Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 13
1.1. Функциональная разгрузка скелетной мышцы 13
1.2. Вывешивание и мышечная масса 13
1.3. Механизмы, ответственные за потерю белка в скелетной мышце
1.3.1. Регуляция кальпаин-опосредованного цитоскелетного протеолиза... 15
1.3.2. Убиквитин-протеасомная система и ее роль в деградации белков 18
1.3.3. Транскрипционная регуляция мышечно-специфических E-3-лигаз MuRF-1 и MAFbx при атрофических процессах 23
2. Организация и методы исследований 32
2.1. Экспериментальные методы и подходы 32
2.1.1. Объект исследований 32
2.1.2. Вывешивание крыс. Введение нифедипина на фоне 3-х суточного вывешивания 32
2.1.3. Вывешивание крыс. Введение PD150606 на фоне 3-х суточного вывешивания 33
2.1.4. Введение IMD-0354, блокатора NF-B сигналинга, крысам на фоне 3 -х суточного вывешивания 34
2.1.5. Введение бортезомиба, протеасомного ингибитора, крысам на фоне 7-ми суточного вывешивания 35
2.2. Методики обработки биоматериала и анализ данных 37
2.2.1. ДДС-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом 37
2.2.2. Исследование экспрессии генов 39
2.3. Анализ полученных данных 43
2.3.1. Анализ блотов 43
2.3.2. Анализ данных ПЦР-РВ 43
2.4. Статистическая обработка данных 43
3.Результаты исследования 45
3.1. Эффект блокирования кальциевых каналов L-типа при вывешивании 45
3.2. Исследование действия ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы m.soleus при функциональной разгрузке 47
3.3. Исследование действия IMD-0354, ингибитора NF-B сигналинга, на атрофию m. soleus при вывешивании 54
3.4. Исследование действия протеасомного ингибитора бортезомиба на атрофические процессы в m. soleus при вывешивании 61
4. Обсуждение результатов 69
4.1. Блокирование L-кальциевых каналов при вывешивании 69
4.2. Действие ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы при функциональной разгрузке m.soleus 70
4.3. Роль NF-kB сигналинга в развитии атрофии при функциональной разгрузке m.soleus 73
4.4. Действие протеасомного ингибитора на катаболические и анаболические сигнальные пути при функциональной разгрузке m.soleus 76
Выводы 81
Список используемой литературы
- Вывешивание и мышечная масса
- Вывешивание крыс. Введение нифедипина на фоне 3-х суточного вывешивания
- Исследование действия ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы m.soleus при функциональной разгрузке
- Действие ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы при функциональной разгрузке m.soleus
Вывешивание и мышечная масса
Функциональная разгрузка, вызванная длительной невесомостью или постельным режимом (вызванным различными заболеваниями) приводит к значительным изменениям скелетных мышц, преимущественно постуральных, как m.soleus. Исследования на животных [33] и добровольцах [34] показали, что разгрузка приводит к изменениям на молекулярном уровне, которые проявляются в потере массы мышц и ухудшении их функции. При разгрузке цитоскелетные и сократительные белки скелетных мышц подвергаются деструкции. Мышечная атрофия, вызванная разгрузкой, отличается от атрофии, вызванной денервацией или другими стимулами. Атрофия при разгрузке обусловлена снижением белкового синтеза и резким увеличением белкового распада [1]. Известны четыре протеолитические системы, вовлекаемые в распад мышечных белков: лизосомальная (аутофаги/лизосомы), каспазная, кальпаиновая, убиквитин-протеасомная. Степень вовлечения каждой из этих систем в развитие атрофии при различных её моделях (кахексия, сепсис, денервация, иммобилизация, вывешивание) разная. Работа этих протеолитических систем изучалась по отдельности во всех этих моделях атрофии, но их взаимосвязи и степень вовлечения в процесс протеолиза изучены не достаточно. Можно предположить, что эти системы могут участвовать в развитии атрофии одновременно и работать согласовано. Действительно, некоторые данные поддерживают эту гипотезу. Например, специфичный для мышцы кальпаин-3 вносит вклад в убиквитинирование белков [35], а активирование кальпаинов в миотубах увеличивает активность ферментов протеасом [36]. Но в противоположность этому Fareed M.U и др. [37] сообщили, что ингибирование кальпаинов в течение 16-часового сепсиса у крыс не привело к снижению протеасом-зависимой деградации белков. По мнению авторов, это свидетельствует о возможности независимой работы протеолитических путей при белковом распаде, вызванном сепсисом. А B. Beehler и др. [38] обнаружили предотвращение атрофии денервированных мышц при ингибировании протеасом, но в то же время отметили, что этот механизм действует не для всех моделей атрофии. M.Sandry полагает, что убиквитин-протеасомная и аутофаго-лизосомная системы являются главными протеолитическими путями, которые должны согласованно активироваться при атрофии мышцы [39]. Однако автор признаёт, что роль и регуляция аутофагового пути в скелетной мышце остаётся в большей части неизученной. Таким образом, анализ литературных данных, посвященных исследованиям работы и взаимодействия протеолитических систем при атрофии мышц, свидетельствует о достаточно большом разбросе мнений о регуляции белкового распада при атрофии.
Кальпаины – внутриклеточные нелизосомальные Ca2+-регулируемые цистеиновые протеазы. Они опосредуют регуляторное расщепление специфических субстратов во множестве процессов, связанных с дифференцировкой, жизнью и смертью клетки. Мышечная ткань экспрессирует в основном 3 вида кальпаинов: кальпаин 1 и 2 (также называемые - и m-), которые лучше охарактеризованы, и кальпаин 3 (также называемый p94), который высоко экспрессирован в этой ткани. Подтверждения того, что кальпаины играют ключевую роль в атрофии, основаны на данных, полученных с помощью анализа их экспрессии, измерения активности кальпаинов и использования ингибиторов кальпаинов. Установлено, что содержание кальпаинов увеличено в атрофических состояниях, таких как бездействие, денервация, сепсис и др. [40, 41, 42, 43, 44]. Однако, этих данных не достаточно для того, чтобы точно установить роль кальпаинов в атрофии мышц, потому что увеличение в экспрессии РНК и/или белка не обязательно связано с увеличением активности, тогда как активность кальпаинов зависит от соотношения кальин/кальпастатин.
Данные, полученные с помощью введения ингибиторов кальпаинов (леупептин, E-64 и др.) могут искажать действительную картину участия кальпаинов в атрофии ввиду недостаточной их специфичности, так как они могут ингибировать катепсины и другие цистеиновые протеазы [45]. Использование трансгенных мышей с оверэкспрессией кальпастатина, который не только ингибирует его активность, но также предотвращает его связывание с мембранами, подтверждает участие кальпаинов в атрофии [46].
Вывешивание крыс. Введение нифедипина на фоне 3-х суточного вывешивания
Для проведения экспериментов было отобрано 84 самца крыс линии Вистар весом 180-200 г. Все животные содержались при температуре 20-22C, корм и воду грызуны получали без ограничения ad libitum в соответствии с рационом для лабораторных животных. Все эксперименты были проведены согласно биоэтическим правилам проведения исследований на человеке и животных и одобрены Физиологической секцией Национального комитета по биомедицинской этике. После проведения эксперимента крысы были анестезированы 10% раствором авертина (Sigma, USA).У каждого животного под авертиновым наркозом (в среднем 0,5 мл 10 аветина внутрибрюшинно на животное весом 200г.) (100% авертин: 1г 2,2,2-трибромэтанол и 1 мл Tetr-амилового спирта) из обеих ног была выделена m. soleus и немедленно заморожена в жидком азоте. Далее пробы, которые анализировали с помощью вестерн-блоттинга и ПЦР в реальном времени, помещали в холодильник, поддерживающий температуру 85C. Для определения интенсивности синтеза белка в мышцах крысам за 30 минут до забоя вводили пуромицин [129]. После выделения m. soleus у этих животных мышцу немедленно замораживали и хранили в жидком азоте.
Для выявления роли кальция в активации кальпаинов, участвующих в протеолизе белков скелетной мышцы при разгрузке и изучения взаимодействия между работой кальпаиновой и убиквитин-протеасомной сигнальными системами при модулировании содержания кальция в цитоплазме мышечных волокон крысам вводился блокатор кальциевых каналов L-типа нифедипин.
Для проведения эксперимента 21 самец крыс Wistar были случайным образом распределены в 3 группы по 7 крыс в каждой: интактный контроль (гр. С); 3-суточное вывешивание (гр. HS); третью группу вывешивали с введением нифедипина (гр. HSN). Препарат, растворенный в 3 % DMSO, вводили внутрибрюшинно дважды в день (в концентрации 7 мг/кг в день). Крыс забивали сверхдозой авертина, m.soleus немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -85С.
Определяли содержание цитоскелетного белка десмина, тяжелых цепей миозина, кальпаина-1, Akt и pAkt с помощью вестерн блоттинга, экспрессию кальпаина-1, MuRF-1, MAFbx с помощью ПЦР в реальном времени.
Целью эксперимента было изучение влияния кальпаинов на убиквитин-протеасомную систему (убиквитинирование белков, Е3-лигазы MAFbx и MuRF-І) и на анаболические сигнальные пути (Akt-mTOR-p70S6K и MAPK-Erk (p90RSK)). Для этого животным вводился ингибитор кальпаинов PD150606.
21 самец крыс линии Вистар были разделены на 3группы: интактный контроль (гр. С); вторую группу крыс вывешивали 3 дня согласно модели гравитационной разгрузки по Ильину-Новикову [29, рис.4] таким образом, чтобы их передние конечности опирались на пол, а задние конечности его не касались (гр. HS); третью группу вывешивали с введением ингибитора кальпаинов PD150606 (гр. HSPD, введение препарата внутримышечно в 10% DMSO дважды в день (в концентрации 3 мг/кг в день)). Крыс забивали сверхдозой авертина, msoleus немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -85С. Образцы биоматериала использовались для анализа экспрессии кальпаина-1, кальпаина-2, MuRF-1, MAFbx, убиквитина методом ПЦР в реальном времени; содержания pFox03, pAkt, p-P90RSK, p-P70S6k с помощью вестерн блотинга.
Целью эксперимента было проверить гипотезу, являются ли транскрипционные факторы NF-B основными в запуске экспрессии Е3-лигаз и развитии атрофии скелетных мышц при их функциональной разгрузке. Для проверки этой гипотезы животным был введен IMD-0354, препарат блокирующий IKK. В результате блокирования не происходит фосфорилирование IkB. 21 самец 2,5-месячных крыс линии Вистар были разделены на 3 группы по 7 животных в каждой группе. Первая группа – интактный контроль (группа C), вторую группу крыс вывешивали согласно модели гравитационной разгрузки по Ильину-Новикову [29, рис. 4] 3 дня таким образом, что передние конечности опирались на пол, а задние его не касались (группа HS). Третью группу вывешивали с введением 2 раза сутки IMD-0354 (N-(3, 5-bis trifluoromethyl-phenyl)-5-chloro-2-hydroxy-benzamide) в 1% DMSO в m. soleus (группа HS+IMD) в концентрации 10 мг/кг веса крысы. Крысы были забиты сверхдозой авертина, выделенные m. soleus немедленно замораживали в жидком азоте. Методом ПЦР в реальном времени была проанализирована экспрессии E3-лигаз MuRF-1 и MAFbx, методом вестерн блоттинга оценено содержание белков MuRF-1, pFoxO3, pAkt, Akt, IkB, Bcl-3, P105, P50, p-P90RSK и уровень убиквитинирования белков.
Исследование действия ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы m.soleus при функциональной разгрузке
Содержание транскрипционного фактора p105 в m.soleus было снижено в обеих вывешенных группах, хотя достоверное уменьшение относительно группы контроля наблюдалось только в группе вывешивания (HS) (рис.24). Можно отметить, что этот фактор также связывается с p50 и работает в неканоническом сигналлинге NF-B, активирующемся только при функциональной разгрузке мышц. Уровень транскрипционного фактора p50 в обеих вывешенных группах не отличался от группы контроля (рис.24). Можно отметить, что этот фактор работает в обоих сигнальных путях NF-B (каноническом и не каноническом, активирующемся при функциональной разгрузке).
Cодержание P50 и P105 в цитоплазматическо фракции белков m.soleus вывешенных (HS) и вывешенных с введением IMD-0354 (HS+IMD-0354) крыс оценивали относительно их содержания в контрольной группе (С). Результаты представлены в виде средней и стандартной ошибки; – достоверные отличия от контроля, P0.05.
Содержание рибосомальной киназы p-p90RSK анаболического MEK-ERK сигнального пути также было существенно снижено в обеих вывешенных группах (как с введением ингибитора, так и с введением плацебо) относительно группы контроля (рис.25, p 0,05). Ингибирование NF-B сигнального пути никак не влияло на регулирование этого процесса.
Cодержание p-p90RSK в m.soleus вывешенных (HS) и вывешенных с введением IMD-0354 (HS+IMD-0354) крыс оценивали относительно его содержания в контрольной группе (С). Результаты представлены в виде средней и стандартной ошибки; – достоверные отличия от контроля, P0.05. 3.4. Исследование действия протеасомного ингибитора бортезомиба на атрофические процессы в m. soleus при вывешивании
При анализе эксперимента с введением протеасомного ингибитора крысам на фоне 7-ми суточного вывешивания мы не обнаружили различий между массой m.soleus крыс вывешенных с препаратом и без препарата. Существенное снижение наблюдалось как в группе вывешивания (HS) (77±2 мг, p 0,05), так и в группе вывешивания с введением препарата (HSB) (70±3 мг, p 0,05) относительно группы контроля (С) (101±4 мг).
Благодаря использованию в нашей работе нового метода SUnSET [129] мы оценили интенсивность трансляции белка при вывешивании животных и введении бортезомиба. Мы обнаружили достоверное снижение интенсивности синтеза белка в обеих вывешенных группах HS и HSB (на 56 и на 59% соответственно, рис.26, p 0,05) относительно уровня контроля. Таким образом, существенного влияния ингибирования протеасом на интенсивность процессов синтеза белка при вывешивании крыс не наблюдалось.
Интенсивность синтеза белка в m.soleus крыс, подвергшихся вывешиванию (HS) и вывешиванию с введением бортезомиба (HSB) оценивали по содержанию пуромициновой метки относительно контрольного уровня (С). Результаты представлены в виде средней и стандартной ошибки; – достоверные отличия от контроля, P0.05 Экспрессия мРНК Е3-лигаз MuRF-1 и Atrogin-1/MAFbx в m. soleus в группе вывешивания (HS) была достоверно выше (в 4,2 и 3,8 раз соответственно), чем в группе контроля (p 0.05). В то же время, в группе с введением бортезомиба (HSB) экспрессия MuRF-1 не отличалась существенно от контрольного уровня, а экспрессия Atrogin-1 была достоверно ниже, чем в группе вывешивания (HS) (рис. 27). Таким образом, ингибирование работы протеасом предотвратило увеличение экспрессии Е3-лигаз MuRF-1 и Atrogin-1/MAFbx.
Содержание мРНК MuRF-1(а) и atrogin1/MAFbx (б) в m.soleus вывешенных (HS) и вывешенных с введением бортезомиба (HSB) крыс оценивали относительно контрольного уровня (С). Результаты представлены в виде медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75). – достоверные отличия от контроля, P0.05; # – достоверные отличия от вывешивания, P0.05.
Анализ изменения относительного содержания белка MuRF-1 показал картину, аналогичную с экспрессией его мРНК, т.е. введение бортезомиба привело к отсутствию существенного повышения содержания белка MuRF-1 при вывешивании крыс (на 14%) относительно уровня контроля, тогда как в m. soleus группы HS его увеличение было существенным (на 45%) (рис.28).
Cодержание MuRF-1 в m.soleus вывешенных (HS) и вывешенных с введением бортезомиба (HSB) крыс оценивали относительно его содержания в контрольной группе (С). Результаты представлены в виде средней и стандартной ошибки; – достоверные отличия от контроля, P0.05; # – достоверные отличия от вывешивания, P0.05.
Также мы обнаружили предотвращение усиления убиквитинирования белков в группе вывешивания с введением препарата (HSB). У крыс без введения бортезомиба (HS) уровень конъюгированных с убиквитином белков вырос на 40% относительно контрольной группы, а в soleus группы HSB его содержание не отличалось от уровня контроля (рис. 29).
Действие ингибитора кальпаинов PD150606 на атрофические процессы при функциональной разгрузке m.soleus
При оценке интенсивности синтеза белка m.soleus при введении бортезомиба на фоне 7-ми суточного вывешивания мы отметили, что после введения пуромицина она была снижена в одинаковой степени, что у вывешенных без препарата животных, что у крыс с введением бортезомиба относительно уровня контроля (рис.26). Таким образом, можно заключить, что динамика интенсивности синтеза белка соответствовала направлению атрофических процессов в мышцах у вышенных животных обеих групп.
В то же время интересно отметить, что количество белка, конъюгированного с убиквитином, было существенно выше уровня группы контроля только у вывешенных без препарата животных (рис. 29), но не у крыс с введением бортезомиба. Аналогичные результаты показаны в модели атрофии, вызванной 7-дневной деннервацией m.soleus с введением и без введения бортезомиба [96]. Когда мы посмотрели экспрессию Е3-лигаз MAFbx и MuRF-1 (как содержание их мРНК (рис. 27), так и белка MuRF-1, (рис.28)), то мы обнаружили их высокий уровень только в группе вывешенных без препарата животных, но не в soleus животных с ингибированием работы протеасом.
Известно, что Е3-лигазы работают совместно с убиквитином - меткой для утилизации белка. Считается, что убиквитиновая метка является фактором, лимитирующим скорость деградадии белка, а увеличение специфических Е3-лигаз вместе с конъюгированным убиквитином может быть центральным в атрофическом ответе [95], что должно увеличивать протеолиз. В нашем эксперименте мы видим, что в ответ на ингибирование протеасом уровень убиквитинирования и экспрессии Е3-лигаз снижается относительно группы животных, вывешенных без препарата (рис.29, 27). Можно отметить, что изменение содержания кальпаина-1 имело ту же тенденцию с изменением маркеров убиквитин-протеасомной системы. Уровень кальпаина-1 в группе вывешивания был существенно выше, чем в группе контроля, тогда как введение животным бортезомиба предотвратило его увеличение (рис.30). Ранее мы показали, что начальным этапом протеолиза при функциональной разгрузке мышц является кальпаиновая система [158], которая активируется из-за увеличения уровня кальция в цитоплазме [159]. Здесь мы обнаружили, что ингибирование работы протеасом ведет к снижению уровня кальпаина-1 в мышце. Однако все это не приводит к снижению степени атрофии m. soleus. Можно заключить, что ингибирование работы протеасом сопровождается предотвращением увеличения содержания разных компонентов сигнальных систем, контролирующих белковую деградацию, что не влияет на скорость атрофии мышцы soleus при разгрузке.
Также нами были оценены маркеры работы анаболических сигнальных путей. Ранее отмечалось, что при разгрузке мышц недостаточно одного только увеличения скорости белковой деградации как объяснения причины снижения мышечной массы [2]. Хотя уровень pAkt (отвечает за фосфорилирование p P70S6k,) был одинаково существенно снижен в обеих вывешенных группах животных (рис.31.), мы не наблюдали достоверного снижения уровня p-P70S6k (рис.32) и существенного увеличения 4E-BP1 (рис.35) к седьмым суткам вывешивания крыс. Уровень тотального Akt при этом ни в одной из групп не отличался от контроля (рис. 31). В то же время содержание фосфорилированного GSK3 в m.soleus при введении бортезомиба на фоне 7-ми суточного вывешивания было снижено (рис. 34). Его фосфорилирование также осуществляется pAkt (см. схему на рис.2). Тотальное содержание GSK3 во всех группах также оставалось неизменным. Снижение содержания pGSK3 и, следовательно, увеличение его активности, было показано ранее у вывешенных грызунов [160], и при 48-часовой иммобилизации конечности у человека [161]. Итак, хотя и произошло снижение pAkt и pGSK3 в одинаковой степени в обеих группах вывешенных животных, заметного изменения нижележащих компонентов mTOR сигнального пути мы не наблюдали. Интересно отметить, что у человека в модели иммобилизации конечности (вызывающей атрофию) снижения сигналинга Akt/mTORC1 вообще не было отмечено, в то время как снижение скорости синтеза белка было зарегестрировано[162; 163; 164]. Такие отличия между разными объектами исследования могут быть связаны с разницей в возрасте, в исследуемой мышце, в модели иммобилизации. Все это созвучно с результатами нашего исследования. Ранее высказывалось предположение, что у взрослых особей базальная активность mTORC1 может быть не высокой [2, 165]. Содержание фосфорилированного P90RSK1 (являющегося маркером ERK1/2 сигнального пути) в m.soleus крыс при вывешивании и введении бортезомиба было снижено в равной степени c группой без введения препарата, относительно контроля (рис. 33). Результаты, полученные при введении бортезомиба при вывешивании, позволяют заключить, что на исследованные сигнальные пути, контролирующие синтез белка, бортезомиб не оказывает никакого влияния.
Таким образом, ингибирование протеасом при разгрузке m.soleus предотвращает увеличение активности компонентов, принадлежащих катаболическим сигнальным путям, и не затрагивает анаболический сигналинг. Этого оказывается недостаточно для снижения скорости атрофических процессов в скелетной мышце.