Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. История открытия ASICs и филогения 11
1.2. Гены и субъединичный состав ASICs 15
1.3. Строение и топология
1.3.1. До-кристаллическая эра 18
1.3.2. Пост-кристаллическая эра - Экстраклеточный домен (ЭКД) 22
- Трансмембранный сегмент и ионная пора 24
- Механизм активации канала. 26
1.4. Локализация и участие в физиологических процессах 28
1.4.1. ASICs в мозге 28
1.4.2. Субклеточная локализация 29
1.4.3. ASICs и синаптическая передача 30
1.4.4. Участие в синаптической пластичности 32
1.4.5. Участие в обучении, памяти и тревожных состояниях 33
1.4.6. Участие в патологических состояниях ЦНС - Ишемия головного мозга 36
- Рассеянный склероз 37
- Эпилепсия 38
1.4.7. ASICs и боль 39
1.5. Фармакология ASICs 42
1.5.1. Синтетические соединения 42
1.5.2. Эндогенные модуляторы 47
1.5.3. Токсины из природных ядов 50
1.6. Обоснование работы 56
Глава 2. Материалы и методы исследования 59
Глава 3. Результаты и обсуждения 62
3.1. Действие гидрофобных моноаминов на гомомерные ASICs 62
3.1.1. Действие на ASIC1а каналы 62
3.1.2. Действие на ASIC2а каналы 65
3.1.2. Сравнение действия соединений на нативные и рекомбинантные ASIC1а и ASIC2a каналы 67
3.1.3. Действие на ASIC1b каналы 69
3.1.4. Действие на ASIC3 каналы 71
3.2. Структурно-функциональный анализ 75
3.2.1. Действие аналогов 9-аминоакридина на ASIC1a и ASIC2a каналы 75
3.2.2. Действие аналогов фенилциклогексила на ASIC1a и ASIC2a каналы 78
3.2.3. Действие производных адамантана на ASIC1a и ASIC2a каналы 80
3.2.4. Выводы по структурно-функциональному анализу 83
3.3. Анализ механизмов действия гидрофобных моноаминов на протон-активируемые ионные каналы 84
3.3.1. Сравнение механизмов действия мемантина и 9-аминоакридина на гомомерные ASIC1a каналы 84
- pH-зависимость действия 87
3.3.2. Механизм потенцирующего действия ИЭМ-1921 на ASIC2a каналы 88
- pH-зависимость действия 89
3.3.3. Потенциал-зависимость ингибирующего и потенцирующего действий 90
3.3.4. Сочетание ингибирующего и потенцирующего эффекта в пределах одного канала 92
3.3.4. Выводы по анализу механизмов действия гидрофобных моноаминов 94
3.4. Новый эндогенный модулятор ASICs 95
3.4.1. Действие гистамина на протон-активируемые ионные каналы 96
3.4.2. Действие гистамина на ASIC la каналы 96
-Возможные механизмы потенцирующего эффекта гистамина 98
Глава 4. Заключение 100
Выводы 106
Список литературы
- Локализация и участие в физиологических процессах
- Участие в патологических состояниях ЦНС - Ишемия головного мозга
- Сравнение действия соединений на нативные и рекомбинантные ASIC1а и ASIC2a каналы
- Выводы по анализу механизмов действия гидрофобных моноаминов
Локализация и участие в физиологических процессах
Постоянство внеклеточной среды является необходимым условием гомеостаза нервной системы и организма в целом. Её химический состав должен поддерживаться в строго определённых рамках, обеспечивая нормальную работу клеточных структур. Одним из важнейших показателей, значение которого организму необходимо строго регулировать, является внеклеточная концентрация протонов. У большинства позвоночных в норме этот параметр, или водородный показатель (pH), равняется 7.4, но в результате нормальных или патологических процессов значение его может заметно варьировать. Логично было бы предположить, что в организме на этот случай имеются специальные pH-сенсоры, быстро реагирующие на изменение этого показателя.
Первое упоминание о токах, вызванных быстрым закислением внеклеточной среды, было сделано в 1980-м году Крышталем и Пидопличко (Krishtal & Pidoplichko, 1980). Они показали, что большая часть нейронов, выделенных из спинного и тройничного ганглиев крысы, активируется в ответ на изменение рН омывающего раствора с 7.4 до 6.9. При этом, входящие токи были следствием увеличения проницаемости мембраны для ионов Na+ и К+ (Na+ К+), их амплитуда увеличивалась с повышением концентрации протонов и достигала максимальной в точке pH=5.4. Позже этой же группой советских учёных подобные токи были описаны и в некоторых зонах мозга крысы (Врублёвский и др., 1985). Однако отсутствие избирательных фармакологических агентов и других конкретизирующих методов не позволяло сделать окончательный вывод о существовании нового типа ионных каналов. Доказательство было получено с расцветом молекулярной биологии в середине 90-х годов. Лаздунски с соавторами выделили из мозга крысы участок ДНК, кодирующий последовательность длиной в 526 аминокислоты и экспрессировали комплементарную РНК в ооцитах лягушки Xenopus laevis (Waldmann et al., 1997а). В результате этой манипуляции ооциты стали чувствительны к изменению pH внеклеточной среды: аппликация раствора с pH ниже 6.9 вызывала быстро нарастающий и спадающий вследствие десенситизации ток, подобный тому, который был ранее описан в чувствительных нейронах (Krishtal & Pidoplichko, 1981; Konnerth et al., 1987). Тогда же и было дано название этим рецепторам, характеризующее их как ионные каналы, чувствительные к закислению среды (Acid Sensing Ion Channels или сокращённо ASICs). Это название прочно закрепилось в научной литературе, однако оно не является вполне корректным, поскольку другие ионные каналы также могут реагировать на изменение pH внеклеточной среды. Многие каналы TRP семейства, характеризующиеся полимодальностью активирующих стимулов, изменяют свою активность в присутствии повышенной концентрации протонов (Numata et al., 2011). Кроме того, протоны ингибируют нативные NMDA рецепторы с IC50 в районе pH = 7.2, вследствие чего около 40% каналов неактивны при физиологических значениях рН (Tang et al., 1990; Traynelis & Cull-Candy, 1990). В связи с этим, в данной работе будет использовано альтернативное название ASICs - “протон-активируемые ионные каналы” (proton-gated ion channels), которое также используется в англоязычной литературе и более корректно описывает рассматриваемый тип рецепторов.
Протон-активируемые ионные каналы - это катионные потенциал-независимые, амилорид-чувствительные ионные каналы, активирующиеся в ответ на увеличение внеклеточной концентрации протонов. Основываясь на данных генетического сиквенса и сходстве вторичной структуры белка, ASICs относят к суперсемейству дегенерин эпителиальных натриевых каналов (DEG/ENaC), к которому также принадлежат эпителиальные натриевые каналы (ENaC), FMRF-амид активируемые каналы (FaNaC) беспозвоночных, PPK (pickpocket) каналы Drosophila melanogaster, дегенирины (DEG) Caenorhabitis elegans, а также hiNaC (human intestine Na+ channels - человеческие Na+ каналы кишечника) и BLINaC (brain- liver-intestine amiloride-sensitive Na+ channel -мозговые - печёночные - кишечные амилорид-чувствительные Na+ каналы) млекопитающих (Kellenberger & Shild, 2002). Последние два типа рецепторов не так давно были переименованы в BASIC (bile acid-sensetive ion channels), поскольку было обнаружено, что они активируются под действием желчных кислот (Lefevre et al., 2014). Такое название им было дано потому, что их гомология с ASICs по аминокислотной последовательности несколько выше, чем у эпителиальных натриевых каналов, хотя они не способны активироваться в ответ на понижение рН. Для всех представителей семейства Deg/ENaC каналов характерна общая вторичная структура белка: короткие NH2 и COOH терминальные цитоплазматические концы, два трансмембранных домена (ТМ1 и ТМ2) и большой внеклеточный цистеин-богатый участок, составляющий более 50% всего белка (Canessa et al., 1994a; Jasti et al., 2007). Недавнее исследование эволюции генов суперсемейства DEG/ENaC, показало, что эти гены встречаются во всех секвенированных геномах представителей царства Животных (Metazoa). Кроме того, DEG/ENaC гены были найдены в эукариотическом микроорганизме Naeglaria gluberi (Studer et al., 2011). Согласно другому генетически эволюционному исследованию, проведённому большой группой учёных и опубликованному в журнале Nature (Putnam et al., 2008), гены ASICs accn1-4 и четыре гена ENaC (, , и ) каналов были получены путём двух-раундовой дупликации цельного генома на этапе зарождения позвоночных животных. Напротив, ген accn5, кодирующий BASIC каналы, обнаруживается задолго до появления позвоночных. Интересно, что у млекопитающих не существует ортологов FaNaC генов улитки Helix aspersa или ортологов PPK кодирующих генов Drosophila, что, по всей видимости, указывает на раннюю дивергенцию генов суперсемейства DEG/ENaC каналов (Рис.1.1).
Участие в патологических состояниях ЦНС - Ишемия головного мозга
Экспрессия протон-активируемых каналов с известным субъединичным составом Клетки линии CHO (культура клеток яичника Китайского хомячка) культивировались в CO2 инкубаторе при 37С и 5% содержанием CO2. Среда для роста клеток состояла из раствора DMEM/F12 (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) с добавлением 10% эмбриональной коровьей сыворотки и 1% стрептомицин/пенициллина. Трансфекция клеток плазмидами проводилась при помощи реагента «Липофектамин 2000» (Invitrogen, USA), в соответствии с протоколом производителя. Клетки линии CHO высевались на стёкла площадью не более 25 мм2, равномерно распределённые по дну чашки Петри диаметром 35 мм. Для экспрессии гомомерных каналов ASICs, клетки подвергали трансфекции с использованием 0.5 мкГ плазмиды, несущей ген, кодирующий нужную субъединицу (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a или ASIC3), совместно с 0.5 мкГ плазмиды, кодирующей последовательность флуоресцентного белка GFP - для дальнейшей идентификации. Плазмиды, кодирующие ASICs были любезно предоставлены нашей лаборатории доктором А. Старущенко. Электрофизиологические эксперименты проводились через 36-72 часа после трансфекции. Трансфецированные клетки детектировались по зелёному флуоресцентному свечению, при помощи микроскопа Leica DM IL (Leica Microsystems, Germany). Регистрация трансмембранных ионных токов
Токи, вызванные быстрым закислением среды, регистрировали при помощи метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурации «целая клетка», позволяющего измерить интегральный мембранный ток через интересующий тип каналов. Для этого был использован усилитель EPC-8 (HEKA Electronics, Germany); сигнал фильтровался в полосе частот 0-5 КГц и оцифровывался с частотой дискретизации 1 кГц, при помощи ЦАП-АЦП LIH 8+8 (HEKA Electronics, Germany), и, далее записывался на персональный компьютер, при помощи программного обеспечения Patchmaster того же производителя (HEKA Electronics, Germany). Все эксперименты проводились при комнатной температуре (23-25С). Протоколы аппликации растворов, используемые для оценки взаимодействия тестируемых соединений с разными типами каналов, описаны в соответствующих пунктах раздела «Результаты».
Используемые растворы
Микропипеточный раствор содержал (в мМ): CsF 100, CsCl 40, NaCl 5, CaCl2 0.5, EGTA 5, HEPES 10 (pH доводился до 7.2 добавлением CsOH). Внеклеточный раствор содержал (в мМ): NaCl 143, KCl 5, CaCl2 2.5, D-глюкоза 10, HEPES 10, MES 10, (pH доводился до 7.35 добавлением NaOH). Все растворы фильтровались через мелкопоровые целлюлозные мембраны, при помощи вакуумного стеклянного фильтра (Sartorius AG, Germany).
Растворы с низкими значениями pH, которые использовались для активации каналов, приготовлялись из базового внеклеточного раствора путём добавления HCl. Тестируемые моноамины, были синтезированы ранее по нашему заказу В.Е. Гмиро в НИИ Экспериментальной Медицины города Санкт-Петербурга. Все остальные, используемые в данной работе и коммерчески доступные соединения, были приобретены в фирме Sigma (Sigma-Aldrich, USA). Для получения стокового раствора соединения с концентрацией 5х10-2 М, навеска его кристаллической формы растворялась в бидистиллированной воде. Далее, нужный объём стокового раствора добавлялся к рабочим растворам с разными значениями рН. При приготовлении растворов тестируемых соединений, в каждом конкретном случае проверялся pH полученной смеси и, при обнаружении сдвига, доводился до необходимого при помощи 0.1 н раствора HCl или 0.2 н раствора NaOH. Для подачи тестовых соединений использовалась многоканальная система быстрой аппликации веществ ALA-VM8 (ALA Scientific Instruments, USA) с микроманифолдом на конце. Интервал между тестовыми аппликациями составил 60 с.
Методы обработки и представления данных Первоначальная обработка данных производилась при помощи программного обеспечения pClamp 10 (Molecular Devices, USA). Статистический анализ данных проводился в программе Microcal Origin 6.0 (OriginLab, USA). Для определения параметров IC50 и EC50 использовалось уравнение Хилла. Все данные представлены в виде «значение ± стандартное отклонение» на основе, как минимум, 5 экспериментов. Статистическая значимость эффектов была проанализирована при помощи парного t-теста с p=0.05 (значение амплитуды ответа в присутствии тестируемого соединения относительно контроля). Анализ формы ответа проводился путём измерения времени нарастания тока с 10% до 90% от максимальной амплитуды, и расчётом постоянной времени спада ответа, при помощи моноэкспоненциальной аппроксимации по методу наименьших квадратов.
Для наглядности оценки изменения кинетики ответа под действием изучаемых соединений применялся метод нормализации токов по амплитуде (Рис. 3.12). Для этого вычислялось отношение контрольного тока в ответ на pH, к току в присутствии исследуемого соединения. Меньший по амплитуде ток перемножался на полученное отношение и, в результате, мы получали ответы равные по амплитуде. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1. Действие гидрофобных моноаминов на гомомерные ASIC каналы
Как говорилось ранее, уровень экспрессии разных субъединиц протон-активируемых ионных каналов сильно различается в зависимости от локализации. Так в ЦНС позвоночных преобладают субъединицы ASIC1a и ASIC2a, а для ПНС и DRG-нейронов характерно преобладание субъединиц ASIC3 и ASIC1b. Представляется удобным изложить полученные данные в соответствии с вышеупомянутыми различиями.
3.1.1. Действие гидрофобных моноаминов на гомомерные ASIC1a каналы Понижение pH внеклеточного раствора с исходного уровня 7.4 приводило к появлению транзиентных токов через клетки, несущие плазмиду ASIC1a. Нетрансфецированные клетки, не экспрессирующие ASICs, не отвечали на предъявление закисленного раствора. Кинетика ответа характеризовалась быстрым ( =0.05±0.01 с, n=9) нарастанием до максимальной амплитуды и более медленным спадом ( =1.6±0.5 с, n=9) до незначительного уровня стационарного тока, трудно отличимого от фонового шума. Амплитуда ответа увеличивалась с увеличением концентрации протонов в предъявляемом растворе. Значение pH50 было установлено в точке 6.1±0.3 (n=5) (Рис. 3.1. А), что соответствует ранее полученным данным Хесселагера и соавторов (Hesselager et al., 2004). Ответы снижались под действием классического ингибитора протон-активируемых ионных каналов - амилорида (10 мкМ), на 54±4% (n=5) при совместной аппликации с раствором, имеющим pH 6.5 (Рис. 3.1. Б). Все протестированные соединения не вызывали токов при совместной аппликации с нейтральным (pH 7.4) раствором. Первоначальное тестирование веществ производилось в условиях совместной аппликации с активирующим раствором, имеющим pH 6.5. Максимальная тестируемая концентрация для всех веществ на всех исследованных комбинациях каналов, вне зависимости от эффекта, равнялась 1000 мкМ.
Из четырёх соединений, ранее протестированных на нативных каналах, только ИЭМ-1921 не проявил активности в отношении гомомерных ASIC1a каналов, даже в концентрации 1000 мкМ. Три других – 9АА, ИЭМ-2117 и мемантин вызывали концентрационно-зависимый ингибирующий эффект разной степени выраженности. Наиболее активным ингибитором оказался 9-аминоакридин. В концентрации 1000 мкМ 6.5+амилорид 10 мкМ
Сравнение действия соединений на нативные и рекомбинантные ASIC1а и ASIC2a каналы
В данной работе было охарактеризовано действие нового химического класса лигандов протон-активируемых ионных каналов, включающего в себя соединения простой химической структуры, состоящей из небольшой гидрофобной группировки и аминогруппы, и вследствие этого названные одним общим термином – гидрофобные моноамины.
Соединения из числа гидрофобных моноаминов, исследованные в данной работе, показали свою активность в отношении всех функционально-активных гомомеров протон-активируемых каналов. Эти соединения были способны потенцировать, ингибировать и даже активировать ASICs, в зависимости от субъединичного состава. ИЭМ-1921 потенцировал нативные ASICs и гомомерные ASIC2a каналы, но был неактивен в отношении ASIC1a. 9-аминоакридин был наиболее активным ингибитором ASIC1a и нативных каналов, но никак не влиял на гомомеры ASIС2а. Два других соединения, ИЭМ-2117 и мемантин, ингибировали ASIC1a и потенцировали ASIC2a каналы, однако в отношении нативных ASICs эффект их был разнонаправлен.
Действие всех четырёх веществ на ASIC1b каналы, являющиеся, как и ASIC1a, продуктом альтернативного сплайсинга гена accn2, во многом напоминало действие на ASIC1a – 9АА и мемантин ингибировали эти каналы, а ИЭМ-1921 и ИЭМ-2117 не влияли на активность гомомеров ASIC1b.
Все четыре соединения эффективно потенцировали стационарный компонент ASIC3-вызванного тока, однако ИЭМ-1921 и 9АА, в то же время, ингибировали пиковый компонент ответа. То есть действие гидрофобных моноаминов относительно ASIC3 каналов носило комплексный характер и вызывало разнонаправленные эффекты в пределах одного канала. Кроме того, из всех ASICs, только ASIC3 гомомеры могли быть активированы гидрофобными моноаминами; ИЭМ-2117 концентрационно-зависимо вызывал стационарный входящий ток, при совместной аппликации с нейтральным клеточным раствором. Стоит сказать, что возможность быть активированными лигандами, отличными от протонов, на данный момент описана только для ASIC3 каналов. GMQ и амилорид способны активировать эти каналы в нейтральной среде, приблизительно с той же эффективностью, что и ИЭМ-2117, вызывая стационарный входящий ток (Li et al., 2011; Yu et al., 2011). Сайт-направленный мутагенез показал, что активирующий эффект GMQ связан с целостностью протон-нечувствительного сайта, расположенного в palm домене, который, вполне вероятно, присутствует только в ASIC3 каналах и отвечает за их неспецифичекую активацию.
Найденные нами соединения могут быть использованы в качестве фармакологических инструментов, например, для определения субъединичного состава протон-активируемых ионных каналов, преимущественно экспрессированных в той или иной клетке. Так, например, выраженное ингибирующее действие 9АА на быстродесенситизирующийся ток через клетку, вызванный аппликацией кислого раствора, будет свидетельствовать о присутствии достаточного количества ASIC1a гомомерных каналов в клетке. Выраженное потенцирующее действие ИЭМ-1921, напротив, укажет на преимущественную экспрессию гомомеров ASIC2a. Однако необходимым шагом в сторону такого практического применения гидрофобных моноаминов, станет исследование их действия на гетеромерных каналах, встречающихся в нейронах центральной нервной системы.
Благодаря исследованию соединений отдельно на гомомерных каналах, образованных субъединицами ASIC1a и ASIC2a, преимущественно эксперессированых в ЦНС позвоночных, нам удалось установить, что действие на нативные рецепторы не является простой суммой эффектов веществ на две эти субъединицы. При этом, согласно нашим результатам, справедливо предположить, что ASIC1a, входящая в состав нативного рецептора, отвечает за ингибирующее действие гидрофобных моноаминов, а ASIC2a вносит основной вклад в положительную модуляцию нативных каналов этими соединениями. Однако последующий структурно функциональный анализ, а также анализ механизмов действия соединений показали, что всё гораздо сложнее и что в пределах одной субъединицы, по всей видимости, существует несколько сайтов связывания для гидрофобных моноаминов. Кроме того, в некоторых случаях, молекула лиганда способна одновременно связываться с двумя различными сайтами, один из которых отвечает за потенциацию, а другой – за ингибирование ионного канала.
В пользу указанного предположения говорят следующие факты: во-первых, наличие потенциал-зависимого и потенциал-независимого механизмов ингибирования протон-активируемых ионных каналов мемантином и 9-аминоакридином, соответственно. Это обстоятельство указывает на возможность гидрофобных моноаминов связываться как минимум в двух различных областях рецептора. Один из них находится на поверхности клетки и не зависит от потенциала мембраны (в этом месте, предположительно, связывается 9АА), а другой отвечает за потенциал-зависимое ингибирование мемантином и, соответственно, должен находиться в области трансмембранных сегментов, испытывая влияние мембранного электрического поля. Во-вторых, уменьшение потенцирующего эффекта ИЭМ-1921 относительно ASIC2a каналов при гиперполяризации, можно объяснить сосуществованием потенциал независимого потенцирования, сайт для которого находится вне электрического поля мембраны в экстраклеточном домене рецептора, и потенциал-зависимого ингибирования, которое возможно наблюдать только при изменении потенциала мембраны.
Поскольку мемантин и ИЭМ-1921 имеют приблизительно одинаковый размер молекул, а также V-образную форму гидрофобной головки, можно предположить, что сайт связывания внутри канала у них общий и находится в области трансмембранных сегментов. В случае потенциал-независимых эффектов возможен вариант, что 9АА и ИЭМ-1921 связываются в одном месте в области «кислотного кармана» и протон-узнающего сайта, поскольку оба соединения демонстрируют конкурентно-подобные механизмы действия, хоть и для разномодальных эффектов. То есть, возможно, что в случае 9АА, связывание молекулы лиганда в области протон-узнающего сайта, препятствует дальнейшему связыванию протонов. В случае ИЭМ-1921, связывание протона аминогруппы лиганда в области «кислотного кармана», напротив, приводит к частичной активации рецептора, вследствие чего, для дальнейшего открытия канала требуется меньшее количество протонов. Однако каждое из этих предположений нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.
Выводы по анализу механизмов действия гидрофобных моноаминов
С точки зрения механизмов, особый интерес представляет разнонаправленный эффект 9-аминоакридина на пиковый и стационарный компоненты ответа ASIC3 гомомерных каналов. С целью разобрать это явление более подробно, была измерена концентрационная зависимость комплексного действия 9АА отдельно для каждого эффекта, при совместной аппликации с раствором, имеющим pH 6.85, и вызывающим умеренную активацию рецептора (Рис. 3.16.Б). Как уже говорилось выше, EC50 для потенцирующего эффекта на стационарный компонент равнялся 120±20 мкМ (n=6), коэффициент Хилла был равен 2.3±0.4 (n=6). Для кривой концентрационной зависимости ингибирования пикового компонента, параметры, установленные посредством уравнения Хилла, были другими: IC50 = 94±13 мкМ и nH= 1.2±0.2 (n=6). То есть для двух противоположных эффектов мы получили разные показатели эффективности (EC50) и кооперативности связывания лиганда.
Действие 9АА на стационарный и пиковый компоненты тока через ASIC3. А, Примеры токов ASIC3 каналов в контроле (pH 6.85) и в присутствии разных концентраций 9АА. Видно, что с увеличением концентрации 9АА, возрастает ингибирование пика и потенциация плато. Б, концентрационная зависимость действия 9АА на стационарный и пиковый компоненты.
Подобное явление можно объяснить наличием двух различных сайтов связывания в пределах белка ASIC3, имеющих разные показатели сродства и моду действия. Кроме того, такое объяснение является довольно правдоподобным, поскольку нечто схожее было показано для комплексного действия амилорида. Помимо общепринятого ингибирующего эффекта этого соединения на протон-активируемые ионные каналы, был также обнаружен активирующий/потенцирующий эффект амилорида, специфичный для ASIC3 содержащих рецепторов. Было также предположено, что этот положительный модулирующий эффект зависит от непротон-связывающего сайта, расположенного в экстраклеточной части рецептора в области palm домена, и отличен от сайта связывания, отвечающего за ингибирующее действие амилорида (Li et al., 2011). 3.3.4. Выводы по анализу механизмов действия гидрофобных моноаминов
1. Cуществует как минимум два принципиально различных механизма ингибирования ASICs: конкурентно-подобный, характерный для действия 9 аминоакридина и не зависящий от потенциала мембраны клетки; и потенциал зависимый механизм, сильно напоминающий действие блокаторов открытого канала, который был характерен для ингибирующего действия мемантина.
2. Потенцирующее действие ИЭМ-1921, вероятно, носит комплексный характер, сочетающий потенцил-зависимое ингибирование и потенциал-независимое потенцирование, механизм которого состоит в увеличении сродства к протонам или в частичном агонизме.
3. Оба соединения, мемантин и ИЭМ-1921, имеющие V-образное строение гидрофобной части, продемонстрировали потенциал-зависимый ингибирующий эффект. Плоская структура 9АА подобным эффектом не обладала, зато была способна к конкурентно-подобному ингибированию.
Наличие разных по механизму и направленности действия эффектов объясняет, почему при анализе структурно-функциональных отношений не было выявлено однозначных детерминант действия. При определении общей активности соединения, мы видим сумму различных эффектов, имеющих разные структурные детерминанты. 3.4. Новый эндогенный модулятор ASICs
Одной из основных стратегических задач выполненного исследования являлся поиск эндогенных моноаминов, способных модулировать работу протон-активируемых ионных каналов. Идея заключалась в том, что ASICs довольно широко распространены в ЦНС позвоночных и, следовательно, должны нести некую функциональную нагрузку. При этом они не могут быть активированы теми значениями pH, которые сопровождают нормальные физиологические процессы, а полагать, что эти белки в таком количестве экспрессированы «на всякий случай» не представляется возможным, учитывая структурную и энергетическую экономичность организации живых систем. Соответственно, мы предположили наличие положительных модуляторов этих ионных каналов среди постоянно присутствующих или периодически выделяющихся во внеклеточную среду соединений.
Благодаря проведённому структутрно-функциональному исследованию, нам удалось обнаружить эффективные потенциаторы как ASIC1a, так и ASIC2a каналов. Далее, просматривая структурные формулы эндогенных моноаминов на наличие сходства с исследованными нами структурами, мы обнаружили, что гистамин во многом схож по строению с потенциатором ASIC1a и ASIC2a каналов – ИЭМ-2044 (Таб. 3.5).
Гистамин и ИЭМ-2044 имеют различающуюся небольшую гидрофобную часть и абсолютно одинаковый гидрофильный конец, состоящий их двух метиленовых спейсеров, соединяющих гидрофобную голову с аминогруппой. Руководствуясь этим сходством, было решено проверить способность гистамина потенцировать протон-активируемые ионные каналы. 3.4.1. Действие гистамина на протон-активируемые ионные каналы
Для проведения экспериментов был использован гистамина дигидрохлорид (Sigma-Aldrich, USA), приготовленный далее в соответствие с протоколом, приведённом в разделе «методы». Первоначальное исследование активности проводилось на всех четырёх гомомерных ASICs в коаппликации с активирующим раствором, имеющим pH, как и в ранее проведённых экспериментах: для ASIC1a – pH 6.5, ASIC1 – pH 6.2, ASIC2a – pH 5.0 и ASIC3 – pH 6.85. Для начального исследования была взята заведомо высокая концентрация вещества – 1000 мкМ. При совместной аппликации с нейтральным раствором, 1000 мкМ гистамина не вызывали входящих токов через ASICs.
Токи через гомомерные ASIC1b, ASIC2a и ASIC3 не подвергались какой-либо модуляции в протоколе коаппликации с гистамином (Рис.3.17). Однако 1000 мкМ гистамина потенцировали ASIC1a каналы более чем в 2 раза (на 126±40%, n=8), при совместной аппликации с раствором, имеющим pH 6.5. То есть гистамин оказался способным избирательно потенцировать ASIC1a каналы.
Кривая концентрационной зависимости действия гистамина на ASIC1a каналы показала, что 10 мкМ этого соединения способны достоверно потенцировать протон-вызванные токи (pH 6.5), увеличивая их на 58±28% (n=8). При увеличении концентрации соединения, потенцирующий эффект возрастал (Рис. 3.17.Д). Поскольку насыщающая концентрация, при этом значении pH раствора, не была достигнута, поэтому параметр EC50 установить не удалось.
Потенцирующее действие гистамина на ASIC1a каналы сильно зависело от концентрации протонов в среде. Чем выше был pH активирующего раствора (концентрация протонов в среде ниже), тем сильнее проявлялся потенцирующий эффект. Так, одна и та же концентрация гистамина 1000 мкМ потенцировала ответ на аппликацию раствора, имеющего pH 7.0, в 3 раза (на 190±50%, n=6), а ответ на аппликацию раствора с относительно более высоким содержанием протонов (pH 5.0) – на 14±13% (n=5) (Рис. 3.18.А, Б). А