Введение к работе
Актуальность проблемы. Для регуляции множественных биохимических процессов метаболизма, лежащих в основе физиологических и поведенческих реакций, в ходе эволюции образовался ряд регуляторних систем. Среди них особое место занимает система эндогенных опиоидных пептидов (ОП), основными представителями которой являются эндорфины и энкефалины.
Система ОП, возникшая на ранних этапах эволюции, принимает участие практически во всех процессах, происходящих в организме. Мультифункциональность действия ОП в большей мере объясняется их влиянием на нейрональные процессы мозга вообще и на синаптическую передачу в частности.
В настоящее время выделяют две формы участия ОП в синапти-ческой передаче - в качестве нейротрансмиттеров (НТ), эффект действия которых опосредован через взаимодействие с соответствующими рецепторами, а также в качестве нейромодуляторов - внутри-синаптических и дистантных, воздействующих на проводимость си-наптических мембран и обмен медиаторов. Существо модулирующего действия пептидов до конца не раскрыто. Вот почему актуальной, несмотря на интенсивное изучение, остается проблема познания молекулярных механизмов модулирующего действия нейропептидов (НП).
Возможным объяснением ряда эффектов ОП, в основе которых лежат механизмы, отличные от "классического" лиганд-рецепторного взаимодействия, могло бы служить допущение о регуляции пептидами активности ферментов сияаптического звена. Данное предположение практически не исследовано и нуждалось в экспериментальном подтверждении. Однако взаимодействие НП со множеством других биорегуляторов затрудняет процесс их аналитического исследования. В наших исследованиях, на модельной системе было изучено влияние ОП на активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ), поскольку энкефалины, при локализации с ацетилхолином в одном и том же пресинапти-ческом окончании, выделяясь в синаптическую щель, оказывают на холинергические процессы ряд эффектов, которые не опосредованны синаптическими рецепторами. С другой стороны, нами было изучено действие ОП на активность бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), родственного АХЭ фермента, на каталитической поверхности которого были обнаружены центры для связывания опиатов.
Цель н задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в доказательстве существования в качестве одного из механизмов модуляции опиоидными пептидами синаптических процессов - прямой регуляции активности ферментов пептидными лигандами на примере взаимодействия ОП с холинэстеразами.
Основные задачи исследования:
изучить взаимодействие эндогенных ОП, их фрагментов и синтетических аналогов с АХЭ;
изучить взаимодействие эндогенных ОП, их фрагментов и синтетических аналогов с БуХЭ;
провести сравнительный анализ эффективности ОП, их фрагментов и синтетических аналогов по отношению к холинэстеразам, от структуры эффекторов.
провести сравнительный анализ между реакционной способностью АХЭ и БуХЭ по отношению к ОП, их фрагментам и синтетическим аналогам.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые обнаружена регуляция активности АХЭ из эритроцитов крови человека и БуХЭ из сыворотки крови лошади опиоидными пептидами. Впервые среди изученного ряда пептидов (эндорфины, проэнкефалины, энкефалины, их фрагменты и синтетические аналоги) выявлены как активаторы, так и ингибиторы холинэстераз. Описан ряд закономерностей между структурой соединений, направленностью и величиной оказываемого ими на холинэстеразы эффекта.
Анализ результатов тестирования действия ОП на холинэстераз-ную активность позволил сделать заключение о существовании на каталитической поверхности холинэстераз нескольких участков, отличающихся от центров связывания опиоидов на классических опиат-ных рецепторах. Так, в случае АХЭ выявлены участки для взаимодействия с неконкурентными активаторами и ингибиторами пептидной природы. В случае БуХЭ впервые выявлены участки для взаимодействия с неконкурентными, неконкурентно-бесконкурентными пептидными ингибиторами, а также пептидными активаторами неконкурентного, смешанного и синергистического типов действия.
Представленные экспериментальные результаты наряду с данными литературы составили основу оригинальной гипотетической схемы возможных механизмов модуляции пептидами синаптических процессов, составной частью которой является путь регуляции пептидами активности ферментов синаптического звена, нашедший подтверждение в данной работе на примере регуляции активности холинэстераз опиоидными пептидами.
Положения, выносимые на защиту:
ОП в качестве регуляторов активности холинэстераз;
характеристика эффективности а- и у-эндорфинов, проэнкефа-линов, энкефалинов, даларгина и их синтетических аналогов и фрагментов (всего 30 соединений) по отношению к активности ацетилхо-линэстеразы и бутирилхолинэстеразы, включающая:
результаты сравнительного анализа между структурой эффекторов, направленностью, типом действия и величиной оказываемого на холинэстеразы эффекта;
результаты сравнительного анализа между реактивностью аце-тилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы на воздействия ОП.
Практическая ценность работы.
Впервые выявлена модулирующая эффективность по отношению к холинэстеразам у таких хорошо исследованных НП, какими являются ОП.
Описан новый класс эффекторов для холинэстераз - опиоидные пептиды - являющихся, вероятно, эндогенными регуляторами активности данных ферментов.
На примере регуляции холинэстераз опиоидными пептидами продемонстрирована как регуляция ферментативной активности прямым (не опосредованным через рецептор) способом, так и объединение в одном протопептиде набора эндогенных регуляторов холинэстераз, поскольку эндорфины и энкефалины практически являются продуктами последовательного протеолиза В-липотрошша.
Результаты данного исследования существенны для изучения общих механизмов модуляции пептидными регуляторами нейроме-диаторных процессов: предложен и показан на модельной схеме новый механизм модуляции опиоидными пептидами холинергических процессов.
Представленные результаты могут быть полезны при создании модельных систем для изучения механизмов действия нейропеп-тидных модуляторов. Обнаруженная холинэстеразяая эффективность пептидных лигандов системы ОП по отношению к холинэстеразам и проведенный анализ структурно-функциональных особенностей действия ОП на данные ферменты позволяют дать рекомендации для тестирования уже созданных и для направленного поиска новых лекарственных препаратов пептидной природы, обладающих специфической нейротропной активностью.
Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались на ленинградских городских конференциях молодых ученых и специалистов "Механизмы регуляции физиологических функций" (Ленинград, 1984, 1988); заседании кафедры физиологии человека и животных МГУ (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Физиология пептидов" (Ленинград, 1988); Всесоюзном рабочем совещании "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988); X научной конференции болгарских аспирантов в СССР с международным участием "Актуальные проблемы современной науки" (Москва, 1988); П Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1988); Ш ленинградском совещании "Направленный синтез физиологически активных соединений и проблемы количественной связи "структура-активность" биологически активных веществ" (Ленинград, 1988).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 223 источнике? .
Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 22. таблиц иJ J рисунков.