Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1.1. Медицинское значение трансплантации эндокринных желёз 8
1.2. Реакция отторжения трансплантата 8
1.3. Типы иммунологической толерантности 12
1.3.1. Портальная донор-специфическая толерантность (ДСТ) 13
1.4. Особый иммунологический статус печени 14
2. Протеасомы 18
2.1.1. Цилиндрин 19
2.1.2. Мультикаталитический протеазный комплекс 20
2.2. Каталитический механизм 22
2.3. Структура протеасом 27
2.3.1. Альфа-субъединицы 27
2.3.2. Бета-субъединицы и каталитические активности протеасом 27
2.3.3. Регуляторы 20S протеасомы 30
2.4. Номенклатура субъединиц протеасомы 32
2.5. Функции протеасом 35
2.5.2. Функции иммунных протеасом 36
2.5.2.1. Участие иммунных протеасом в селекции Т-лимфоцитов. 36
2.5.2.2. Иммунные протеасомы и презентация антигена. 38
2.5.2.3. Запуск иммунного ответа на уровне NFB и участие иммунных протеасом в образовании цитокинов 38
3. Возможная роль протеасом в развитии портальной толерантности. 40
2 Материалы и методы 42
1. Подготовка животных 42
2. Определение гормонов в сыворотке крови животных 43
3. Получение ультратонких срезов печени и трансплантата 43
4. Гистологическая окраска ультратонких срезов 44
5. Иммуногистохимическое окрашивание срезов 44
6. Подготовка образцов для определения активностей протеасом и иммуноблоттинга 45
7. Иммуноблоттинг 45
8. Измерение ферментативных активностей протеасом 46
9. Определение концентрации белка 47
10. Выделение мононуклеарных клеток печени, свободных от гепатоцитов 47
11. Проточная цитофлуориметрия. 48
12. Разработка нативного электрофореза протеасом 49
12.1. Подготовка гомогената 49
12.2. Удаление нуклеиновых кислот из образца 50
12.3. Проведение нативного электрофореза с последующей детекцией протеасом 51
13. Статистическая обработка данных 52
3 Результаты 53
1. Протеасомы в развитии донор-специфической толерантности 53
1.1. Иммунные протеасомы и динамика развития ДСТ в печени 53
1.2. Трансплантация яичника 57
1.3. Трансплантация щитовидной железы 64
2. Нативный электрофорез протеасом 78
2.1. Разработка метода подготовки образцов 78
2.2. Анализ структуры иммунных протеасом печени 82
4 Обсуждение 84
Динамика развития донор-специфической толерантности в печени 84
Протеасомы при трансплантации эндокринных желез после индукции донор специфической толерантности 86
Нативный электрофорез протеасом печени 90
Заключение 94
Выводы 95
Список сокращений 96
Список литературы 98
- Реакция отторжения трансплантата
- Трансплантация яичника
- Разработка метода подготовки образцов
- Нативный электрофорез протеасом печени
Реакция отторжения трансплантата
Иммунологическое отторжение - это основная проблема при аллотрансплантации тканей и органов [Ярилин, 2010]. Иммунная природа чужеродных трансплантатов была доказана в 40-е годы прошлого века П.Медаваром [Billingham, Medawar, 1948a; Billingham, Medawar, 1948b; Medawar, 1957]. Отторжение трансплантатов происходит на 10-12 сутки при различиях между донором и реципиентом по генам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), сопровождается нарушением питания трансплантата вследствие тромбоза сосудов и некрозом ткани. При различиях по слабым локусам ГКГ реакция развивается медленнее и иногда приобретает хронический характер с постепенным отмиранием клеток трансплантата в течение нескольких месяцев и их замещением клетками реципиента.
Отторжение трансплантата сочетает черты цитотоксической и воспалительной форм иммунного ответа. Оно протекает с участием как CD8+, так и CD4+ Т-лимфоцитов. Первые ответственны за гибель клеток трансплантата; вторые обеспечивают развитие воспаления, приводящего к нарушению питания трансплантата и активации врожденного иммунитета [Ярилин, 2010].
Т-лимфоциты не способны напрямую распознавать и взаимодействовать с чужеродными антигенами (бактериями, вирусами, клетками, тканями или органами), они способны узнавать антиген только с помощью антиген-представляющих клеток (АПК) в контексте молекул ГКГ I или II классов [Azimzadeh и др., 2011]. Показано, что при развитии ответа на трансплантат Т-лимфоциты распознают молекулы ГКГ двумя путями – прямым и опосредованным через представление АПК реципиента [Caballero и др., 2006].
Прямое распознавание агентов происходит при активации CD8+ Т-лимфоцитов. В этом случае Т-клеточный рецептор напрямую взаимодействует с чужеродной молекулой ГКГ класса I, представленным на аллогенной дендритной клетке – клетке-пассажире. Полагают, иммунный ответ запусказется за счет особенностей структуры молекулы ГКГ, отличающейся от ГКГ хозяина, а природа пептида вообще не имеет значения. Очевидно, что аллогенная дендритная клетка должна поставлять костимулирующие сигналы, необходимые для полноценной активации Т-лимфоцитов [Azimzadeh и др., 2011; Caballero и др., 2006; Lechler и др., 2005; Ярилин, 2010]. Представление аллоантигена собственными АПК может протекать по двум механизмам: полупрямому и непрямому [Azimzadeh и др., 2011; Caballero и др., 2006]. В последнем случае оно реализуется по классическому пути: молекулы аллогенных клеток (в том числе молекулы ГКГ) захватываются дендритными клетками в ходе эндоцитоза, расщепляется в их эндосомах и встраиваются в состав молекул ГКГ класса II. Такой путь представления антигена обычно происходит при активации CD4+ Т-лимфоцитов.
Третий путь представления аллоантигена, названный полупрямым, сочетает в себе черты двух описанных механизмов. В этом случае мембранные компоненты АПК донора, включая комплексы ГКГ с пептидами, в результате межклеточных контактов или через экзосомы могут встраиваться в мембрану АПК реципиента. Эти антигенпрезентрирующие клетки, содержащие химерные молекулы ГКГ, могут напрямую активировать Т-лимфоциты реципиента [Azimzadeh и др., 2011; Caballero и др., 2006].
Формирующиеся эффекторные Т-клетки обоих типов поступают в циркуляцию, мигрируют в очаги воспаления. Наряду с этими клетками в трансплантат мигрируют естественные киллеры (ЕКК), а также макрофаги. В результате происходит лимфоидная инфильтрация – характерное морфологическое проявление трансплантационной реакции.
Реакция, опосредованная Т-клетками, складывается из двух составляющих: цитотоксической и воспалительной. Типичная цитотоксическая реакция опосредуется ЕКК и цитотоксическими Т-лимфоцитами. Участие ЕКК связано с отсутствием сингенных молекул ГКГ на клетках мишенях. Цитотоксические Т-лимфоциты напрямую распознают молекулы ГКГ класса I донора на поверхности клеток трансплантата, и происходит цитолиз по перфориновому [Stanley, Luzio, 1988] и Fas-зависимому механизмам [Nagata, 1994].
Клеточный ответ воспалительного типа опосредуется макрофагами и CD4+ Т-клетками и создает фон для цитотоксического ответа. Т-лимфоциты выделяют провоспалительные интерферон гамма (ИФН) и фактор некроза опухоли (ФНО). Активированные макрофаги выделяют провоспалительные цитокины, активные формы кислорода, оксид азота, ферменты и другие факторы, участвующие в разрушении трансплантатов. Продукты макрофагов запускают развитие локального воспаления, приводящее к нарушению микроциркуляции, формированию тромбов и другим изменениям, выражающимся в нарушении питание трансплантата и его отторжении [Ярилин, 2010].
Два принципиально разных подхода могут быть использованы для замедления отторжения трансплантата: иммуносупрессивная терапия, неспецифически подавляющая иммунный ответ на аллоантигены, и создание специфической толерантности к трансплантату. Изучение механизмов индукции и развития иммунной толерантности реципиента к клеткам и тканям донора является актуальной задачей современной медицины и биологии.
Трансплантация яичника
Основной задачей было описание изменений, происходящих с иммунными протеасомами в модели развития иммунологической толерантности к трансплантату яичников. Эффекты изучали на отдаленных сроках после трансплантации (30 дней), когда должна завершиться острая фаза отторжения и определиться судьба аллотрансплантата. Схема эксперимента и описание групп животных приведены в разделе Материалы и методы (подготовка животных, рис. 9Б). Об успешности индукции толерантности судили по приживаемости трансплантата.
Овариоэктомия у крыс приводит к снижению концентрации эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови на 78% и 88%, соответственно, от значений в контрольных животных (рис. 13 Д, Е). Аллотрансплантация овариальной ткани повышает концентрацию прогестерона даже у животных без индукции портальной толерантности по сравнению с овариоэктомированными животными, однако уровень эстрадиола остается низким. У животных с индукцией портальной толерантности не происходит полной компенсации уровня половых гормонов, однако содержание прогестерона и эстрадиола выше, чем у животных остальных экспериментальных групп. Содержание прогестерона составил 73%, а эстрадиола – 44% от интактного контроля (рис. 13 Д, Е).
Гистологический анализ овариальной ткани у животных без индукции ДСТ выявил характерные признаки отторжения трансплантатов. Отмечена диффузная инфильтрация лимфоцитами, а также выраженный лимфоцитарный барьер между паренхимой почки и и тканью трансплантата. Кроме того, происходит нарушение характерной структуры ткани яичников и замещение ее соединительной тканью (рис. 13Б).
Гистологический анализ трансплантатов овариальной ткани у животных с ДСТ выявил морфологическую структуру яичников, характерную для половозрелых животных (рис. 13А). На срезах присутствуют фолликулы различной степени зрелости и желтые тела, – показатели функциональной активности данного трансплантата (рис. 13В, Г). Кроме того, в данных трансплантатах отмечено формирование кистоподобных полостей с прозрачным внутренним содержимым, выстланных высокопризматическим эпителием. В отличие от отторгающихся трансплантатов, в прижившихся трансплантатах практически отсутствает лимфоцитарный барьер между тканью почки и трансплантата.
Таким образом, по результатам гистологического анализа можно заключить, что при аллотрансплантации овариальной ткани под капсулу почки без использования иммуносупрессии наступает острое отторжение трансплантата. При аллотрансплантации с предварительным введением клеток селезёнки донора интрапортально проиходит приживление трансплантата яичника.
В осветленных гомогенатах селезёнки, печени и трансплантата яичника проводили измерение химотрипсин- и каспазаподобной активностей протеасом. В селезёнке всех групп животных не наблюдается значимого изменения ни одной из измеряемых активностей (Рис. 14 А, Б центральный столбик в каждой группе).
В печени крыс с индукцией ДСТ не обраружено разницы в химотрипсинподобной активности протеасом по сравнению с активностью в печени контрольных крыс. Однако в печени крыс без индукции ДСТ с отторгнутым трансплантатом (рис. 14А) отмечена более низкая аналогичная активность, чем во всех остальных исследуемых группах. Каспазаподобная активность увеличена в печени крыс обеих экспериментальных групп по сравнению с контрольными группами, причем в печени индуцированных крыс данная активность максимальна (рис. 14Б).
В трансплантатах яичников отмечено значительное увеличение химотрипсин-и каспазаподобной активностей протеасом по сравнению с контрольными неонатальными яичниками. В группах животных с трансплантацией ткания яичника изменение исследуемых активностей носит разнонаправленный характер Так, химотрипсинподобная активность ниже, а каспазаподобная активность выше в ткани, замещающей отторгнутый трансплантат, по сравнению с прижившимся трансплантатом (рис. 14).
Содержание иммунных протеасом и общего пула протеасом (конститутивные + иммунные протеасомы) оценивали методом иммуноблоттинга осветленных гомогенатов печени, селезёнки и трансплантата яичника или ткани, его заменяющей. Количество иммунных протеасом в селезёнке и печени определяли с применением антител к иммунным субъединицам LMP7 и LMP2 протеасом. Количество субъединицы MECL1 косвенно оценивали по количеству LMP2, так как обе субъединицы совместно встраиваются в иммунную протеасому [Griffin и др., 1998; Groettrup и др., 1997]. Для оценки тотального пула протеасом использовали комбинированные тела к альфа-субъединицам протеасом 1,2,3,5,6,7 или к субъединице 5, присутствующей в 20S-субчастиц всех типов протеасом.
Обнаружено увеличение содержания как иммунных протеасом (LMP2, LMP7), так и общего пула протеасом в селезёнке всех экспериментальных групп по сравнению с нативным контролем (Рис. 15).
Принципиально иная картина характерна для печени и трансплантатов. Так, в печени животных с индукцией ДСТ увеличивается содержание иммунной субъединицы LMP2 по сравнению с печенью животных контрольных групп и животных без ДСТ (Рис. 15), причем количество этой субъединицы в печени последней группы даже ниже, чем у контрольных животных. Напротив, содержание иммунной субъединицы LMP7 повышено у обеих экспериментальных групп и максимально в печени крыс без индукции ДСТ. Тотальный пул протеасом остается постоянным в печени всех исследуемых групп животных (Рис. 15).
Разработка метода подготовки образцов
Мы сравнили различные буферные системы для экстракции протеасом из образца. Выход протеасом при рН 7.0-7.5 был практически вдвое выше, чем при рН 5.5-6.0. Лучшими экстрагирующими свойствами обладают 50мМ буферы Трис-НСl и Na-фосфатный буфер. Оптимальная ионная сила достигалась добавлением 100мМ NaCl, известно, что более высокая ионная сила способна вызвать диссоциацию 11S комплекса от 20S протеасомы [Chu-Ping и др., 1992]. Для последующих экспериментов был использован буфер 100 мМ Hepes-Na, pH 7,15, 10% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ.
Следующим этапом подготовки образца к нативному электрофорезу было удаление нуклеиновых кислот. Для решения этого вопроса можно воспользоваться разницей в физико-химических свойствах протеасом и нуклеиновых кислот (размер, заряд и т.п.).
Основываясь на разнице в размерах протеасом и нуклеиновых кислот, можно предположить, что частично очищенный препарат протеасом может быть получен в ходе гель-фильтрации на носителе с подходящим размером пор. И действительно, гель-фильтрация с использованием сефарозы-2В показала наилучшее разделение фракции нуклеиновых кислот и протеасом по сравнению с остальными использованными методами (рис. 28, А). Недостатками подхода являются сильное разбавление образца и частичне фракционирование протеасом в ходе гель-фильтрации. Так как наш метод проведения нативного электрофореза позволяет наносить 30 мкл образца на дорожку, то подобный способ подготовки образца не позволяет получить репрезентативной картины совокупности всех форм протеасом. Возможое решение проблемы – проведение концентрирования образца, используя, например, фильтры Millipore UFC510024, – может в определенной степени удорожить анализ.
Другой подход основан на разнице в электрофоретических свойствах белков и нуклеиновых кислот. Известно, что электрофоретическая подвижность частиц зависит от заряда, массы и формы частиц. Так, нуклеиновые кислоты, имеющие молекулярную массу больше 1 МДа, будут двигаться в электрическом поле быстрее, чем протеасомы (молекулярная масса от 750 кДа до 2.5 МДа) за счет высокого удельного отрицательного заряда. Для разделения проводили электрофорез в 1% агарозе при рН 7.5, данный метод показывал хорошие результаты, но воспроизводимость этого подхода невысока, отдельным до конца не решенным вопросом остается извлечение образца из 1% агарозного геля для дальнейшего анализа в полиакриламидном геле.
Следующим подходом, основанном также на различии заряда нуклеиновых кислот и протеасом, выступало использование анионитов. Исходным постулатом было то, что существует возможность найти условия, при которых нуклеиновые кислоты, несущие высокий отрицательный заряд, будут связываться со слабым анионитом, а протеасомы - нет. Оптимальными условиями оказались рН 7.0 и ионная сила 100мМ NaCl, при данных условиях протеасомы стабильны и связываются с носителем незначительно (потери менее 5%, оценивали с помощью Вестерн-блоттинга, а также сравнения ферментативной активности). Нуклеиновые кислоты связываются анионитом в значительной степени, но не полностью. Данная процедура приводила к существенному улучшению разрешения белковых полос при нативном электрофорезе, однако не такому высокому, как при проведении гель-фильтрации на сефарозе-2В. Метод дает стабильные и воспроизводимые результаты, подготовка пробы после получения осветленного гомогената до запуска электрофореза занимает 45-60 мин. Разбавления образца в ходе данной обработки не происходит, что позволяет следить за совокупностью всех форм протеасом в образце, а не за отдельными фракциями, как в случае применения гель-фильтрации.
Мы предположили, что недостаточная эффективность осаждения нуклеиновых кислот с помощью ДЭАЭ-сефарозы возникает из-за геометрии матрицы. Тогда нами были синтезированы аниониты (спермидин выступал в качестве активной группы) на основе короткой линейной полисахаридной матрицы (инулин). Мы ожидали, что геометрия данного носителя и пространственное распределение заряда будут способствовать более эффективному, по сравнению с ДЭАЭ-сефарозой, взаимодействию с нуклениовыми кислотами. Полученные результаты подтвердили наше предположение, данные носители действительно гораздо лучше осаждают нуклеиновые кислоты, не оказывая влияния на активность протеасом (рис. 28Б). Однако оказалось, что синтезированные нами линейные аниониты снижают электрофоретическую подвижность протеасом в полиакриламидном геле (рис. 28В), вероятно, за счет образования крупных белковых комплексов. Мы работали с данными носителями в концентрации от 0,5 до 10 мг/мл при концентрации белка в образце 20-30 мг/мл, ионной силе 100мМ NaCl. Во всем диапазоне выбранных концентраций анионита мы наблюдали эффективное осаждение нуклеиновых кислот. Мы не исключаем возможности, что изученные условия не являются оптимальными и что данный метод при незначительной оптимизации сможет показать достойные результаты. На данном этапе дальнейшие исследования мы проводили, применяя ДЭАЭ-сефарозу для осаждения нуклеиновых кислот, так как этот подход давал надежные и воспроизводимые результаты.
Нативный электрофорез протеасом печени
Нативный электрофорез является мощным методом анализа четвертичной структуры белков. Он позволяет определять строение сложных белков и изучать взаимодействия между белками. Исторически этот метод использовали для очистки белков и для установления четвертичной структуры (наравне с гель-хроматографией). Позднее, с развитием методов идентификации индивидуальных белков (иммунохимические, масс-спектрометрические подходы) стало возможным использовать нативный электрофорез в качестве первого шага при анализе состава крупных белковых комплексов из небольших количеств материала [Heide и др., 2012].
Предложенная в начале 90-х годов прошлого века методика проведения нативного электрофореза в присутствии красителя Coomassie G-250[Schgger, Cramer, Jagow von, 1994] не может быть применена в неизменном виде для разделения различных форм протеасом, так как краситель мешает окраске геля на химотрипсинподобную активность протеасом [Shibatani и др., 2006]. С другой стороны, проведение нативного электрофореза без красителя ухудшает разрешение полос, так как в этом случае электрофоретическая подвижность зависит как от массы, так и от формы и заряда комплексов, в то время как присутствие красителя нивелирует фактор заряда.
Отдельную трудность представляет приготовление препаратов цитоплазматических белков для анализиа методом нативного электрофореза. Методика проведения нативного электрофореза разработана для частично очищенных (дифференциальным центрифугированием или хроматографией на глутатион-сефарозе) препаратов протеасом [Shibatani и др., 2006; Tai и др., 2010], для образцов, полученных из чистых клеточных линий, и ретикулоцитов [Elsasser, Schmidt, Finley, 2005; Myeku и др., 2011; Shibatani и др., 2006; Yeh, Jansen, Schmidt-Glenewinkel, 2011]. Однако в литературе нет данных о применении этой методики для разделения протеасом из гомогенатов целых тканей организма.
Присутствие нуклеиновых кислот, главным образом ДНК, значительно ухудшает качество нативных электрофореграмм [Liang и др., 2009]. При попытке исследовать все формы протеасом внутри клетки, невозможно избежать наличия ДНК в образце, так как некоторые формы имеют ядерную локализацию [Takeda и др., 2011]. Нашей основной задачей в разработке метода был выбор мягкого, но эффективного способа удаления нуклеиновых кислот из образца, оказывающего минимальное влияние на структуру и активность протеасом.
Известные работы по нативному электрофорезу протеасом можно подразделить на две группы. Первый подход можно назвать функциональным: протеасомы разделаются в низкопроцентном акриламидном геле (3-5%) на две группы - содержащие и не содержащие регулятор активности 19S. Применение данного метода позволяет делать качественный вывод о значении 19S регулятора (и роли протеасом, гидролизующих меченные убиквитином белки) в развитии исследуемых физиологических состояний [Dasuri и др., 2009; Elsasser, Schmidt, Finley, 2005; Kiprowska и др., 2017; Myeku и др., 2011; Yeh, Jansen, Schmidt-Glenewinkel, 2011]. Однако этот метод вряд ли может быть использован для установления структуры отдельных форм протеасом ввиду низкого разрешения исходных электрофореграмм. Таким образом, мы полуаем информацию преимущественно о функции, но не о тонкой структуре комплексов. Второй подход можно назвать структурным, он идейно вырос из голубого нативного электрофореза (BN-PAGE), применяемого для разделения и очистки мембранных комплексов дыхательной цепи митохондрий [Schgger, Cramer, Jagow von, 1994]. Данный метод предполагает использование градиентного полиакриламидного геля (5-17%) и дает отличное разрешение после завершения электрофореза с возможностью проведения второго направления и детальной расшифровки структуры комплексов, однако с потерей информации о том, какие из полученных комплексов являются каталитически активными [Camacho-Carvajal и др., 2004; Shibatani и др., 2006]. В этом случае, мы имеем информацию преимущественно о структуре, но практически ничего – о функции.
Разработанный нами метод – это своеобразный компромисс между этими двумя крайностями, позволяющий определять как структуры, так и функции протеасом из неочищенных гомогенатов тканей.
Охарактеризованные нами стуктуры протеасом в печени крысы по набору и стехиометрии регуляторов активности протеасом не противоречат результатами, полученными ранее для лизатов печени [Tai и др., 2010]. Стоит отметить, что Таи с соавт. не проводили разницу между конститутивными и иммунными протеасомами и не изучали распределение регулятора 11S. Мы показали, что в печени крысы в норме иммунные протеасомы представлены преимущественно следующими структурами: 11S-20S-11S, 11S-20S и 20S.
Не исключено, что полученные нами результаты – это следствие тканевой специфичности распределения различных форм протеасом. Было установлено, что скорость гидролиза убиквитинированных субстратов конститутивными и иммунными 26S-протеасомами одинакова [Nathan и др., 2013]. Скорее всего, наши результаты указывают на то, что в печени при нормальных условиях иммунные протеасомы важны для процессов, не связанных с деградацией меченных убиквитином белков. Наиболее вероятной фунцией иммунных протеасом в печени является деградация окисленных белков [Grune, Reinheckel, Davies, 1996; Raynes, Pomatto, Davies, 2016]. Печень – это орган с высоким метаболизмом, участвующий как в энергетическом обмене, так и в процессах связанных с детоксикацией различных соединений. Благодяря этим свойствам, в печени существует несколько центров продукции активных форм кислорода – митохондрии [Miwa и др., 2016; Taylor, Ghio, Piantadosi, 1995] и система цитохромов Р-450 [Puntarulo, Cederbaum, 1998]. В связи с этим стоит ожидать, что в печени очень важно иметь эффективную систему выявления и деградации окисленных белков, и участниками этой системы могут быть иммунные протеасомы в виде как 20S-субчастиц, так и в более сложных структурах, связанных с одним или двумя активаторами 11S.
Исходя из результатов проведенной нами работы, можно заключить, что структура протеасом с субъединицей LMP2 и активатором 11S в печени важна также для развития иммунологической толерантности. Эта форма протеасом, по всей видимости, образует олигопептиды для межклеточных взаимодействий и передачи информации, приводящей к подавлению иммунного ответа.
В ткани трансплантата повышенный уровень протеасом с субъединицей LMP2, возможно, обеспечивает защиту клеток от последствий окислительного стресса – процесса, вовлеченного в разрушение ткани трансплантата [Buchholz и др., 2008; Halling и др., 2004].