раза меньше, чем у интактных крыс. В селезенке концентрация МДА наоборот, уже со 2 суток наблюдения увеличивалась на протяжении всего эксперимента, и к 28 суткам превышала в 1,7 раза нормальное значение. При этом в условиях эутиреоза в селезенке АОА повышалась, тогда, как в условиях гипотиреоза лишь намечалась тенденция к увеличению этого показателя. Тем не менее, под влиянием стресса у крыс с гипотиреозом с 7 суток начинала снижаться масса тела и уменьшалась масса щитовидной железы.
Введение даларгина не стрессированным крысам с гипотиреозом (внутримышечно, ежедневно 10 дней) нормализует содержание тиреоидных гормонов в крови, а к концу наблюдения – и массу щитовидной железы (ЩЖ), тогда как, у стрессированных крыс даларгин (в/м введение, двукратно - за сутки и непосредственно перед иммобилизацией) лишь поддерживает индуцированные стрессом эффекты - повышение уровня тиреоидных гормонов и уменьшение массы ЩЖ. Даларгин при гипотиреозе уменьшал суммарную концентрацию продуктов ПОЛ в крови, особенно, у стрессированных крыс. Это объясняется его антиоксидантными свойствами и стресс-лимитирующим действием [61, 62, 63, 204].
Таким образом, результаты первого этапа исследования дали возможность сделать следующие выводы: - введение в организм в течение 2 месяцев мерказолила приводит к раз витию гипотиреоидного состояния, которое сопровождается увеличением массы тела и щитовидной железы и активацией ПОЛ; учитывая быстрое вы ведение мерказолила из организма (5-6 часов) [184], есть основание считать, что все изменения, выявленные в течение 28 суток после отмены мерказоли ла, являются следствием дефицита тиреоидных гормонов (а не действия мер казолила); - иммобилизационный стресс, независимо от тиреоидного статуса, в стадию тревоги увеличивает уровень тиреоидных гормонов, но при гипоти реозе он остается в 5-6 раз ниже и не нормализуется в стадию резистентно сти, хотя начинает снижаться масса тела и уменьшается масса ЩЖ; - иммобилизационный стресс, независимо от тиреоидного статуса, активирует продукты ПОЛ, продукты которого в условиях гипотиреоза накапливаются в крови и селезенке в более высоких концентрациях, а антиокислительная активность (АОА) остается низкой; - даларгин в условиях гипотиреоза уменьшал суммарную концентрацию продуктов ПОЛ в крови, особенно, у стрессированных крыс, кроме того, у гипотиреоидных крыс он нормализует содержание тиреоидных гормонов в крови, а к концу наблюдения – и щитовидную железу, тогда как у стрессиро-ванных крыс он лишь поддерживает индуцированные стрессом эффекты -повышение уровня тиреоидных гормонов и уменьшение массы ЩЖ.
Второй этап проведенного исследования решал 2-ую и 3-ю задачи -выявить нарушения в эритроидном звене системы крови и в красной пульпе (КП) селезенки при стрессе и в условиях экспериментального гипотиреоза, а также возможность их коррекции даларгином.
Установлено, что гипотиреоз вызывает существенные изменения в периферической крови, выражающиеся в долговременном снижении ОРЭ, дестабилизации мембран эритроцитов и ускорении разрушения этих клеток. Все эти нарушения активируют эритропоэз по гетеробластическому пути, что приводит к макроцитозу в крови, наблюдаемому уже на 2 сутки после отмены мерказолила, но с 7 суток в крови увеличивается численность микроци-тов, а компенсаторные и резервные возможности красного костного мозга (ККМ) снижаются (уменьшаются индексы пролиферации и созревания клеток эритроцитарного ряда и резерв зрелых эритироцитов) и к концу наблюдения (через 1 месяц) истощаются.