Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 9
1.1. Общее представление об активных формах кислорода и ферментативном звене антиоксидантной системы 9
1.2. Роль АФК в клеточном метаболизме 16
1.2.1. Участие АФК в механизмах внутриклеточной сигнализации 16
1.2.2. Роль АФК в регуляции пролиферации 19
1.2.3. Роль АФК в механизмах клеточной гибели 21
1.3. Окислительный стресс 25
1.4. Окислительная модификация белков 30
1.5.Архитектоника эритроцитов при экспериментальной неоплазме 34
Глава II. Материал и методы исследования 42
2.1.Экспериментальные животные 42
2.2.Характеристика и перевивка опухолевого штамма 42
2.3.Схема проведения эксперимента 43
2.4. Методы исследования .44
2.4.1. Биохимические методы 45
2.4.1.1. Методы определения активности ПОЛ 45
2.4.1.2. Методы определения активности ферментативного звена антиоксидантной системы 47
2.4.1.3. Метод определения содержания гемоглобина в крови .52
2.4.2. Морфологические методы исследования 53
2.4.3. Методы статистической обработки данных .55
Глава III. Результаты собственных исследований .56
3.1. Параметры ПОЛ при моделировании опухолевого процесса 56
3.2. Показатели активности компонентов антиоксидантного звена при моделировании неопластического процесса .58
3.3.Карбонильные производные белков в эритроцитах при экспериментальной неоплазме 63
3.4. Морфология, архитектоника и ригидность мембран эритроцитов при моделировании опухолевого процесса 64
3.5. Обсуждение результатов 73
Заключение 86
Выводы .89
Список литературы 90
- Роль АФК в механизмах клеточной гибели
- Методы определения активности ферментативного звена антиоксидантной системы
- Показатели активности компонентов антиоксидантного звена при моделировании неопластического процесса
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Актуальность работы. Редокс-гомеостаз - сложноустроенная
биологическая система человека, главными компонентами которой являются ферменты антиоксидантной защиты, контролирующие течение, направленность и интенсивность процессов свободнорадикального окисления в органах и тканях и обеспечивающие приспособление организма к изменяющимся условиям внешней среды (Величковский Б. Т., 2001).
Около 90 % молекулярного кислорода в организме вступает в реакцию окислительного фосфорилирования. При этом молекулы кислорода имеют возможность принимать по одному электрону и последовательно превращаться в активные формы кислорода (АФК).
Усиление свободнорадикального окисления может приводить к нарушению
окислительно-восстановительного статуса клеток, получившего название
окислительного стресса, который выступает как одно из патогенетических звеньев неопластического процесса (Gedik C.M. et al., 2002, Арсланова Д.Р., 2009).
Системное действие неоплазмы на организм определяет развитие окислительного стресса, в результате которого в эритроцитах накапливаются продукты перекисного окисления липидов и карбонильные производные белков (Крыжановский Г.Н., 2002, Чеснокова Н. П., 2004, et al., 2005). Последние при этом гораздо стабильнее и специфичнее в отличие от продуктов пероксидации, что позволяет рассматривать их в качестве маркеров окислительного стресса (Дубинина Е.Е., 2006; Горошинская И.А. и др., 2013).
Эритроцит - уникальная модель для оценки состояния организма, которая
отражает степень нарушения структуры и метаболизма в патологическом
процессе (Новицкий В.В. и др., 2000). Показано,что развитие неопластического
процесса может также сопровождаться снижением уровня антиоксидантов в эритроцитах периферической крови (Крыжановский Г.Н., 2002; Антонеева И.И., 2006; Арсланова Д.Р., 2008; Генинг, Т.П., 2008; Боровская М.К. и др., 2010).
Установлено изменение реологических свойств эритроцитов
циркулирующей крови при развитии неоплазмы (Крыжановский Г.Н., 2002). При этом представляет интерес влияние редокс-статуса эритроцитов на архитектонику этих форменных элементов в динамике развития неоплазмы.
Целью настоящей работы является изучение параметров перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков, ферментативного звена антиоксидантной системы и архитектоники эритроцитов на модели развития неопластического процесса.
Основные задачи исследования:
1. Оценить параметры перекисного окисления липидов: диеновых
конъюгатов, кетодиенов, основания шиффа и концентрацию малонового
диальдегида в эритроцитах периферической крови крыс при моделировании
опухолевого процесса.
2. Определить активность ферментативного звена антиоксидантной системы
в циркулирующих эритроцитах крыс при прогрессировании экспериментальной
неоплазмы.
3. Изучить параметры окислительной модификации белков в эритроцитах
крыс при развитии экспериментальной неоплазмы.
4. Оценить топологию, ригидность эритроцитов крыс методом атомно-
силовой микроскопии и изучить индекс трансформации циркулирующих
эритроцитов в стационарную и терминальную фазы при моделировании
опухолевого процесса.
Научная новизна. При моделировании неопластического процесса у крыс были получены новые данные об изменении уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) в эритроцитах как ведущем патогенетическом факторе локальных и системных нарушений в динамике развития неоплазмы. Впервые был оценен уровень ферментативного звена системы глутатиона в эритроцитах в стационарную и терминальную фазы при
моделировании опухолевого процесса. Оценили ригидность, топологию и
морфологические индексы эритроцитов с использованием метода атомно-силовой
микроскопии (АСМ) и световой микроскопии, что позволило наиболее полно
оценить их морфофункциональное состояние. Установлена степень корреляции
между показателями системы ПОЛ-антиоксиданты, ОМБ и индексами
трансформации (ИТ) эритроцитов, а также между ИТ, ригидностью эритроцитов и
уровнем гемоглобином в стационарную и терминальную фазы роста
экспериментальной неоплазмы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные
раскрывают связь редокс-статуса эритроцитов циркулирующей крови с
изменением их архитектоники в динамике неопластического процесса и
представляют интерес для фундаментальной физиологии и экспериментальной
онкологии. Могут быть использованы для преподавания курсов «Физиология»
Патофизиология», «Биофизика». Результаты исследования определяют связь
редокс-статуса, цитоархитектонику эритроцитов и уровня гемоглобина.
Результаты диссертационного исследования могут быть использованы при
изучении механизмов анемий и разработки модели коррекции
морфофункционального состояния эритроцитов циркулирующей крови в
экспериментальной физиологии.
Материал и методы исследования. Для моделирования опухолевого процесса
использованы инбредные крысы в возрасте 4 месяцев массой 180-200гр, которым
внутрибрюшинно в количестве 3,5x107 опухолевых клеток на крысу перевивали
штамм асцитной опухоли яичников (штамм РЯ, РОНЦ им.Н.Н. Блохина, г.
Москва). Прогрессирование данного типа опухоли проходит в 3 фазы:
логарифмическая (с 4-суток после перевивки), стационарная (с 8-суток после
перевивки), терминальная стадия (с 13 суток после перевивки) (Васильева Г.С.,
1982).
Интенсивность ПОЛ в гемолизате эритроцитов оценивали по уровню
диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов (КД), основания шиффа (ОШ) по методу
Волчегорского И.А. (1989). Уровень вторичного продукта - малонового
диальдегида (МДА) по методу Андреевой Л.И. (1988). Содержания продуктов
ОМБ оценивалось по методу Дубининой Е.Е. (2006). Супероксиддисмутазу по
методу Дубининой Е.Е. (1989); Nishikimi M. (1972). Определение активности каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатион-S-трансферазы (ГТ) и уровень глутатиона восстановленного (GSH) - по методу Карпищенко А.И. (1999). Активность глутатионредуктазы (ГР) оценивали по методу Асатиани В.С. (1969). Концентрацию глутатиона окисленного (GSSG) оценивали по методу Ellman G.L. (1972).
Данные по активности антиоксидантных ферментов и уровня продуктов ПОЛ пересчитывались на 1 грамм гемоглобина.
Исследования цитоархитектоники, поперечного сечения, ригидности эритроцитов проводились на атомно-силовом микроскопе Solver P47 Pro (NT-MDT, Зеленоград, Россия) в полуконтактном режиме, используя кантилевер с жесткостью 0,2 N/m, радиус закругления кончика зонда примерно 10 нм. Ригидность мембраны эритроцита оценивали по модулю Юнга. Число сканированных точек в образце – 600. Изображение получали в 2D и в 3D.
Морфологические изменения поверхностной архитектоники эритроцитов подсчитывали под световым микроскопом Nikon Eclipse E200. Количество эритроцитов дискоидной формы и эритроцитов с измененной формой выражались в процентах, расчет производился на 300 эритроцитов.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с
использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (Stata 6.0) и стандартных пакетов «Microsoft Excel», 2007. Различия считались статистически значимыми при p0,05. Коэффициент корреляции Спирмена (r) рассчитывали с помощью компьютерной программы математического анализа (Stata 6.0).
Положения, выносимые на защиту.
1. Развитие экспериментальной неоплазмы сопровождается усилением перекисного окисления липидов (возрастание уровня диеновых конъюгатов,
малонового диальдегида) и окислительной модификации белков (увеличение
количества карбонильных производных белков нейтрального и основного
характера), а также истощением пула глутатиона восстановленного на фоне
разнонаправленной динамике активности ферментов глутатионовой системы
2. Стресс реакция циркулирующих эритроцитов, провоцируемая развитием
неоплазмы, сопровождается изменением топологии, возрастанием ригидности
мембраны, повышением индекса трансформации эритроцитов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на V
Всероссийской конференции с международным участием, посвященная 15-летию
Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского
государственного университета (Ульяновск, 2014), Международной научной
конференции, посвященная 75-летию АГУ «Механизмы функционирования
нервной, эндокринной и висцеральных систем в процессе онтогенеза» (Майкоп,
2015), VIII Международной научной конференции «Приоритеты мировой науки:
эксперимент и научная дискуссия» (Северный Чарльстон, Южная Каролина,
США, 2015), X Международной (XIX Всероссийской) Пироговкой научной
медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2015),
Всероссийской молодежной конференции «Актуальные вопросы
экспериментальной и клинической онкологии» (Ростов-на-Дону, 2016), VI
Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 25-летию
образования медицинского факультета Ульяновского государственного
университета (Ульяновск, 2016), Международно-практической конференции
«Кислород и свободные радикалы» (Гродно, 2016).
Публикации. По теме диссертационному исследованию опубликовано 15
научных работ, в том числе в изданиях, рецензируемых ВАК РФ - 5 статей.
Объем и структура диссертации. Научная работа состоит из введения, глав:
Роль АФК в механизмах клеточной гибели
Реакция клетки на внешний сигнал различается в зависимости от его интенсивности и от исходного соотношения прооксидантов и антиоксидантов в самой клетке. Выделяют несколько стадий развития клеточного ответа, из которых начальная стадия не связана с индукцией генетического аппарата (носит регуляторный характер). Следующая стадия клеточного ответа связана с активацией сигнальных каскадов, где внешний сигнал передается к ядру. В этом случае активируются некоторые гены, и начинается синтез мРНК и соответствующих белков с целью оптимизации работы в новых условиях (Applegate L.A. et al., 1991; Graven K.K. et al., 1993; Hanselmann C. et al., 2001).
Если воздействия имеет слишком высокую интенсивность, а скорость компенсаторных реакций мала, то в ядре включается специальная программа гибели самой клетки, или апоптоз. Процессы апоптоза и пролиферации обладают рядом морфологических сходств и регулируются схожими механизмами. Причастность АФК и перекисных соединений к индукции апоптоза показана на примере разных типов как нормальных (Quadri S.A. et al.,1997; Tan S. еt al., 1998), так и опухолевых клеток (Fulda S. еt al.,1999).
Согласно мнению ученых (Швембергер И.Н. и др., 2002; Allen R.G. et al., 2000), реакция клеток на индуцирующие факторы может привести к активации генов, отвечающих за пролиферацию и апоптоз одновременно.
В работе Ю.Д. Губаревой и А.М. Колесниковой (2009) были проанализированы термины «апоптоз» и «некроз». Некрозом традиционно называют отмирание отдельных клеток, групп клеток, тканей и органов в живом организме (Коган Е.А., 1998), однако однозначное понимание данного термина еще не сложилось. Ряд авторов используют термин некроз для обозначения распада погибших клеток в живом организме (Buja L.M. et. al., 1998). Трактовка некроза убедительно представленa в рaботе G. Majno и I. Joris (1995), которые утверждaют, что некрозу подвергаются клетки, погибшие как по типу aпоптозa, так и вследствие повреждений. Вместе с тем, другие авторы расширяют понятие некроз, утверждая, что некротический процесс включает следующие стадии: 1) паранекроз (преднекроз) – обратимые изменения клетки; 2) некробиоз (некро-фанероз) – необратимые изменения с преобладанием катаболических реакций; 3) смерть клетки, время наступления которой установить трудно и 4) аутолиз (постнекротические изменения) – разложение мертвого субстрата (Новиков B.C.,1996; Харченко Е.П. и др., 2006).
В литературном обзоре A.G. Hall (1999) встречается предположение о некрозе, где, в отличие от апоптоза, некроз вовлекает участки располагающихся рядом клеток и связывается с набуханием цитоплазмы и митохондрий и ранней потерей целостности наружного слоя мембраны. Это в свою очередь ведет к повторному повреждению окружающих тканей.
В работе Т.Г. Сазонтовой (2007) некроз рассматривается как процесс, повреждающий мембранные структуры, повышая уровень свободного кальция, который прямо активирует протеазы и фосфолипазы – в результате происходит гибель клетки.
При некротической форме гибели клетки набухают из-за нарушения работы ионных каналов митохондрии, приводя к разрыву внутриклеточных механизмов и плазматической мембраны клетки. Активизируются лизосомальные ферменты. Это приводит к тому, что внутриклеточное содержимое, попадая во внеклеточную среду, способствует развитию воспаления. Причины, вызывающие некроз клетки, приводят к ингибированию окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксии и действию различных токсинов (Белушкина М.А. и др., 2001; Гусев Е.И. и др., 2001).
Морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра (Уманский С.Р.,1996). Биологическая роль апоптоза заключается в поиске путей регуляции этого процесса для лечения и профилактики. Характерные признаки апоптоза проявляются в уменьшении размера клетки, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембраны без выхода содержимого клетки в окружающую среду. Обзор основных работ по вопросу о факторах, индуцирующих апоптоз, в литературе достаточно много. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, бактериальные токсины (Macaya A.,1996).
В работе С.А. Борисовой, Е.М. Коломойцевой (2003) отмечается, что апоптоз может вызывать как внутриклеточные, так и внешние сигналы, опосредующие свое действие через рецепторные системы. Авторами применяется термин «регуляция апоптоза», поскольку известна группа физиологических активаторов и ингибиторов программированной клеточной гибели. Одни и те же стимулы могут подавлять и стимулировать указанный процесс: поддерживать выживание в одном типе клетки и включать программу самоубийства в других.
АФК возникают спонтанно в свободнорадикальных реакциях, могут запускать реакцию окисления жирных кислот. Мягкая активация ПОЛ, увеличение концентрации АФК в пределах физиологической нормы оказывают стимулирующее действие на организм и не порождают патологических процессов.
Если же уровень СРО будет выше, то начнется быстрое разрушение клеточных структур, которое не опосредуется геномом, поскольку апоптозный сигнал не успевает реализоваться. Эта роль свободных радикалов кислорода наиболее известна — повреждаются мембранные структуры, повышается уровень свободного кальция, который прямо активирует протеазы и фосфолипазы — в результате клетка гибнет. Известно, что при этом все предыдущие стадии также включаются, т. е. активируется и физиологический ответ, и апоптический, но они не успевают реализоваться, поскольку происходит более быстрый процесс — разрушение клеточных структур в результате прямого повреждающего действия АФК (Сазонтова Т.Г., 2007)
Высокие концентрации АФК могут вызывать апоптотическую или некротическую гибель клеток (Chang M.C.et al., 2007; Halliwell B., 2007). Это в свою очередь приводит к изменению редокс-статуса клетки и реализации апоптоза. Увеличение концентрации продуктов ПОЛ способствует увеличению проницаемости митохондриальной мембраны, влияя, таким образом, на электрон-транспортную систему митохондрий. Митохондрии – источники радикальных продуктов и, как принято считать, важные инициаторы апоптоза. Высокий уровень радикалов может вызвать некротическую гибель клеток, в то время как низкий уровень может индуцировать апоптоз и иметь регуляторную функцию под влиянием ростовых факторов или за счет изменения генной экспрессии (Clayson D.B. et al.,1994; Burdon R.H. 1995).
Апоптоз представляет собой актуальную проблему современной биологии. Активные метаболиты кислорода и окислительные реакции с их участием в той или степени участвуют в этом процессе. Найденные литературные источники предполагают, что в результате апоптоза выбраковываются клетки с аномально высоким уровнем продукции АФК (Смирнова Л.П. и др., 2003).
Вместе с тем вопрос участия АФК в процессе апоптоза нельзя считать решенным, так как показано, что в некоторых случаях процесс протекает даже в анаэробных условиях, для которых характерно снижение продукции АФК (Buchner F., 1959).
Выраженность апоптоза зависит не только от клеток, стимулирующих и опосредующих процессы апоптоза, но и от способности клеток-мишеней данного органа или ткани отвечать на эти сигналы (Ayala A. et al., 2008).
Таким образом, пролиферация и гибель клеток должна быть точно контролируема, поскольку дисбаланс в этой системе может приводить к патологическим изменениям всего организма, среди которых важное место занимает и канцерогенез (Green D.R.et al., 2002). Если АОС клетки не компенсирует сдвига редокс-потенциала, процесс прогрессирует.
Методы определения активности ферментативного звена антиоксидантной системы
СОД способна катализировать реакцию дисмутации супероксидных анион-радикалов до молекулярного кислорода и Н2О2.
Метод изучения активности СОД в биологическом материале основан на способности этого антиоксидантного энзима конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидный анион. Эти анионы образуются в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы НАДН2 с феназин-метасульфатом (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразин тетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается по методу Дубининой Е.Е., 1989; Nishikimi M, 1972. (Арсланова Д.Р., 2009).
К разведенному гемолизату эритроцитов (0,9 мкл трис-НСЕ буфера +0,1 мкл крови) добавляли 500 мл спирта хлороформа и 600 мг К Н2 PО4. Хорошо растерали на льду 10-15 мин. Центрифугировали на холоду, температура -4 С при 7000 об/мин 15 мин. В пробирку вносили 0,1 мкл супернатанта и добавляли 3 мл фосфатного буфера с ЭДТА, НСТ, ФНС, затем смотрели на приборе при длине волны 540 нм и добавляли 0,1 мкл НАДН2 и 10 минут снова смотрели на спектрофотометре.
Полученные результаты выражались в усл.ед./гр Hb Определение активности каталазы
Определение активности каталазы (Н2О2: перекись водорода-оксидоредуктаза) Интенсивность утилизации Н2О2 определяли по скорости снижения экстинции при 260 нм, против 5% раствора ТХУ (Карпищенко А.И, 1999).
К 2,5 мл 0,3% раствора перекиси водорода добавляли 200мкл гемолизата эритроцитов и выдерживали 10 мин при комнатной температуре, после чего реакцию останавливали внесением 0,3 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Параллельно опытным обрабатывали контрольные пробы. Расчет активности каталазы производят по разнице экстинкции в опыте и контроле согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, по формуле:
Определение уровня ГПО
ГПО (глутатион: перекись водорода-оксидоредуктаза) катализирует реакции восстановления молекул Н2О2 и органических гидропероксидов до гидросоединений при использовании несколько молекул GSH.
Данный метод подразумевает в себя способности фермента ускорять реакцию расщепления гидропереки трет-бутила (ГПТБ), используя восстановленный глутатион, а затем определять в реакции дитио-биснитробензойной кислотой (ДТНБ) (Карпищенко АИ.,1999).
0,2 мл гемолизата эритроцитов смешивали со сложным буфером (78 мг азид натрия, 100 мг GSH в 100 мл 0,1 М трис-НСЕ буфера с 0,01% ЭДТА и рН 8,5). Реакцию активизировали с помощью раствора ГПТБ - 75 мкл 0,14%.
По истечению 5 мин реакцию приостанавливали 200 мкл 20% ТХУ Параллельно опытным обрабатывали контрольные пробы. К 0,2 мл супернатанта добавляли 2,65 мл трис-НСЕ буфера с 0,01% ЭДТА и 50 мкл ДТНБ. Пробы фотометрировали при 412 нм.
Активность фермента в эритроцитах рассчитывали по формуле: ACxVx2M
ГТ катализирует несколько типов реакций, ответственных в организме животных и человека за обеспечение метаболизма ксенобиотиков, эндогенных токсинов, продуктов обмена и гормонов. ГТ активностью обладает значительное количество белков, локализованных в различных тканях и внутриклеточных компартментах.
Метод основан на определении скорости ферментативного образования GS-2,4-динитробензола в катализируемой ферментом реакции восстановления глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (ДХНБ). Водный раствор образующегося продукта определяется при длине волны 340 нм (Карпищенко А.И., 1999).
Для осуществления биохимической реакции 100 мкл гемолизата эритроцитов соединяли с 1,2 мл 2мм ДХНБ и 1,2 мл 2мм GSH. Время реакции в спектрофотометре 3 мин. Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили при длине волны 340 нм против воды сразу же после перемешивания содержимого кюветы
Определение уровня ГР
Активность ГР за счет энергии НАДФ-Н в присутствии окисленного глутатиона (Арсланова Д.Р., 2009). Активность данного метода оценивали при длине волны 340нм.
В пробирку последовательно отмеряли 0,2 мл гемолизата эритроцитов, 2,4 мл фосфатного буфера (рН 6,8), 0,2 мл раствора GSSG и 0,2 мл раствора NAD(P)H2, Время реакции в спектрофотометре 3 мин.
Расчет активности фермента в эритроцитах рассчитывался по формуле: Лх\/рсх106х101
А= Vnpxlxext
А - активность фермента
ДЕ - разность экстинкции контрольных и опытных проб
vpc - объем реакционной смеси
vv - объем пробы гемолизата эритроцитов
1 - длина оптического пути
-коэффициент микромолярной экстинкцииНАО(Р)Н2
t - время инкубации 106 - коэффициент пересчета моль на мкмоль Полученные результаты выражались в мкмоль/мин/гр НЬ
Определение уровней GSHuGSSG
Глутатион — у- глутамил-цистиенил-глицин - “неправильный” трипептид, является важным внутриклеточным метаболитом, принимающим участие в реализации множества важных физиологических процессов. Определение концентрации GSH основано на способности кислоторастворимых тиоловых группировок при взаимодействии с 5,5-дитио-бис-нитробензойной кислотой (ДТНБ) образовывать окрашенное соединение - тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которого имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. Поскольку GSH является преобладающим низкомолекулярным тиолом, концентрация последних усло принимается за концентрацию GSH.
К 0,6 мл гемолизату эритроцитов добавляли 0,2 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы перемешивали и центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об. /мин. 0,2 мл супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2,55 мл 0,1 М трис-НСЕ буфера с 0,01% ЭДТА. К полученной смеси добавляли 50 мкл ДТНБ. Пробы фотометрировали против дистиллированной воды при длине волны 412 нм. Полученные результаты выражались в мкмоль/л. (Карпищенко А.И., 1999). Для оценки содержания GSSG с помощью ГР восстанавливали до GSH и определяли в реакции с ДТНБ при 412 нм на спектрофотометре (Ellman G.L., 1972).
Расчет содержания GSH производился с помощью калибровочного графика, для построения которого растворы коммерческого препарата готовили растворы GSH с концентрациями от 0,02 до 2 ммоль/л обрабатывали в соответствии с данной методикой. По калибровочной кривой рассчитывали концентрацию GSH и выражали в мкмоль/л (Карпищенко А.И., 1999).
Данные по активности антиоксидантных ферментов и уровня продуктов ПОЛ пересчитывались на 1 грамм гемоглобина для эритроцитов.
Показатели активности компонентов антиоксидантного звена при моделировании неопластического процесса
Антиоксидантные звенья обеспечивают связывание и модификацию свободных радикалов, предупреждают образование перекисей или разрушают их. Так как дисбаланс оксидантной и антиоксидантной систем играет патогенетическую роль в обеспечении общего гомеостаза организма, проявления оксидативного стресса необходимо своевременно диагностировать. Поэтому значения показателей компонентов АОС играют важную роль в адекватной интерпретации общего состояния АОС (Нагоева М.Х., 2007).
Результаты оценки ферментного звена АОС в эритроцитах крыс в норме и при экспериментальной неоплазме представлены в таблице 2.
СОД является ключевым ферментом антирадикальной защиты клеток, инактивирующего супероксиданион-радикал. Способность первой линии защиты ускорять реакцию превращения кислородного радикала (супероксид ОО) в Н2О2 и молекулярный кислород (Логинов А.С., 1994). Н2О2 является внутриклеточным мессенджером. При отсутствии восстановителей Н2О2 довольно стабильна и вследствие своей структуры является электрически нейтральным соединением и оценивается клеткой, как частица воды. Таким образом, Н2О2 может диффундировать на значительные расстояния и легко проникать через мембраны (Дубинина Е.Е., 2002).
Изменение концентрации сказывается на деятельности подкласс ферментов киназ(фосфотрансфераз) и митоген-активируемых протеинкиназ (Аbe M.K., 1994).
Помимо этого, Н2О2 является ключевой сигнальной молекулой в регуляции процесса гибели клетки. Повышение концентрации пероксидов за пределы физиологического уровня влечет к снижению редокс-потенциала и вызывает апоптоз (Hoidal J.R., 2001).
В нашем исследовании установлено, что по сравнению с контролем активность СОД в стационарную и в терминальную фазы роста неоплазмы не являются статистически значимыми (табл.2).
Каталаза обладает меньшим сродством к субстрату, чем ГПО, поэтому в физиологических условиях утилизация в клетках осуществляется за счет фермента ГПО. Однако, в отличие от ГПО каталаза обеспечивает очень высокую скорость реакции окисления (способна за секунду разложить 44000 молекул и потому является необходимой в условиях окислительного стресса.
Из представленных данных (табл.2) в эритроцитах при моделировании опухолевого процесса (в стационарную фазу) отмечено достоверно значимое повышение фермента каталазы и достоверное снижение фермента не достигающего, однако, контрольных величин в терминальную фазу.
Важнейшей системой инактивации свободных радикалов являются GSH и комплекс ферментов - ГПО, ГТ и ГР.
ГПО – фермент, содержащий селен, локализован главным образом в эритроцитах. Способен с помощью GSH защищать липиды мембран и гемоглобин от окисления перекисями, препятствуя развитию патологических состояний при действии различных факторов (Петрович Ю.А. и др., 1981). Является одним из важнейших компонентов ферментативной АОС (Брискин Б.С. и др., 2000).
В результате проведенных исследований (табл.2) отмечено значимое снижение (р0,02) активности ГПО в эритроцитах в терминальную фазу роста неоплазмы. В стационарную фазу достоверных отличий с контрольной группой не обнаружено. Было установлено значимое снижение активности ГР в стационарную фазу роста неоплазмы. В терминальную фазу достоверных изменений в активности ГР не наблюдалось (табл.2). Деятельность ГПО связана с работой другого фермента ГР, которая катализирует реакцию восстановления, окисленного глутатиона с помощью восстановленного НАДФ, образующегося в ходе пентозофосфатного пути обмена глюкозы (Тугушева Ф.А., 2001).
ГР — фермент, восстанавливающий дисульфидную связь окисленного глутатиона GSSG до его сульфгидрильной формы GSH. Восстановление глутатиона происходит за счёт энергии НАДФ-Н, образующегося в пентозном цикле. В таких клетках как эритроциты, которые постоянно подвержены высокому оксидативному стрессу, до 10% потребляемой глюкозы используется на восстановление глутатиона глутатионредуктазой. ГР обеспечивает возобновление трипептида из окисленной формы в восстановленную, при этом GSH, являясь акцептором АФК, способен сдерживать свободнорадикальное окисление (Кулинский В.И., 1999).
ГТ входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их конъюгации с GSH. ГТ способна восстанавливать гидропероксигруппы окисленных фосфолипидов непосредственно в мембранах без их предварительного фосфолипидного гидролиза свободными жирными кислотами. Этот фермент конъюгирует с GSH токсичные продукты ПОЛ и тем самым способствуют их выведению из организма. Таким образом, ГТ является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных метаболитов, образующихся при окислительном стрессе (Владимиров Ю.А. и др., 2003).
В результате эксперимента установлено статистически значимое увеличение уровня ГТ в стационарную и терминальную фазы в эритроцитах в динамике развития экспериментальной неоплазмы (табл.2).
Защиту эритроцитов от действия АФК осуществляет также система глутатиона в виде GSH и ферментов его метаболизма.
Наиболее показательной с точки зрения антиоксидантного потенциала глутатиона является величина отношения GSH к GSSG, которая в настоящее время воспринимается как один из маркеров оксидативного стресса (Меньщикова Е. Б. и др., 2008).
Что касается изменений величины отношений GSH к GSSG, происходящих в эритроцитах в динамике развитии неоплазмы, наши исследования показали достоверное снижение отношения GSH/GSSG (табл.3). В стационарную фазу при экспериментальной неоплазме в эритроцитах отмечается прогрессирующее снижение уровня GSH и статистически значимое снижение фермента в терминальную фазу роста экспериментальной неоплазмы (табл.3).
Обсуждение результатов
ПОЛ - представляет собой радикальные цепные реакции (Зенков Н.К., 2001; Сазонтова Т.Г. и др., 2007). Этот процесс метаболический, представленный практически во всех органах и тканях млекопитающих.
Усиление процессов ПОЛ в эритроцитах циркулирующей крови отмечено при прогрессировании неоплазмы различной локализации (Антонеева И.И., 2009; Victorino V. et.al., 2014).
Нами также установлено повышение по сравнению с контролем продукта МДА в эритроцитах на разные сроки роста развития экспериментальной неоплазмы у животных-опухоленосителей (рис.5).
Существует мнение, что образование МДА способствует формированию перекрестных сшивок между фосфолипидами и белками мембраны. Результатом является нарушение функции мембраны, деформабильности клетки и ограничение жизни эритроцита (Муравлёва Л.Е. и др., 2013).
Повышенное содержание ДК было отмечено в эритроцитах женщин с раком молочной железы (Окрут И.Е.и др.,2011), у пациенток со злокачественными опухолями эндометрия (Солопова Н.В., 2010). Нами также установлено повышение уровня ДК, значимое уже в стационарную фазу развития неоплазмы (рис.5).
Изменение уровней КД и ОШ в эритроцитах крыс в динамике прогрессирования неоплазмы было статистически не значимым (рис.5).
Исследованием больных раком прямой кишки III стадии установлено: содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах крови увеличено (диеновых конъюгатов в 3 раза, MDA в 2 раза); после лучевой терапии уровень диеновых конъюгатов снижается на 20 %, а ОШ – на 41 %. С окислительным стрессом при онкологических заболеваниях связывают уменьшение содержания линолевой и арахидоновой кислот в липидах эритроцитов больных раком молочной железы и кишечника (Арсланова Д.Р., 2009).
На сегодня существует точка зрения, согласно которой активация СРО является типовым эфферентным звеном реализации патогенных эффектов различных факторов, в том числе и системного действия неоплазмы на организм (Чеснокова Н.П. и др., 2011).
Таким образом, полученные нами данные по параметрам ПОЛ в эритроцитах крыс при моделировании опухолевого процесса укладываются в концепцию Н.П. Чесноковой (2015) и позволяют предполагать, что накопление в эритроцитах промежуточных продуктов ПОЛ – ДК и МДА – является следствием системного действия неоплазмы на организм.
Несколько иная ситуация имеет место при оценке активности в эритроцитах ферментативного звена антиоксидантной системы. В клетках каталаза, в основном, сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся и ферменты, продуцирующие H2O2, необходимую, в частности, в процессах неспецифической иммунной защиты. Во внеклеточных жидкостях каталаза быстро теряет свою активность в результате действия протеолитических ферментов (Haliwell B. еt al., 1984).
В эритроцитах при высокой скорости образования H2O2 (1010-109 моль H2O2 на 1мг гемоглобина в 1мин) преобладает активность ГПО, а при низкой скорости образования H2O2 (109-107) — защитное действие оказывает в основном каталаза.
Нами установлено повышение активности СОД и каталазы по сравнению с контролем в стационарную и терминальную фазы роста неоплазмы (рис.6). На сегодня не существует единого мнения относительно активности СОД и каталазы в динамике развития неоплазмы. По данным одних авторов (А.И. Агабеков и др., 2014; Manoharan S. et.al., 2004; Шарипов Ф.К., и др., 2005; Duliska I. et.al., 2006) активность СОД и каталазы в эритроцитах организма-опухоленосителя снижается при этом, авторы полагают, что прогрессирующая недостаточность активности СОД определяет системную активацию процессов ПОЛ при неопластических процессах определенной локализации (Чеснокова Н.П. и др., 2015).
Данные других авторов (Polat M.F. et.al., 2002, Арслановой Д.Р., 2009; Воронова О.С. и др., 2012) свидетельствуют о повышении активности этих ферментов. При этом существует мнение, что увеличение в эритроцитах активности антиоксидантных ферментов может быть компенсаторной в ответ на усиление ОС (Polat M.F. et.al., 2002).
В доступной литературе мы обнаружили данные, свидетельствующие о разнонаправленной динамике СОД и каталазы в эритроцитах животных в динамике развития неоплазмы относительно контроля (Dursun H., 2006; Чеснокова Н.П. и др., 2015).
В литературе также представлены данные о фазности изменений антиоксидантной активности крови (Бурлакова Е.Б. и др., 1975). Для объяснения Е.А. Нейфахом в 1960 годы было высказано предположение, что неоплазма «выкачивает» антиоксиданты из других органов и тканей. При этом удаление неоплазмы приводит к нормализации активности ПОЛ в крови, что позволяет предполагать определяющую роль неоплазмы в формировании антиоксидантного статуса у животного с неопластическим процессом.
Источником супероксидного аниона O2-, в эритроцитах является спонтанное окисление Fe2+ в гемме гемоглобина. И поскольку кислорода в эритроцитах много, скорость образования O2- , Н2О2 и ОН высокая.
Далее СОД превращает, в Н2О2 + О2, а уже каталаза расщепляет Н2О2. Расщеплять Н2О2 может также ГПО, активность которой, по нашим данным, в стационарную фазу развития неоплазмы не отличались от контроля, а в терминальную фазу была значимо снижена по сравнению с контролем (рис.7). Снижение активности ГПО в эритроцитах зарегистрировано также у больных РШМ (Mukundan H. еt al., 1999).
Окисленный глутатион восстанавливает ГР, активность, которой, по нашим данным также была снижена в эритроцитах в динамике развития неоплазмы (рис.7).
Анализ вышеизложенного позволяет предполагать, что активность ферментативных антиоксидантов в эритроцитах экспериментальных животных, определяемая условиями гипоксии, развивающейся в организме при развитии неопластического процесса, усилением активности моноцитов, осуществляющих противоопухолевый иммунный ответ, является важной составляющей биологического портрета неоплазмы в динамике ее развития.
Субстратом для ГПО, расщепляющей Н2О2 и пероксиды липидов, является глутатион. Глутатион, - тиолсодержащий трипептид, - осуществляет защиту клетки от ксенобиотиков, свободных радикалов и гидропероксидов. Он функционирует в качестве антиоксиданта, участвуя в разрушении перекиси водорода и пероксидов липидов, обеспечивая субстрат для ГПО. В эритроцитах периферической крови, наиболее страдающих от активности свободных радикалов при развитии в организме неопластического состояния, его содержится значительное количество (Генинг Т.П., 2017).