Введение к работе
Актуальность исследования. Секреция медиатора из нервных окончаний (НО) происходит порциями - квантами - в результате экзоцитоза синаптических везикул [Heuser J.E. et al., 1979; Зефиров А.Л. Черанов С.Ю., 2000; Sudhof Т.С. 2004]. Образование новых везикул из фрагментов везикулярной мембраны осуществляется в процессе эндоцитоза [Gundelfinger et al., 2003; Зефиров А. Л., 2007; Hinrichsen et al., 2006]. Вновь образованные везикулы снова подвергаются экзоцитозу. Кругооборот везикул и их повторное вовлечение в процесс секреции медиатора называется везикулярным циклом или рециклированием [Зефиров А.Л. 2007; Rizzoli S.O., Betz W.J, 2005; Heuser J.E. and Reese T.S., 1973; Richards D.A., et all., 2003; Kavalali E.T. 2006]. Важность его велика при высокочастотной активности синапсов как центральной так и периферической нервной системы, т.к. благодаря повторному использованию везикул становится возможной продолжительная секреция медиатора. [Heuser J.E. et al., 1979; Ceccarelli В. et al., 1979; Зефиров А.Л., 2007].
Определение параметров и свойств везикулярного цикла в настоящее время является сложной задачей, и пока нет единого мнения об общих принципах устройства и функционирования механизма рециклирования везикул. Предполагаются разные варианты разделения везикул на функциональные или структурные группы, называемые везикулярными пулами. Обсуждаются разные варианты участия везикулярных пулов в секреции медиатора [Elmqvist D., Quastel D. М. J., 1965; Scheggenburger R., et a!., 2002; Rizzoli S.O., Betz W.J., 2005].- Также выдвигаются предположения о существовании различных видов эндоцитоза и путях восполнения везикулярных пулов.
В настоящее время наиболее часто для исследования процессов везикулярного цикла применяются электрофизиологические методы и флуоресцентная микроскопия. Однако, несмотря на существенное развитие этих подходов, сами по себе они не могут раскрыть всех особенностей процессов, протекающих внутри нервного окончания, хотя и отражают их. Так с помощью электрофизиологических экспериментов по характеру изменения амплитуды постсинаптических ответов можно судить о скорости расходовании квантов медиатора. Применение флуоресцентных красителей (FM 1-43 и др.) даёт возможность прямого наблюдения как экзоцитоза, так и эндоцитоза везикулы. Однако эти методы не позволяют проследить, как происходит взаимодействие различных пулов везикул при секреции медиатора во время высокочастотной активности, ответить на вопрос об их количестве и путях возобновления пулов [Bctz W.J., Bewick G.S., 1992; Betz W.J., Bewick G.S., 1993; Зефиров А.Л. и др. 2003].
Более детально изучить механизмы рециклирования везикул возможно благодаря применению описанных подходов в комплексе с математическим моделированием, которое позволяет обобщать экспериментальные данные и анализировать предположения о причинах экспериментально наблюдаемых явлений. В данной работе проведено исследование процессов экзо- эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул с применением комплекса методов, включающего электрофизиологию, флуоресцентную микроскопию и математическое моделирование.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в исследовании пресинаптического везикулярного цикла в двигательных нервных окончаниях холоднокровных и теплокровных животных, лягушки и мыши.
В соответствие с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Провести электрофизиологические эксперименты по исследованию динамики амплитуды и квантового состава ПКП в ходе длительного высокочастотного раздражения, отражающей истощение и возобновление запасов синаптических везикул, участвующих в секреции медиатора.
-
Провести анализ загрузки флуоресцентного красителя FM1-43 в нервные окончания в процессе и после завершения высокочастотного раздражения для определения динамики эндоцитоза синаптических везикул во время и после высокочастотного раздражения.
-
Проанализировать динамику выгрузки красителя из НО при высокочастотной активности для оценки интенсивности экзоцитоза синаптических везикул.
-
Определить скорость рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши.
-
Построить различные варианты модели везикулярного цикла, позволяющие описать экспериментальные результаты, полученные с помощью электрофизиологического метода и флуоресцентной микроскопии.
-
Разработать метод поиска оптимальных значений параметров различных вариантов модели везикулярного цикла для определения степени согласованности этих вариантов с экспериментальными данными.
Положения, выносимые на защиту.
-
Везикулы в двигательных нервных окончаниях лягушки образуют три взаимодействующих пула. Восстановление везикул при высокочастотной активности обеспечиваю два типа эндоцитоза, и включение везикул в пулы происходит по двум различным путям.
-
Везикулы двигательных нервных окончаний мыши разделены на два пула, а восстановление везикул при высокочастотной активности обеспечивает один тип эндоцитоза. Скорость эндоцитоза прямопропорциональна общему количеству везикул, встроенных в пресинаптическую мембрану.
-
Разработаны модели везикулярных циклов в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши, позволяющие с высокой точностью описать динамику квантового состава ПКП и захват красителя нервными окончаниями при высокочастотной активности.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование экзо-эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончания теплокровных и холоднокровных животных (лягушки и мыши). Рассчитаны времена рециклирования синаптических везикул. Созданы модели цикла синаптических везикул в нервных окончаниях лягушки и мыши, которые согласуются с данными электрофизиологических и оптических экспериментов. Разработан оригинальный программный комплекс, позволяющий эффективно решать задачу поиска оптимальных значений параметров модели везикулярного цикла и определять степени согласованности различных моделей с опытными данными. Отличительной особенностью разработанного математического подхода
является система описания процесса захвата и потери красителя нервными окончаниями, которая дополняет традиционное описание взаимодействие везикулярных пулов.
Обосновано разделение везикул в двигательных нервных окончания лягушки на три пула, восстанавливающихся посредством двух типов эндоцитоза. Также показано, что в двигательных нервных окончания мыши везикул разделены на два пула, которые возобновляются посредство эндоцитоза одного типа.
Впервые благодаря сравнению и совместному анализу результатов электрофизиологических экспериментов и экспериментов с применением флуоресцентного красителя FM 1-43 показана возможность параллельной работы везикулярных пулов в двигательных нервных окончаниях лягушки. Кроме того, проведено разделение между двумя типами эндоцитоза, дающими начало разным путям рециклирования синаптических везикул.
Научно-практическая ценность. Настоящая работа является фундаментальным исследованием в области физиологии и биофизики синапсов. Теоретическое значение исследования заключается в расширении представлений об устройстве везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах. Результаты проведённого исследования позволяют развить современные представления о механизмах рециклирования синаптических везикул.
Накопление знаний о процессах рециклирования, транспорта и кластеризации синаптических везикул, позволит выйти на новые механизмы регуляции силы нейронов и синаптических контактов, их формирования и сохранения. Это может явиться важным ключом в понимании многочисленных интегративных функций головного мозга, лежащих в основе памяти и когнитивных процессов, а также разобраться в патогенезе некоторых психических и неврологических заболеваний.
Созданная модель везикулярного цикла и разработанный метод оптимизации параметров модели могут быть применены в различных исследованиях, связанных изучением передачи сигналов между возбудимыми клетками.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2005, 2007, 2008), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2006, 2007), Пятом форуме европейской нейронауки (Вена -Австрия, 2006), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006), Восточноевропейской конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007).
По теме диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация объемом 99 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, описания и обсуждения результатов исследования, заключения и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 158 названий, из них 8 отечественных и 150 иностранных работ. Диссертация содержит 19 рисунков и 2 таблицы.
