Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обще механизмы действия эстрогевов их рецепция клеткам и особенности эффектов половых гормонов на печень (Обзор литературы) 8
I. Общие представления о механизме действия эстрогенов на клетки-мишени 8
I.Многообразие эффектов эстрогенов на организм млекопитающих 8
2.Специфические белки-рецепторы эстрогенов 9
а) Основные гормонсвязывающие свойства эстрогенных рецепторов II
б) Основные физико-химические свойства рецепторов стероидных гормонов 12
3.Гетерогенность рецепторов стероидных гормонов...14
4.Транслокация гормон-рецепторных комплексов из цитоплазмы в ядро клетки 15
5.Активация рецепторов 16
6.Природа взаимодействия ГРК с ядерными структурами 19
7 .Представление о рецепторном цикле 22
8.Нерастворимые в KCI ядерные рецепторы 26
9.Ключевая роль рецепторов в реализации гормональных эффектов 27
II. Особенности действия половых гормонов на печень...30
I. Многообразие эффектов половых стероидов на функции печени 30
а) Половая дифференцировка метаболизма стероидов в печени и влияние на этот процесс половых гормонов 31
б) Влияние половых стероидов на содержание в
печени особого эстрогенсвязывающего белка 34
в) Влияние половых стероидов на уровень транскортина в крови 36
г) Роль половых стероидов в регуляции обмена лигшдов и липопротеидов в печени 37
д) Ангиотензиноген и влияние половых гормонов на его уровень в крови 38
2.Роль гипофиза в реализации эффектов половых гормонов на печень 41
3.Рецепторы половых стероидов в клетках печени...45
CLASS Глава II. Материалы и методы 4 CLASS 9
А. Материалы, буферные растворы и реактивы 49
I.Экспериментальные группы животных. 49
2 .Реактивы 51
3.Буферные растворы 51
Б. Методы. 52
I. Получение цитозоля печени и матки крыс. 52
2.Получение форм I и П эстрогенсвязывающих белков печени 53
3.Получение ядер печени и матки 55
4.Определение связывания эстрадиола с эстрогенныщ рецепторами 57
а) Инкубация проб с гормоном 57
б) Разделение свободной и связанной форм гормона методом адсорбции на декстран-покрытом угле 58
в) Расчет параметров специфического связывания 59
5.Исследование транслокации ГРК в ядра в
бесклеточной системе 61
6.Количественное определение ЭР в цйтозоле и ядрах клеток печени и матки после введения Ео животным с различным эндокринным статусом организма 62
а) Определение специфически связывающих Е2 участков в ядрах клеток 62
б) Определение специфически связывающих Е2 участков в цитозоле 69
в) Способы выражения концентрации рецепторов 74
7.Определение ангиотензиногена в плазме крови крыс 74
8.Определение радиоактивности в пробах 77
9.Определение белка и ДНК 80
10.Статистическая обработка результатов 80
Главаa III. Изучение особенностей рецепции эстрогенов клетками печени 82
I. Изучение транслокации в клеточные ядра комплексов Е с формами I и П ЭСБ печени крыс в бесклеточной системе 82
2.Изучение закономерностей рецепции в печени после введения Е2 in vivo 92
3.Уровень эстрогенных рецепторов у животных с различным эндокринным статусом 104
Глава ІV . Влияние эстрадном на уровень ангйотензиногена в крови крыс и возможная роль эстрогенных рецепторов печени в реализации этого эффекта 112
I.Закономерности влияния эстрадиола на уровень и динамику ангйотензиногена в плазме крови крыс 112
2.Влияние эстрогенов и андрогенов на уровень АГ у самок и самцов крыс 117
3.Сравнительный анализ уровня и динамики эстрогенных рецепторов печени и уровня и динамики ангйотензино гена в плазме крови при различных эндокринных воздействиях 120
Заключение 134
Выводы 147
Список литературы 149
- Общие представления о механизме действия эстрогенов на клетки-мишени
- Многообразие эффектов половых стероидов на функции печени
- Получение цитозоля печени и матки крыс.
- Изучение транслокации в клеточные ядра комплексов Е с формами I и П ЭСБ печени крыс в бесклеточной системе
Введение к работе
К настоящему времени в научной литературе, касающейся механизмов действия женских половых гормонов, можно выделить ряд фактов, достаточно убедительно доказанных»
Во-первых, кроме действия на органы женской половой сферы эстрогены оказывают многообразное влияние на другие органы животного организма» В частности, объектом действия половых стероидов является печень, где они способны оказывать многообразные программирующие и регуляторные влияния на метаболизм клеток печени в мужском и женском организмах, контролируя биосинтез некоторых ферментов (А.Г.Резников,1981;Со1ЪуД980;Gustafsson et al., 1983), неферментативных внутриклеточных протеинов и ряда секре-тируемых белков и липидов: особого эстрогенсвязывающего белка (ОЭСБ), антиотензиногена, аполипопротеинов разных классов, протромбина, гаптоглобина, транспортных белков для гормонов, ot2u ~ глобулина, холестерина, фосфолипидов и т.д. (В.Б.Розен,І972; О.В. Смирнова с соавт.,1980;Seal, Doe, I965;Song et al., I969;Menard et al., 1973; Jolly et al. ,1977; Pat sen et al., 1980).
Во-вторых, в клетках печени выявлена и достаточно хорошо охарактеризована с точки зрения гормонсвязывающих и физико-химических свойств гетерогенная система эстрогенсвязывающих белков (ЭСБ), состоящая, по крайнем мере, из трех компонентов (В.Б.Ро-зен с соавт.,1976; Б.Б.Розен, А.Н.Смирнов,I98I;lisenfeld,Aten, 1979; Powell-Jones et al., 1980,1981). Форма I ЭСБ печени по многим параметрам близка классическим естрогенним рецепторам (ЭР) матки (Г.Д.Матарадзе с соавт.,1979). Форма П, по-видимому,'аналогична по своим свойствам высокосолевой субъединице формы I и отличается от последней в основном неспособностью образовывать агрегаты в среде с низкой ионной силой (Я.Ю.Кондратьев с соавт.,
1980). Эти белки содержатся у самцов и самок крыс в сопоставимых концентрациях. Вместе с тем третий компонент системы ЭСБ печени крыс - ОЭСБ, обнаруживаемый только у самцов крыс, существенно отличается от форм I и П по целому ряду параметров (А.Н.Смирнов с соавт.,1977).
И, наконец, известно, что подавляющее большинство эффектов эстрогенов на метаболические процессы в органах-мишенях опосредуется ЭР (В.Б.Розен, А.Н.Смирнов,1981; Anderson et al., 1973; Jensen, 1978; Katzenellenbogen et al., 1979; Alonso et al., 1983).
Однако для печени участие ЭР в реализации эффектов эстрогенов нельзя считать доказанным.
Для того, чтобы получить доказательства справедливости этого постулата, следовало выбрать модельный объект воздействия эстрогенов на метаболические процессы в печени. По нашему мнению, удобным и интересным объектом для таких исследований является секрети-руемый печенью белок ангиотензиноген (AT), на продукцию которого эстрогены оказывают прямой стимулирующий эффект ( Nasjletti,Messon, 1972). Известно, что АГ является предшественником ангиотензинов и может участвовать в патогенезе развития гипертензий, в частности, возникающих как осложнения при некоторых крайних физиологических и патологических состояниях, связанных с повышением уровня эстрогенов в организме, таких как беременность, опухоли органов женской половой сферы, эстрогенная терапия, длительный прием комбинированных контрацептивов и т.д. ( Menard, 1975; Takanashi et al., 1982; Tewksbury, 1983).
Исходя из вышеизложенного, основной целью нашей работы явилось изучение влияния эстрогенов на продукцию АГ гепатоцитами и выявление возможной роли ЭР печени в реализации этого эффекта.
В связи с этим мы поставили перед собой следующие задачи:
I. Изучить некоторые закономерности взаимодействия эстрадно-
ла (Е2) с рецепторними белками гепатонитов: транслокацию комплексов Е2 с формами I и П ЭР печени в бесклеточной системе; кинетику и дозозависимость распределения ЭР мевду различными компарт-ментами клетки после введения Ео in vivo ; влияние на уровень ЭР эндокринного статуса организма.
Изучить закономерности изменения уровня и динамики АГ в плазме крови крыс под влиянием введения различных доз Е^ в сочетании с воздействием ряда других эндокринных факторов.
Сопоставить уровень и динамику ЭР печени с уровнем и динамикой АГ в крови при этих воздействиях, чтобы попытаться выявить возможную роль ЭР в опосредовании изучаемого эффекта эстрогенов на этот орган.
К моменту начала нашей работы в научной литературе данных по изучаемым нами вопросам практически не имелось. В последующие годы по отдельным аспектам исследуемой проблемы начали появляться и данные других авторов, в целом согласующиеся с нашими (Eisenfeld et al., 1980,1982; Marr et al.,I980; Kneifel,Katzenel-lenbogen, 1981; Clauser et al.iE983).
Общие представления о механизме действия эстрогенов на клетки-мишени
Влияние эстрогенов на организм чрезвычайно обширно и разнообразно. Основная часть их эффектов направлена на органы женской половой сферы. У млекопитающих постнатальное формирование органов женского полового тракта - матки, влагалища и яйцеводов -определяется в значительное мере эстрогенами. Они дозозависимо стимулируют увеличение размеров и массы матки, обусловленное гиперплазией и гипертрофией её эндометрия и миометрия, вызывают рост и дифференцировку влагалища, увеличение его мышц и стромы, процесс эструса. Эстрогенные гормоны обеспечивают стимуляцию роста яйцеводов и их сократимости, что обеспечивает возможность продвижения яйцеклетки по направлению к матке. В молочных железах эстрогены вызывают разрастание и разветвление протоков (В.Б.Розен, 1984). Считается, что именно эстрогены - главные индукторы половой дифференцировки гипоталамуса (в пре- и неонатальном периодах онтогенеза (McEwen, 1980,1981). Кроме того, важная роль принадлежит эстрогенам в постнатальной регуляции секреции гонадотропинов и некоторых других тройных гормонов гипофиза (Marchetti et al., I982;Boado et al., I983;Gustafsson et al.,I983).
Важнейшее общее свойство эстрогенов - не только прямое влияние на дифференцировку репродуктивных органов, но и их сенсибили зирующая активность в отношении действия других гормонов: прогес-тинов, окситоцина, цролактина, гонадотронинов (Н.А.Юдаев с соавт., 1979 ;0 Malley,Schrader ,1976 ;catt,Dufau, I977;babrie, I979;Quirk et al.,I984).
Кроме действия на органы женской половой сферы, эстрогены оказывают многообразное влияние на другие органы животного организма. Они являются стимуляторами синтеза ряда белков в печени (В.Б.Розен, 1983;Song et el. ,I969;Eisenfeld,Aten,I979), могут оказывать влияние на функцию почек (Li,Ы, 1978,1981), легких (Ben Harari,Youdim, 1983), MDsraCWardiaw et al,I982;Chen,Printz, 1983). Наконец, широко известны эффекты эстрогенов на формирование скелета по женскому типу, характер оволосения тела, половое поведение (В.Б.Розен,1984).
Согласно современным представлениям о механизме действия стероидных гормонов на клетки большая часть их эффектов опосредуется путем изменения интенсивности и характера генной экспрессии на уровне транскрипции (GorskL et al., 1968; Johnson et al., 1980; Taylor et al.,I980). При этом главным пунктом действия стероидов является ядро клетки и прежде всего - хроматин. Следствием гормональной регуляции транскрипции являются, как установлено, изменение уровней синтеза разных видов РНК в хроматине, интенсивности транспорта РНК из ядра в цитоплазму, процессов трансляции в полирибосомах, синтеза de novo функциональных и структурных белков эффекторной клетки (Т.Н.Протасова,1975;GorsM et al., 1965; Мей-нуоринг,І979 .
2) Специфические белки - рецепторы эстрогенов.
В последние два десятилетия достигнут большой прогресс в понимании механизма действия стероидных гормонов. Показано, что в гормончувствительных клетках существует специальный механизм узнавания гормонов, их специфической рецепции, обусловливающей, в частности, специфический захват и аккумуляцию гормона (Jensen, I960; Jensen, Jacobs on, 1962).
При исследовании внутриклеточного распределении эстрогенов методами фракционирования субклеточных органелл и авторадиографии было обнаружено, что вводимые меченые эстрогены, как и другие стероидные гормоны, преимущественно накапливаются сначала в цитоплазме, а затем в ядрах клеток-мишеней (GorskL et al., 1968; Jensen et al., 1969),
Анализ компонентов питозольной и ядерной фракций компетентных клеток показал, что гормонсвязывающими компонентами цитозоля и ядер являются биоспецифические белки, а сам процесс связывания гормона этими белками характеризуется обратимостью, избирательностью и насыщаемостью. Образование гормон-белковых комплексов является наиболее ранним событием после попадания гормона в клетку, непосредственно не зависимым от уровня синтеза нуклеиновых кислот и белков, интенсивности дыхания и окислительного фосфори-лирования (В .Б.Розен, 1977; GorskL, Gannon, 1976).
Было показано, что концентрация гормонсвязывающих белков в клетках в целом положительно коррелирует с чувствительностью клетки к гормону, с её способностью захватывать и аккумулировать данную группу гормональных соединений. В клетках-"немишенях" гормон-связывающие белки не выявляются (Gorski et al., 1968). Эти гор-монсвязывающие белки были названы "рецепторами".
Многообразие эффектов половых стероидов на функции печени
В последние годы были накоплены данные, позволяющие рассматривать печень как важнейший объект, модулятор и посредник целого ряда системных эффектов половых стероидов. Показано, что половые гормоны способны оказывать многообразные программирующие и регу-ляторные влияния на метаболизм клеток печени в мужском и женском организмах (А.Г.Резников,1981; В.Б.Розен,1983; Song et al., 1969; Colby, 1980). К числу эффектов половых стероидов на печень млекопитающих относятся: влияние на синтез ряда ферментов метаболизма стероидов, некоторых токсинов и лекарственных веществ; влияние на активность собственных рецепторов и рецепторов других гормонов; регуляция уровня ОЭСБ; влияние на продукцию ряда секретируемых белков и липидов: ангиотензиногена, аполипопротеинов, протромбина, гаптоглобина,с?62и -глобулина, транспортных белков крови (транс-кортина, секс-стероидсвязывающего глобулина, тироксинсвязывающе-го глобулина), холестерина и т.д.
При этом, механизмы действия половых гормонов и их взаимодействия в процессах регуляции тех или иных функций печени сложны и многообразны. Базальная активность некоторых метаболических процессов поддерживается внегонадальными факторами (синтез ангиотензиногена, транскортина, липидов, активность некоторых ферментов стероидного метаболизма) и обратимо регулируется половыми гормонами. Другие процессы находятся под программирующим (неонаталь-ный импринтинг) влиянием половых стероидов, а после созревания обратимо регулируется ими - это большая часть ферментов стероидного метаболизма , ОЭСБ, oL -глобулин (А. Г Резников ,1981; В.Б.Розен,1983; О.В.Смирнова с соавт.,1984; Gala,WestfalI965;Eiseirfeia et al., I977,6;Sloop et al.,1983),
В большинстве случаев эстрогены и андрогены действуют на метаболические процессы в печени как антагонисты, хотя механизмы их разнонаправленного действия могут различаться.
а) Половая дифференцировка метаболизма стероидов в печени и влияние на этот процесс половых гормонов.
Половые различия обмена в печени касаются метаболизма корти-костероидов, андрогенов, эстрогенов, некоторых лекарственных веществ и токсинов. Причем, специфические гормональные эффекты на ферменты стероидного метаболизма у разных видов могут различаться. У некоторых животных половые гормоны действуют на метаболизм стероидов очень слабо, и половые различия в этом случае не выявляются (Colby,1980). Лучше всего в этом отношении изучены крысы, так как у них зависимые от пола различия обмена стероидов проявляются наиболее ярко (Lax et al.,I983;Gillham et al,I983;Gustaf-sson et al.,I983;Shieis et al.,I983). Данных о метаболизме стероидов у других видов животных к настоящему времени накоплено немного (Stegeman et al.,I982).
Установлено, что гидроксилирование стероидов более интенсивно протекает у самцов крыс, в то время как 5о . -редуктазная активность выше в печени самок. Биологический смысл этих особенностей метаболизма предположительно видят в инактивации гормонов, соответствующих противоположному полу (А.Г.Резников,1981). Более высокая активность некоторых гидроксилаз в печени самцов крыс связана в определенной степени с более высоким уровнем у них цитохро-ма Р-450 ( Colby, 1980; Gillham et al,I983), но в основном, определяется различиями в каталитических свойствах ферментных систем, что, возможно, вызвано различием молекулярных форм цитохрома Р-450 у самок и самцов (Colby, 1980; Maeda et al. ,1984). Половые различия в активности 5 -редуктазы связаны с более высокой концентрацией этого фермента в микросомах печени самок крыс ( Colby, 1980).
Дифференциация по полу активности многих ферментов стероидного метаболизма в печени взрослых крыс не выявляется до полового созревания животных (Colby, 1980). Гонадэктомия на различных стадиях онтогенеза и введение животным экзогенных половых гормонов позволили выявить несколько типов гормональной регуляции метаболизма стероидов в печени.
Б большинстве случаев эффекторами являются андрогены, при этом формируется мужской тип метаболизма, женский же тип может формироваться и в отсутствие половых гормонов. Тем не менее эстрогены могут также влиять на активность ферментов стероидного мета болизма, оказывая регулирующее действие.
Существуют, по-видимому, два механизма действия андрогенов на ферменты стероидного метаболизма. Первый (детерминирующий) -неонатальныи имцринтинг, осуществляемый неонатальнои экспозицией андрогенами и не проявляемый до полового созревания. Его результатом является формирование ферментных систем по мужскому типу. Имцринтинг у самцов может быть предотвращен неонатальнои кастрацией, а неонатальное введение андрогенов самкам приводит к тому, что активность ферментных систем при половом созревании у них не отличается от таковой у интактных самцов. Второй механизм действия андрогенов является регуляторним, зависит от продолжительности экспозиции с андрогенами взрослых самцов и устраняется постпубертатной кастрацией (А.Г.Резников,I98I;Gustafsson et al.,I980; Lax et al., 1983).
Необходимо отметить, что чувствительность ферментов к действию половых стероидов различна. По этому признаку ферменты стероидного метаболизма можно разделить на три группы. Первую составляют ферменты, базальная активность которых поддерживается внего-надальными факторами, но подвергается обратимой регуляции андрогенами и эстрогенами, причем, андрогены обычно оказывают стимулирующий эффект, а эстрогены, наоборот, ингибируют активность ферментов. К этому типу относятся некоторые гидроксилазы стероидов.
Большую группу у крыс составляют ферменты, активность которых предопределяется гормональным импринтингом в неонатальном периоде, а после полового созревания животных гонадальные гормоны могут оказывать на активность этих ферментов обратимое регулятор-ное воздействие. К этой группе относится значительная часть гид-роксилаз, оксидоредуктаз и 5оС -редуктаза стероидов.
Получение цитозоля печени и матки крыс.
Животных забивали декапитацией. Печень промывали ia. situ через верхнюю полую вену холодным изотоническим раствором (0,9% NaCl) и помещали в холодный буфер ТЭ. Матку очищали от жира и также помещали в холодный буфер ТЭ.
При получении цитозоля для изучения транслокации в бесклеточной системе использовались незамороженные ткани, в остальных случаях их замораживали в жидком азоте и хранили при -20С не более трех дней. В предварительных опытах мы исследовали влияние замораживания на определение концентрации специфически связывающих мест в цитозоле. Было показано, что хранение печени и матки в течение 3-4 суток при -20С мало сказывается на определении специфически связывающих участков.
Органы взвешивали, измельчали ножницами или скальпелем и гомогенизировали в механическом гомогенизаторе типа "Poiytron " при напряжении 100 В в течение 2-3 мин, чередуя периоды гомогенизации (5-Ю с) с периодами охлаждения (15 сек). Соотношение буфера (ТЭД) и ткани при гомогенизации для печени составляло 2:3, а для матки 10:1 (объем:вес). Все процедуры проводили при 0-4С. Гомогенат центрифугировали при 800s 15 мин на центрифуге ЦЯР-І. Надосадочную жидкость использовали для получения цито-золя путем центрифугирования на ультрацентрифуге "УВД-3-47" или "УЩ-в- б", ротор РПУ-50Т при 140000s в течение I часа. Полученный пито золь сразу использовали для дальнейшей работы. Содержание белка колебалось в цитозоле печени от 20 мг на I мл до 40 мг на I мл , в цитозоле матки от 1,0 мг на I мл до 4 мг на 1мл. 2. Получение форм I и П эстрогенсвязывающих белков печени,
В печени самок крыс выявляются две формы ЭСБ (0.В .Смирнова с соавт., 1976; Г.Д.Матарадзе с соавт., 1979; Я.Ю.Кондратьев с соавт.,1980) (рис.1). Первая из них, обозначаемая нами как форма I, представляет собой крулномолекулярный белок (1 ,,-/ 88 ,
ЕСтокса 7 нм» м#в# 00 » близкий по размерам и связывающим свойствам эстрогенному рецептору матки крыс; вторая, обозначаемая как форма П, - менее крупную форму ЭСБ (К-о-пЛ 4 S , ЕСтокса 3нм М.в.-80кД). Получение этих форм проводилось в два этапа. В качестве первого применялось фракционирование сульфатом аммония, позволяющее, с одной стороны, получать исследуемые белки в достаточном количестве, а с другой - удалять значительную часть балластных веществ, обусловливающих высокий уровень неспецифического
На колонку размером 4,5x75 см нанесено 30 мл цитозоля печени самок крыс /концентрация белка 33,8 мг/мл/. Элюция проводилась буфером ТКЭ. Объем фракций 8-9 мл. К аликвоте 1,0 мл каждой фракции добавлено 300 пкг 3Н.-Е для определения общего связывания и 300 пкг 3НЕ2 + 400 нг Eg для определения неспецифического связывания. Инкубация І ч при 4С.
Количество связанного 3НЕ2 определялось методом адсорбции на декстран-покрытом угле; %=В0бщ - Вп$ в имп/мин. Стрелками обозначены формы I и П. Ve - объем элюции. связывания 1 в питозоле. Для этого к цитозолю при перемешивании добавляли насыщенный раствор ( N Н SO (рН 7,5) до концентрации, соответствующей 0% насыщения. Через 30 мин выпавшие в осадок белки (включая формы I и П ЭСБ), отделяли центрифугированием при 20000 g 20 мин и растворяли в 25 мл буфера ТК. Центрифугирование повторяли.
Супернатант использовали для гельхроматографш на колонках ультрогеля АсА-44, представляющего собой смесь акриламида и ага-розы и позволяющего разделить белки с М.В. 12-14окД. Размеры колонок составляли 4,4x80 см. Для элюции использовался буфер ТК.
30 мл исследуемого материала наносили на колонку сразу после вховдения в гель последней порции буфера. Сбор фракций начинали после двукратного смывания остатков пробы 10,0 мл используемого буфера. Фракции собирали с помощью автоматического фракционного коллектора фирмы "ькв п ( Швеция ) со счетчиком капель и времени. Скорость элюции составляла 1,5 мл/мин, объем фракций -15,0 мл. Все этапы гельфильтрации проводили при 0 4С.
Содержание специфически связывающей Е -активности во фракциях элюата тестировали с помощью инкубации аликвот объемом 0,5мл с 200 пкг %-Е2 в присутствии (неспецифическое связывание) или в отсутствие (общее связывание) избытка немеченого гормона (400 нг) в течение I ч при 0-4С. Разделение свободного и связанного гормона проводили методом адсорбции на декстран-покрытом угле (см.нияе).
Изучение транслокации в клеточные ядра комплексов Е с формами I и П ЭСБ печени крыс в бесклеточной системе
Наши эксперименты показали, что ЭРК цельного, нефракциониро-ванного цитозоля печени самок крыс и комплексы %-Ео с препаратами форм I и П ЭСБ печени самок обладают способностью транслоциро-ваться в ядро, то есть ведут себя аналогично комплексам Eg с классическими эстрогенными рецепторами цитозоля матки (рис.10).
Как следует из рисунка 10, для ЭРК цельного цитозоля печени самок крыс, как для ЭРК матки, необходимым условием их перехода в клеточные ядра являлась предварительная активация ЭРК при по-вишенной температуре, тогда как комплексы %-Е2 о формами I и П ЭСБ печени, полученными с использованием фракционирования сульфатом аммония и гельфильтрации, обладали повышенным сродством к ядрам и без температурной обработки, то есть являлись преактиви-рованными (рис,10)» Таким образом, высаливание и гельфильтрация также способны вызвать активацию комплексов со связывающими .белками, сопровождающуюся повышением их сродства к ядерным структурам.
Полученные данные об активирующем влиянии разных по природе факторов (повышенная температура, фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрация) можно рассматривать как подтверждение развиваемой в настоящее время гипотезы о существовании в цитозо-ле гормон-компетентных органов низкомолекулярного ингибитора активации ГРК (Goidl et al.,I977; Sato et al.,1979,1980,1983). Согласно этой гипотезе, неактивированные рецепторы находятся в комплексе с неким низкомолекулярным ингибитором, который мешает их превращению в активированную форму. Связывание с гормоном, повышенная температура, разведение цитозоля и некоторые другие факторы ускоряют диссоциацию ингибитора из комплекса с рецептором, а диализ и гельфильтрация отделяют его от рецептора, превращая таким образом :неактивированный : рецептор в активированную форму.
Отсутствие разницы в уровне транслокации в клеточные ядра прогретых и непрогретых специфических комплексов %-Е2 с формами I и П ЭСБ, полученными высаливанием сульфатом аммония и последующей гельфильтрацией на колонках с ультрогелем АсА-44 цитозоля печени, дало нам основания исключить процедуру црогревания препаратов ГРК до начала инкубации с ядрами, поскольку она приводила к частичной диссоциации ГРК по сравнению с нецрогретыми препаратами.
Способность комплексов Е2 с формами I и П ЭСБ печени после активации транслоцироваться в клеточное ядро вместе с данными о существенном сходстве этих белков с ЭР матки по гормонсвязываю-щим и ряду других физико-химических свойств дает основания считать эти формы ЭСБ истинными рецепторами эстрогенов в клетках печени.
Выявленный факт наличия транслокапии форм I и П ЭР печени позволил продолжить исследования процесса перехода комплексов Е« с этими печеночными ЭР в ядра в сравнительном аспекте.
Сравнительный анализ кинетики транслокации в клеточные ядра комплексов 2 с формами I и П ЭР печени при существенном сходстве этих процессов для двух форм позволил выявить и некоторые различия. Так, цри 0-4С уровень транслокапии изучаемых ЭРК в ядра печени (рис.II) достигал максимума через 90 мин для формы I и через 30 мин для формы П. Кроме того, при практически одинаковом количестве специфических комплексов, добавленных к стандартному количеству ядер, максимальный уровень транслокапии формы I был почти в два раза выше, чем. формы П ЭР.
Эти данные указывают, по всей вероятности, на различия в сродстве этих форм к акцепторным участкам ядерного хроматина.
Существуют данные, что в процессе активации в результате конформационной перестройки и локального появления полошітельннх зарядов на поверхности молекул рецепторов стероидных гормонов, последние приобретают повышенную способность реагировать с входящей в состав хроматина полианионной ДНК на основе электростатических взаимодействий (Г.А.Романов с coaBT.,I979;Yamamoto et al., 1976;Toft et al., 1976). Тогда можно предположить, что в случае существования рецептора в агрегированной 8S форме локальное распределение положительных и отрицательных зарядов таково, что облегчает электрическое взаимодействие ЭРК с ДНК и/или другими акцепторными участками ядер (Г.А.Романов с соавт.,1981).
