Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Гравитационная разгрузка скелетных мышц 13
1.2 Поиск триггерных механизмов развития гравитационно-зависимой перестройки скелетных мышц 19
1.2.1 Кальций-зависимые механизмы 19
1.2.2 NO-зависимые механизмы 24
1.2.3 АМРК - зависимые механизмы 27
2 Организация и методы исследований 35
2.1 Экспериментальные методы и подходы 35
2.1.1 Объект исследований 35
2.1.2 Изучение эффектов 30-суточного космического полета на спутнике БИОН-М1 на m. longissimus dorsi мышей 36
2.1.3 Антиортостатическое вывешивание крыс различной продолжительности с последующим 7 суточным восстановлением 36
2.1.4 Определение относительного содержания NO в m. soleus крыс на ранних этапах гравитационной разгрузки 37
2.1.5 Изучение воздействия безопорности на m. soleus человека с использованием модели «сухой» иммерсии 38
2.1.6 Введение ингибитора АМРК - Compound C на фоне 7-суточного восстановления 39
2.1.7 1-суточное антиортостатическое вывешивание задних конечностей крыс на фоне предварительного введения AICAR 40
2.2 Методики обработки биоматериала и анализа данных 40
2.2.1 ДДС-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом 40
2.2.2 Исследование экспрессии генов 44
2.2.3 Определение относительного содержания NO в мышце 48
2.2.4 Иммуногистохимическое выявление гистондеацетилазы 4 50
2.3 Анализ полученных данных 50
2.3.1 Анализ блотов 50
2.3.2 Анализ данных ПЦР-РВ 51
2.4 Статистическая обработка данных 51
3. Результаты исследования 52
3.1 Исследование влияния реальной и моделируемой микрогравитации на активность АМРК в постуральной мышце животных и человека 52
3.1.1 Изучение действия 30-суточного космического полета на активность АМРК в m. longissimus dorsi мышей 52
3.1.2 Оценка активности АМРК и протеолитических сигнальных путей в камбаловидной мышце человека после 3-суточной «сухой» иммерсии 53
3.1.3 Исследование динамики фосфорилирования АМРК и АСС в камбаловидной мышце крыс на 1, 3, 7 и 14-е сутки моделируемой гравитационной разгрузки 57
3.2 Исследование влияния АМРК на активность p70S6K, ключевого анаболического маркера, в камбаловидной мышце при разгрузке 59
3.2.1 Изучение динамики фосфорилирования p70S6K в камбаловидной мышце крыс на 1, 3, 7 и 14-е сутки моделируемой гравитационной разгрузки 59
3.2.2 Исследование действия активатора АМРК - AICAR на активность p70S6K в m. soleus крыс на начальном этапе гравитационной разгрузки 60
3.2.3 Исследование действия ингибитора АМРК Compound C на активность p70S6K в m. soleus крыс при восстановлении 61
3.3 Изучение эффектов применения активатора АМРК - AICAR в m. soleus крыс при кратковременной функциональной разгрузке 63
4 Обсуждение результатов 73
4.1 Влияние реальной и моделируемой микрогравитации на активность АМРК в постуральной мышце животных и человека 73
4.1.1 Воздействие 30-суточного космического полета на активность АМРК в m. longissimus dorsi мышей 73
4.1.2 Влияние 3-суточной «сухой» иммерсии на активность АМРК в камбаловидной мышце человека 74
4.1.3 Исследование динамики фосфорилирования АМРК в камбаловидной мышце крыс на 1, 3, 7 и 14-е сутки моделируемой гравитационной разгрузки 77
4.2 АМРК регулирует активность сигнального пути mTOR/p70S6K 79
4.2.1 Сравнительный анализ динамики активности АМРК и киназы p70S6K, ключевого регулятора синтеза белка в мышечном волокне 79
4.2.2 Роль АМРК в регуляции активности сигнального пути mTOR/p70S6K 81
4.2.3 Действие Compound C, ингибитора АМРК, на процессы восстановления в m. soleus крыс 82
4.3 Роль АМРК в процессах изменения экспрессии генов и ядерно-цитоплазматического трафика гистондеацетиллаз класса IIA в камбаловидной мышце крыс на начальном этапе гравитационной разгрузки 85
Заключение 90
Выводы 92
Список литературы 93
- Кальций-зависимые механизмы
- ДДС-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом
- Оценка активности АМРК и протеолитических сигнальных путей в камбаловидной мышце человека после 3-суточной «сухой» иммерсии
- Роль АМРК в процессах изменения экспрессии генов и ядерно-цитоплазматического трафика гистондеацетиллаз класса IIA в камбаловидной мышце крыс на начальном этапе гравитационной разгрузки
Введение к работе
Актуальность проблемы. При воздействии реальной или моделируемой невесомости в первую очередь страдают постуральные мышцы (Козловская и др., 1984; Оганов и др., 1988). При этом наблюдается уменьшение их жесткости, развитие мышечной атрофии и сдвиг миозинового фенотипа в быструю сторону (Kandarian et al., 2002; Козловская и др., 1984; Оганов и др., 1988; Adams et al., 1995; Baldwin et al., 1990). В основе мышечной атрофии, наблюдаемой при действии микрогравитации, лежит увеличение интенсивности протеолитических процессов и снижение уровня синтеза белка (Chopard et al., 2009; Bodine, 2013). Сдвиг миозинового фенотипа происходит в результате снижения экспрессии гена медленной изоформы тяжелых цепей миозина и увеличения экспрессии генов быстрых изоформ (Stevens et al., 2001; Giger et al, 2009; Lomonosova et al., 2016). Несмотря на интенсивные исследования мышечной атрофии и изменений экспрессии миозиновых генов, пусковые механизмы этих процессов в постуральных мышцах в условиях устранения опоры до сих пор остаются плохо изученными (Григорьев и др., 2004; Kawano et al., 2007; DeDoncker et al., 2005). Известно, что при действии гравитационной разгрузки наблюдается мгновенное прекращение электрической активности камбаловидной мышцы (по показателям электромиографии), которая постепенно восстанавливается к 6 суткам воздействия (Kawano et al., 2007; Alford et al., 1987; L-DeDoncker et al., 2005). Не исключено, что снижение/прекращение электрической активности мышцы, свидетельствующее о снижении ее сократительной активности, приводит к изменению баланса макроэргических молекул в сторону накопления полностью фосфорилированных соединений (Ohira et al., 1994). В работе Wakatsuki и соавторов было показано накопление креатинфосфата в камбаловидной мышце крыс после 10 дней антиортостатического вывешивания (Wakatsuki et al., 1994). Как известно, АМФ-зависимая протеинкиназа - это основной энергетический сенсор клетки, реагирующий на изменения соотношения макроэргических молекул. Мы предположили, что на начальном этапе гравитационной разгрузки прекращение электрической активности камбаловидной мышцы (по показателям электромиографии) должно сказываться на активности АМРК. На сегодняшний момент об активности AMPK на начальных этапах гравитационной разгрузки ничего не известно.
АМРК активно участвует в регуляции процессов белкового синтеза и распада (Hardie et al., 2012) и является негативным регулятором сигнального пути mTOR. Данные об активности p70S6K, ключевого анаболического маркера сигнального пути mTOR, в постуральных мышцах при действии гравитационной разгрузки противоречивы, а сведения о его состоянии на начальном этапе разгрузки весьма отрывочны (Miyazaki et al., 2008; Hornberger et al., 2001; Mirzoev et al., 2016). Возникает естественный вопрос, может ли гипотетическое изменение активности АМРК влиять на активность сигнального пути mTOR в постуральных мышцах при действии гравитационной разгрузки?
Было показано, что АМРК влияет на экспрессию ряда генов путем фосфорилирования гистондеацетилаз класса IIа (HDAC4, HDAC5, HDAC7), что приводит к их диссоциации от промоторов генов и удалению из ядра, открывая тем самым путь для экспрессии того или иного гена (Mihaylova et al., 2011; Rckl et al., 2007; McGee et al., 2010). Было показано, что уже на 1 сутки воздействия микрогравитации наблюдается снижение экспрессии мРНК медленной изоформы тяжелых цепей миозина (ТЦМ I()) в камбаловидной мышце крыс (Giger et al., 2009). Один из путей регуляции экспрессии ТЦМ в мышечных волокнах связан с фосфорилированием гистондеацетилазы 4 (HDAC4) (Liu et al., 2005; Шенкман, 2016). Однако остается неясным, при помощи каких механизмов происходит такое быстрое снижение экспрессии генов. Участвует ли АМРК в регуляции экспрессии генов ТЦМ в мышечных волокнах?
Литературные данные о состоянии ключевого регулятора внутриклеточного метаболизма - АМРК в условиях гравитационной разгрузки малочисленны. Хан и соавторы показали снижение фосфорилирования АМРК в камбаловидной мышце крысы после 14 суточного антиортостатического вывешивания (Han et al., 2007), Хильдер и соавторы обнаружили увеличение фосфорилирования АМРК (Hilder et al., 2005), а Егава с соавторами,
напротив, не отметили никаких изменений в фосфорилировании АМРК в камбаловидной мышце мышей после 14 суток вывешивания (Egawa et al., 2015). Так как существующие данные об активности АМРК в условиях гравитационной разгрузки противоречивы и получены при продолжительной экспозиции животных в условиях разгрузки, роль АМРК в процессах структурно-метаболической перестройки мышц в этих условиях остается неясной.
В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении роли АМФ-активируемой протеинкиназы в регуляции внутриклеточных сигнальных путей в m. soleus млекопитающих при гравитационной разгрузке.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Исследовать воздействие реальной и моделируемой гравитационной разгрузки на активность АМФ-активируемой протеинкиназы в постуральных мышцах человека и животных.
-
Изучить взаимосвязь АМРК и активности ключевого анаболического маркера p70S6K в камбаловидной мышце крыс на различных этапах гравитационной разгрузки и восстановления.
-
Проанализировать АМРК-зависимые механизмы ядерно-цитоплазматического трафика гистондеацетиллаз класса IIA на начальном этапе гравитационной разгрузки.
-
Оценить роль АМРК в процессах изменения экспрессии генов медленной и IIA изоформ ТЦМ в постуральной мышце крыс на начальном этапе гравитационной разгрузки.
Научная новизна работы
-
Впервые обнаружено снижение фосфорилирования АМФ-активируемой протеинкиназы в камбаловидной мышце человека после 3 суток безопорности.
-
Впервые выявлено снижение фосфорилирования АМФ-активируемой протеинкиназы в камбаловидной мышце крыс после первых суток антиортостатического вывешивания.
-
Впервые показано, что уже после 3-х суток моделируемой гравитационной разгрузки с использованием модели «сухой» иммерсии в камбаловидной мышце человека наблюдается активация протеолитических процессов, сопровождаемая существенной инактивацией nNOS.
-
Впервые зарегистрировано увеличение фосфорилирования рибосомальной киназы p70S6K в камбаловидной мышце крыс на начальном этапе гравитационной разгрузки.
-
Впервые обнаружена взаимосвязь изменений уровня фосфорилирования АМРК и активности рибосомальной киназы p70S6K в постуральной мышце крыс на разных сроках гравитационной разгрузки.
-
Впервые показано, что введение селективного ингибитора АМРК Compound C увеличивает активность p70S6K в камбаловидной мышце крыс при восстановлении после гравитационной разгрузки.
-
Впервые показано накопление HDAC4 и снижение содержания HDAC5 в ядерной фракции белков после 1-суточного вывешивания в m. soleus крыс. При этом с помощью AICAR выявлена ключевая роль АМРК в этих процессах.
-
Впервые показано, что введение активатора АМРК – AICAR на начальном этапе гравитационной разгрузки предотвращает снижение содержания предшественника мРНК ТЦМ I() в m.soleus крыс после первых суток антиортостатического вывешивания.
-
Впервые обнаружено наличие реципрокных взаимоотношений AMРK и протеинкиназы D в скелетной мышце на ранних сроках гравитационной разгрузки.
Научно-практическая значимость
Значимость этой работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о физиологических механизмах, запускающих процесс адаптации постуральных мышц к гравитационной разгрузке. Исследование роли АМРК в процессах развития мышечной атрофии в условиях реальной и моделируемой невесомости позволит раскрыть механизмы запуска атрофических изменений и позволит разработать более эффективные способы коррекции атрофии скелетных мышц. Данные, полученные в этой работе, смогут найти применение в космической и реабилитационной медицине. Основываясь на данных этого исследования, станет возможным использовать уже применяемые в медицине препараты и биологические добавки, для предотвращения развития атрофии мышц.
Положение, выносимое на защиту
Дефоcфоpилиpование АМФ-активиpуемой пpотеинкиназы – ключевое cигнальное cобытие начального периода функциональной pазгpузки, влияющее на пусковые механизмы основных структурно-метаболических процессов в инактивированной поcтуpальной мышце.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на: Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2014" (Москва, 2014); XIII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Егорова Б.Б. (Москва, 2014); 20-м Симпозиуме «Человек в космосе», (Прага, Чехия 2015); 44-й, 45-й Европейских мышечных конференциях (Варшава, Польша 2015; Монпелье, Франция 2016); 19-ой Школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2015); XIV Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 65-летию со дня рождения врача-космонавта Морукова Б.В. (Москва, 2015); XVI Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием (Москва, 2016); международной конференции "Рецепторы и Внутриклеточная Сигнализация" (Пущино, 2017); X, XI Международных Симпозиумах «Биологическая подвижность» (Пущино 2014, 2016); V Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2016); международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ (Иерусалим, Израиль 2017); XXIII Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Воронеж, 2017).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 14 тезисов докладов на конференциях, в том числе международных.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания организации экспериментов и методик обработки биологического материала, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 118 страницах печатного текста, включает 30 рисунков, 1 таблицу и список литературы из 228 наименований.
Кальций-зависимые механизмы
Механизмы, осуществляющие запуск гравитационно-зависимой перестройки скелетных мышц, до сих пор неизвестны. Какие физиологические изменения, наблюдаемые при разгрузке в мышечном волокне, являются центральными? При действии гравитационной разгрузки в мышечном волокне происходит увеличение концентрации кальция, как известно, кальций - это сигнальная молекула, осуществляющая регуляцию множества сигнальных протеинкиназ (Meissner et al., 2000; Shenkman et al., 2008; Hardie et al., 2008; Brown et al., 1991). Почему происходит накопление ионов кальция в мышечном волокне и может ли это служить пусковым механизмом для развития гравитационно-зависимой перестройки скелетных мышц?
Сообщения о накоплении Са2+ в иммобилизованной мышце начали появляться с начала 70-х годов (Booth, Giannetta, 1973). Ингалс и соавторы показали увеличение концентрации кальция в покоящемся мышечном волокне при функциональной разгрузке (Ingalls et al., 1999).
Сейчас рассматриваются два возможных источника накопления ионов кальция в мышечном волокне при гипогравитации (Tischler et al., 1990; Catterall, 1995; Yoshioka et al., 1996; Shenkman et al., 2008). Приток ионов Са2+ в миоплазму может осуществляться из внеклеточного пространства, а также посредством утечки из каналов саркоплазматического ретикулума. В 1996 году Йошиока и соавторы обнаружили, что после антиортостатического вывешивания наблюдается увеличение пассивного вытекания Са2+ из саркоплазматического ретикулума в мышечных волокнах, которое, очевидно, осуществлялось через каналы саркоплазматического ретикулума, сопряженные с рианодиновыми рецепторами (Yoshioka et al., 1996). В более ранних работах Тишлер и соавторы открыли возможную роль рианодиновых Са2+каналов при бездействии мышц (Tischler et al., 1990). Бастид и соавторы показали увеличение активности рианодинового рецептора 1-го типа в волокнах камбаловидной мышцы после вывешивания (Bastide et al., 2000). В то же время, Kandarian и соавторами было отмечено, что на ранней стадии разгрузки значительно увеличена экспрессия дигидропиридиновых каналов (Kandarian et al., 1992). При использовании селективного ингибитора кальциевых каналов L-типа накопление Са2+ в миоплазме камбаловидной мышцы при вывешивании не происходит (Mukhina et al., 2008). Если принять во внимание взаимосвязь между дигидропиридиновыми каналами и рианодиновыми рецепторами саркоплазматического ретикулума (Protasi, 2002), то можно предположить, что Са2+ каналы обоих типов являются источниками накопления кальция в покоящемся мышечном волокне при функциональной разгрузке.
До настоящего времени остается не выясненным, как включаются процессы накопления кальция в мышечном волокне при гипогравитации. Ряд исследователей высказывал предположение, что в условиях космического полета происходит снижение потенциала покоя в мышечных волокнах m. soleus (по неопубликованным данным Магазаника и др., см. обзор Shenkman et al., 2008), что было подтверждено в экспериментах с антиортостатическим вывешиванием крыс (Pierno et al., 2002). На третьих сутках антиортостатического вывешивания крыс обнаружено значительное снижение мембранного потенциала. Предполагается, что такое снижение мембранного потенциала связано с уменьшением электрогенного вклада Na, K – ATФазы за счет инактивации её 2 субъединицы (Kravtsova et al., 2016). Дигидропиридиновые рецепторы L-типа, чувствительные к нифедипину, являются потенциал зависимыми, снижение мембранного потенциала приводит к их частичной активации (Catterall, 1995). Таким образом, снижение мембранного потенциала при гравитационной разгрузке приводит к повышению проницаемости сарколеммы и мембраны саркоплазматического ретикулума для ионов Са2+. Са2+ служит посредником множества клеточных реакций, и изменение его концентрации приводит к множеству биологических эффектов на уровне органов и тканей. Повышение концентрации кальция в мышечном волокне в условиях гравитационной разгрузки приводит к активации кальпаин-зависимого протеолиза цитоскелетных белков и сдвигу миозинового фенотипа мышечных волокон в быструю сторону (Pette, 2006; Meissner et al., 2000; Wagatsuma et al., 2002; Shenkman et al., 2008; Shenkman, 2016).
Мышечная атрофия в условиях функциональной разгрузки развивается за счет снижения интенсивности анаболических процессов и увеличения интенсивности катаболических процессов (Bodine, 2013). Увеличение концентрации Са2+ приводит к активации катаболических процессов в мышечном волокне (Tischler et al., 1990; GarciaDiaz et al., 2006; Shenkman et al., 2008; Shenkman et al., 2015). В экспериментах с мышечной иммобилизацией было показано, что на фоне применения блокатора Са2+-каналов нифедипина происходит уменьшение проявлений мышечной атрофии (Soares et al., 1993; Wagatsuma et al., 2002). После 14 суток вывешивания на фоне введения нифедипина обнаружено снижение мышечной атрофии (Mukhina et al., 2008). Таким образом, накопление кальция в мышечном волокне во время функциональной разгрузки можно рассматривать как один из вероятных механизмов активации развития атрофических процессов.
Известно два типа Са2+ - зависимых протеаз кальпаинов. -кальпаины активируются микромолярными (физиологическими) концентрациями кальция, в то время как m-кальпаины активируются милимоллярными концентрациями кальция. Недавно было показано, что m-кальпаины (кальпаин-3), связанные с титином, могут быть активированы физиологическимим концентрациями кальция через активацию -кальпаинов (GarcaDaz et al., 2006). Основными субстратами кальпаинов являются цитоскелетные и миофибрилярные белки десмин, титин и дистрофин.
Ключевая роль кальпаинов в развитии атрофии при гравитационной разгрузке была доказана в работах Tidball и соавторов с трансгенными животными с повышенной экспрессией кальпастатина. Кальпастатин, синтезируемый в миофибриллах, является естественным ингибитором активности кальпаинов (Bartoli, Richard, 2005). У таких животных практически отсутствовала атрофия и не происходило транформации мышечных волокон камбаловидной мышцы при антиортостатическом вывешивании (Tidball, Spencer, 2002).
В системах in vitro было показано, что физиологические концентрации оксида азота могут также ингибировать активность кальпаинов (Michetti et al., 1995). Интересно, что активация кальпаинов при гравитационной разгрузке сопровождается понижением содержания нейрональной NO-синтазы в мышечных волокнах камбаловидной мышцы (Tidball et al., 1998). Из чего можно заключить, что концентрация ионов кальция, кальпастатин и оксид азота являются основными регуляторами кальпаин-зависимого протеолиза цитоскелетных белков.
Активность кальпаинов не ограничивается протеолизом цитоскелетных белков, некоторые кальпаины, например, кальпаин-3, способны активировать убиквитин-протеасомную систему, являющуюся более мощным протеолитическим инструментом клетки (Smith, Dodd, 2007; Kramerova et al., 2005). Энс и соавторы показали увеличение активности кальпаинов в гомогенате камбаловидной мышцы после 12-часового вывешивания, причем повышенный уровень активации кальпаинов оставался вплоть до 9-х суток вывешивания. Одновременно с этим авторы обнаружили значительное снижение содержания цитоскелетного белка десмина в мышцах голени крысы (Enns, Belcastro, 2006).
Вопрос о вкладе кальпаинов в общий процесс белковой деградации во время гравитационной разгрузки остается открытым. Ряд ученых в своих исследованиях показали, что вклад кальпаинов в протеолиз мышечного волокна составляет всего 10% (Taillandier et al., 1996), другие авторы продемонстрировали, что при ингибировании убиквитин-протеасомной системы так же происходит снижение активности кальпаинов до минимума (Smith, Dodd, 2007). Очевидно, что эти протеолитические системы в клетках мышечных волокон тесно взаимосвязаны и работают сообща в условиях функциональной разгрузки.
Известно, что избыточный Ca2+, накапливающийся во время мышечных сокращений, приводит к ингибированию процессов синтеза белка (Rose et al., 2009). Процесс синтеза белка включает в себя три стадии: инициация, элонгация и терминация. Регуляция трансляции осуществляется на стадии инициации и элонгации. Участвующие в этом процессе факторы трансляции подвержены влиянию различных стимулов. На стадии элонгации синтез белка зависит от активности элонгационного фактора eEF2. eEF2 представляет собой фосфопротеин, который связывает GTP. Этот фактор обеспечивает транслокацию рибосомы вдоль нити мРНК, что приводит к сдвигу на один кодон и пептидил-тРНК перемещается из А- в P-сайт (Jrgensen et al., 2006). Фактор элонгации eEF2 фосфорилируется специфичным ферментом - eEF2 киназой. Фосфорилирование eEF2 приводит к ослаблению взаимодействия этого фактора с рибосомой, то есть инактивирует его (Carlberg et al., 1990). Показано, что снижение уровня фосфорилирования eEF2 в скелетной мышце на 25% приводит к увеличению синтеза белка на 40% (Drummond et al., 2009). Активность eEF2 киназы регулируется концентрацией ионов Ca2+ и кальмодулином (Proud, 2007; 2015). Элонгация - это самая энергозатратная стадия синтеза белка. Известно, что АМРК способна регулировать активность eEF2 киназы. Активность eEF2K блокируется при действии киназ p90(RSKl) и p70S6K, регулируемых киназами ERK1/2 и комплексом mTORCl (Wang et al., 2001).
ДДС-электрофорез с последующим вестерн-блоттингом
Для проведения электрофореза в ПААГ с последующим вестерн-блоттингом проводили выделение тотального белка, ядерной и цитоплазматической фракции белков из образцов мышечной ткани. Для выделения ядерной и цитоплазматической фракции белков использовали набор NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction («Thermo Scientific», США). Сначала выделяли цитоплазматическую фракцию, а затем ядерную. Образцы m. soleus крыс нарезали на криостатитируемом микротоме Leica Microsystems (Германия), толщина срезов составляла 20 мкм. Далее срезы в количестве 40 мг помещали в эппендорф c лизирующим буфером CERI, содержащим ингибиторы: комплит мини («Roche», Германия), апротинин (20g/ml); леупептин (50g/ml); пепстатин А (20g/ml), фосфатазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA); PMSF (1mM). Затем пробы тщательно перемешивали на Microspin FV-2400 («Biosan», Латвия) в течение 30 секунд, после чего помещали на лед на 10 минут. К каждой пробе добавлялось по 22 мкл буфера CERII, образцы тщательно перемешивали в течение 30 секунд и помещали на лед на 1 минуту, затем снова перемешивали 30 секунд, после чего переносили в центрифугу («Hettich», Англия) и откручивали 10 минут на 16000g при температуре 4C. Супернатант отбирали в отдельный эппендорф, затем перемешивали и делали аликвоты цитоплазматической фракции белков по 20 мкл. К осадку добавляли по 238 мкл PBS, содержащего ингибиторы (комплит мини («Roche», Германия), апротинин (20g/ml); леупептин (50g/ml); пепстатин А (20g/ml), фосфатазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA); PMSF 1mM) и перемешивали на вортексе («Biosan», Латвия), затем переносили пробы в центрифугу («Hettich», Англия) и центрифугировали 5 минут на 16000g, далее убирали супернатант. Промывку с PBS проводили 2 раза. Затем к осадку добавляли по 245 мкл буфера NER с ингибиторами (комплит мини («Roche», Германия), апротинин (20g/ml); леупептин (50g/ml); пепстатин А (20g/ml), фосфатазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA); PMSF 1mM) перемешивали и помещали на лед на 40 минут и каждые 10 минут пробы тщательно перемешивали. Далее образцы переносили в центрифугу («Hettich», Англия) и центрифугировали 10 минут на 16000g при температуре 4C, после чего отбирали супернатант в эппендорф, тщательно перемешивали, переносили на колонки (Millipore, Ireland) и центрифугировали 10 минут при 14000g. Далее делали аликвоты ядерной фракции белков по 5 мкл.
Для выделения тотальной фракции белков на микротоме-криостате фирмы Leica Microsystems (Германия) делали срезы толщиной 20 мкм (10-15 мг) с каждого образца m.soleus и гомогенизировали 25 минут в 100 мкл лизирующего буфера RIPA (Santa-Cruz, USA), содержащего 50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.1% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0) 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1мМ Na3VO4, 1 mM PMSF, апортинин (10 g/ml), леупептин (10 g/ml), пепстатин А (10 g/ml), протеазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA) и фосфатазный ингибиторный коктейль (Santa-Cruz, USA). Далее образцы центрифугировали 15 минут на 20000g при температуре 4C. Супернатант аккуратно отбирали, тщательно перемешивали и делали аликвоты по 20 мкл.
Небольшую часть полученных лизатов отбирали для определения концентрации общего белка с помощью реактива Бредфорд (Bio-Rad Laboratories, США).
Пробы цитоплазматичеcкой и тотальной фракции белков для нанесения разводили в 2x-кратном Laemmli буфере (5,4 мМ TrisHCl (pH 6,8), 4%-ный Ds-Na, 20%-ный глицерин, 10%-ный меркаптоэтанол, 0,02%-ный бромфеноловый синий), а пробы ядерной фракции белков разводили в 4x-кратном Laemmli буфере. Все образцы хранили при -85С. Электрофорез проводили в 10%-ном разделяющем ПААГ (0,2%-ный бисакриламид, 0,1%-ный Ds-Na, 375 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 0,05%-ный персульфат аммония, 0,1%-ный ТЕМЕД) и в 5%-ном концентрирующем ПААГ (0,2%-ный бисакриламид, 0,1%-ный Ds-Na, 125 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 0,05%-ный аммоний персульфат, 0,1%-ный ТЕМЕД). Для проведения электрофореза использовали трис-глициновый буфер (192 мМ Tris-глицин (pH 8,6), 0,1%-ный Ds-Na). Образцы каждой группы загружались на один гель с контрольными образцами. Образцы загружались из расчета 20 мкг общего белка в каждой пробе на дорожку и нормировались относительно уровня GAPDH, содержащейся в той же пробе. Электрофорез проводился при 17 мА на гель в мини-системе («Bio-Rad Laboratories») при комнатной температуре.
Вестерн-блоттинг. Электроперенос белков проводили в буфере (25 мМ Tris (pH 8,3), 192 мМ глицин, 20%-ный метанол, 0,02%-ный Ds-Na) на нитроцеллюлозную мембрану при 100 V при температуре 4C в системе mini Trans-Blot («Bio-Rad Laboratories») для АМРК, p70S6K, pPKD, GAPDH, десмина в течение 120 минут. Для nNOS, ACC, HDAC4, HDAC5, IRS-1 электроперенос белков проводили в буфере (25 мМ Tris (pH 8,3), 192 мМ глицин, 20%-ный метанол, 0,04%-ный Ds-Na) при 350 V при температуре 4C в течение 90 минут. После электропереноса НЦ-мембраны инкубировали в течение 5 минут в 0,3%-ом растворе Ponceau Red в 5%-ой уксусной кислоте, затем отмывали в PST (Биолот) с 0,1% Tween20 (PBST) до появления четких белковых полос на блоте. Этот этап проводился для контроля эффективности переноса, а также для того, чтобы убедиться, что количество общего белка, нанесенного на каждую дорожку, было одинаковым. Далее НЦ-мембраны блокировали в 5% растворе сухого обезжиренного молока («Bio-Rad Laboratories») в PBST (PBS + 0,1% Tween 20) в течение 1 часа при комнатной температуре, затем помешали в раствор первичных антител на ночь. Для определения белковых полос использовали первичные поликлональные антитела к фосфо-AMPK (Thr 172; Ser 485/491; 1:500), p70S6K (1:1000), фосфо-p70S6K(Thr 389; 1:1000), IRS-1 (1:500), десмину(1:1000) фирмы «Santa Cruz» (США), AMPK (1:1000), HDAC4 (1:500), АСС (1:2000), фосфо-АСС (Ser79; 1:1000), фосфо-PKD (Ser 916; 1:1000) фирмы «Cell Signaling» (США), фосфо-nNOS (Ser1417; 1:500) фирмы «Millipore Chemicals» (США), nNOS (1:500) фирмы «BD Transduction Laboratories» (США), Lamin B1(1:500), HDAC5 (1:5000), GAPDH (1:10000) фирмы «Abcam» (США). Далее мембрана отмывалась от первичных антител в PBST 3 раза по 5 минут на шейкере. Затем мембрану инкубировали 1 час с вторичными антителами goat-anti-rabbit (1: 20 000, «Jackson Immuno Research», США) или goat-anti-mouse (1:18 000 «Bio-Rad Laboratories», США). Выявление белковых полос проводили с помощью набора ImmunStar Substrate Kit («BioRad Laboratories»). Анализ белковых полос проводили с использованием C-DiGit Blot Scanner (LI-COR Biotechnology, США). Для определения количества каждого анализируемого белка вестерн-блоттинг был повторен не менее 3 раз.
Оценка активности АМРК и протеолитических сигнальных путей в камбаловидной мышце человека после 3-суточной «сухой» иммерсии
Для исследования влияния моделируемой гравитационной разгрузки на активность АМРК в постуральной мышце человека был проведен анализ активности АМРК и сигнальных путей, инициирующих запуск протеолитических событий при кратковременном пребывании в условиях безопорности (Рис.7-12).
После 3-суточной «сухой» иммерсии в m. soleus наблюдалось снижение содержания цитоскелетного белка десмина на 10% по сравнению с фоновыми значениями (Рис.7а). При этом, у четырёх из шести испытуемых произошло снижение концентрации данного белка в диапазоне от 12 до 24% (Рис. 7б).
Мы не обнаружили достоверных изменений содержания тотальной nNOS в m. soleus после 3-суточной иммерсии (Рис.8а).
После окончания 3-суточной «сухой» иммерсии в m.soleus в целом наблюдалось достоверное снижение содержания фосфорилированной nNOS (Ser 1417) (Рис.9а). В группе чистой иммерсии у пятерых из шести испытуемых наблюдалось снижение данного белка в интервале от 39 до 84 %, а также снижение на 99% у первого испытуемого (Рис.9б).
Поскольку снижение содержания фосфорилированной формы nNOS может быть обусловлено уменьшением протеинкиназной активности каскада IGF-1/IRS-1/Akt, то важным фактором в этом случае оказывается содержание IRS-1. В целом содержание субстрата инсулинового рецептора IRS-1 в m. soleus после 3-суточной иммерсии не отличалось от фоновых значений (Рис.10а), за исключением двух испытуемых, у которых наблюдалось увеличение содержания данного белка (Рис. 10б).
Другим фактором, способствующим снижению активности nNOS, может оказаться уровень активности АМФ-активируемой протеинкиназы (Рис.11). После 3-суток сухой иммерсии содержание фосфорилированной АМРК (Thr 172) было достоверно снижено на 36% относительно контроля (Рис.11а). При этом у пятерых из семи испытуемых произошло снижение содержания фосфорилированной АМРК в интервале от 26 до 84%, у одного испытуемого отмечено повышение фосфорилирования этого белка на 29%. (Рис.11б).
Поскольку известно, что NO может участвовать в регуляции белкового метаболизма при разгрузке мышц, а определить относительное содержание NO в камбаловидной мышце человека при кратковременном воздействии моделируемой невесомости не представляется возможным, проводился анализ относительного содержания NO в камбаловидной мышце крыс после 1-суточного антиортостатического вывешивания (Рис.12).
Мы обнаружили достоверное снижение содержания NO на 55% относительно группы контроля в камбаловидной мышце крыс после 1-суточного антиортостатического вывешивания (Рис.12).
Роль АМРК в процессах изменения экспрессии генов и ядерно-цитоплазматического трафика гистондеацетиллаз класса IIA в камбаловидной мышце крыс на начальном этапе гравитационной разгрузки
Для решения третьей и четвертой задач диссертации мы проанализировали АМРК-зависимые механизмы ядерно-цитоплазматического трафика гистондеацетиллаз класса IIA и исследовали влияние дефосфорилирования АМРК на изменение экспрессии генов I и IIA изоформ ТЦМ в камбаловидной мышце крыс на начальных этапах гравитационной разгрузки.
Для изучения роли АМРК в процессах регуляции миозинового фенотипа мышечных волокон на ранних этапах гравитационной разгрузки и анализа сигнальных последствий дефосфорилирования АМРК, мы применяли активатор АМРК - AICAR.
Если верно наше предположение о том, что дефосфорилирование АМРК на начальной стадии разгрузки способствует снижению уровня экспрессии гена медленной изоформы ТЦМ (myh7), то мы должны ожидать отсутствие такого снижения у вывешенных животных с предобработкой AICAR и соответственно с контрольным уровнем фосфорилирования АМРК.
Мы обнаружили достоверное снижение содержания предшественника мРНК ТЦМI() и хорошо выраженную тенденцию к снижению содержания зрелой мРНК ТЦМI() после 24 часов экспозиции в условиях разгрузки (Рис.26,27). Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в аналогичных условиях, на животных Sprague-Dawley (Giger et al., 2009). Однако при воздействии AICAR снижение содержания предшественника и зрелой мРНК ТЦМI() не происходит (Рис.26,27).
Поскольку один из возможных механизмов воздействия АМРК на экспрессию генов медленного миозина и ферментов окислительного метаболизма связывают с фосфорилированием/дефосфорилированием гистондеацетилазы 4 и 5 (HDAC4/HDAC5) (Rckl et al., 2007; McGee et al., 2010), мы предположили, что в результате дефосфорилирования АМРК уже на первые сутки вывешивания в ядерной фракции m. soleus будет накапливаться HDAC4 и HDAC5. Это предположение подкреплялось результатами исследования ацетилирования гистона H3 при гравитационной разгрузке. Pandorf и соавторы обнаружили снижение содержания ацетилированных гистонов, связанных с промотором гена myh7 после 7-суточного вывешивания (Pandorf et al., 2009).
Кроме того, ранее было показано, что в волокнах медленного типа HDAC4 локализована преимущественно в цитоплазме, а в волокнах быстрого типа – в ядрах (Cohen et al., 2015). Действительно, нами было обнаружено накопление HDAC4 в ядерной фракции после 1-суточного вывешивания, причем под действием AICAR накопление HDAC4 в ядрах не происходит, что хорошо соотносится с данными по фосфорилированию АМРК и подтверждает нашу гипотезу (Рис.19,21,22). Недавно Yoshihara и соавторы обнаружили накопление HDAC4 в ядрах мышечных волокон m. gastrocnemius крысы после 10 дней иммобилизации в голеностопном суставе. Это накопление (как и в нашем эксперименте) сопровождалось снижением уровня фосфорилирования АМРК (Yoshihara et al., 2016). Эти данные также хорошо согласуются с результатами нашего эксперимента.
Что касается гистондеацетилазы 5, то даже некоторое повышение активности AMPK при предобработке животных AICAR в группе CA сопровождалось уменьшением ее содержания в ядерной фракции. Этот феномен можно связать с фосфорилированием HDAC5 под действием AMPK. Однако мы обнаружили уменьшение содержания HDAC5 в ядерной фракции после 1-суточного вывешивания (Рис.23). Это уменьшение могло быть вызвано либо ее фосфорилированием и экспортом из ядер, либо ее распадом. HDAC5 является мишенью не только AMPK, но и протеинкиназы D (PKD) (McGee et al., 2014; Ya, Rubin, 2011). Поскольку после первых суток разгрузки мы наблюдали снижение активности AMPK, то вряд ли можно связывать экспорт HDAC из ядер при разгрузке с действием этой протеинкиназы. Известно, что снижение активности AMPK приводит к значительному увеличению уровня фосфорилирования PKD (McGee et al., 2014). И, действительно, после 1-суточного вывешивания мы наблюдали достоверное и существенное увеличение фосфорилирования PKD по сайту Ser 916 (Рис.25), которого мы не обнаружили после вывешивания на фоне предобработки AICAR. Интересно, что такое снижение фосфорилирования PKD в группе HSA уменьшает снижение содержания HDAC5 в ядерной фракции почти в 2 раза (Рис.25,23). Обращает на себя внимание и то, что увеличение фосфорилирования PKD в группе HS никак не сказывалось на содержании ядерной HDAC4 (Рис.25,21), которое значительно превышало контрольный уровень. Очевидно, при гравитационной разгрузке HDAC4 не является мишенью PKD. В настоящем исследовании мы впервые наблюдали реципрокные отношения AMPK и PKD в инактивированной мышце. Кроме того, гравитационная разгрузка приводила к повышению уровня негативного фосфорилирования AMPK по сайту Ser485/491 (Рис.24), которое связывают с действием PKD (Coughlan et al., 2016). Однако аллостерическася активация AMPK с помощью AICAR в группе HSA снижала интенсивность негативного фосфорилирования, возможно, благодаря снижению фосфорилирования PKD.
Поскольку HDAC5, также как и HDAC4, связывают с деацетилированием гистона H3 и транскрипционного фактора Mef2D (т.е. с активностью промоторов ряда генов, в том числе myh7), можно предположить, что повышение активности PKD и экспорт HDAC5 из ядер при разгрузке предотвращает более глубокое снижение экспрессии ТЦМI().
Интересно, что достоверное и глубокое снижение содержания после 24-часовой разгрузки демонстрирует и мРНК ТЦМ IIA (Рис.28). Ранее нами было показано достоверное и значительное снижение экспрессии мРНК ТЦМ IIA после трех суток моделируемой гравитационной разгрузки (Lomonosova et al., 2016). Аналогичные данные были получены Stevens и соаторами (Stevens et al., 1999). В настоящем исследовании вполне подтверждается сходство характера экспрессии мРНК ТЦМI() и мРНК ТЦМ IIA при коротких сроках экспозиции в условиях разгрузки (Рис.27, 28). Поэтому можно предположить, что регуляция экспрессии мРНК ТЦМ IIA осуществляется с помощью таких же механизмов, как и ТЦМI(): кальцинейрин/NFAT-зависимых и АМРК-зависимых сигнальных каскадов.
Действительно, у вывешенных животных, предобработанных AICAR, снижения содержания мРНК ТЦМ IIA не наблюдается. Не исключено, что накопление HDAC4 в ядрах в первые сутки разгрузки также является причиной снижения экспрессии мРНК ТЦМ IIA (Рис.21,28).
Ранее неоднократно наблюдали значительное увеличение содержания мРНК ТЦМ II d/x после 3-4 суток вывешивания (Stevens et al., 1999; Lomonosova et al., 2016). Судя по результатам настоящего исследования, уже после 1-суток разгрузки регистрируется достоверное увеличение экспрессии мРНК ТЦМ IId/x, которое еще больше усиливается после 1-суток вывешивания у предобработанных AICAR животных (Рис.30). Следует отметить, что увеличение экспрессии мРНК ТЦМ IId/x после 1-суток разгрузки происходит на фоне дефосфорилирования АМРК и накопления HDAC4 в ядрах, что может неспецифически препятствовать транскрипционной активности. Поэтому, вполне возможно, что усиление экспрессии мРНК ТЦМ IId/x является следствием работы иных механизмов, не связанных с изменением киназной активности АМРК. Однако не исключено, что общая активация транскрипционной активности у вывешенных животных с предобработкой AICAR позволяет интенсифицировать синтез мРНК ТЦМ IId/x.
Ранее было зафиксировано усиление экспрессии и мРНК ТЦМ IIB после 3-4 суток вывешивания (Stevens et al., 1999; Lomonosova et al., 2016). Но, судя по результатам настоящего исследования, вывешивание в течение 1 суток оказывается недостаточным стимулом для того, чтобы индуцировать усиление экспрессии мРНК этой быстрой изоформы тяжелых цепей миозина (Рис.29). В то же время, удаление HDAC4 из ядер у вывешенных животных с предобработкой AICAR, по-видимому, создает предпосылки для некоторой интенсификации экспрессии этой мРНК, что мы и наблюдали в эксперименте.
Таким образом, результаты этого эксперимента ясно свидетельствуют о том, что дефосфорилирование АМРК по сайту Thr 172 в первые сутки моделируемой гравитационной разгрузки оказывает существенное влияние на экспрессию изоформ тяжелых цепей миозина, определяя снижение экспрессии пре-мРНК и мРНК ТЦМI(), а также мРНК ТЦМ IIA (Рис.26-28).
Полученные в этом эксперименте результаты так же свидетельствуют о том, что на ранних сроках гравитационной разгрузки HDAC4 не является мишенью PKD, и, вероятно, импорт в ядра HDAC4 осуществляется в результате снижения активности АМРК. Не исключено, что увеличение активности PKD приводит к экспорту HDAC5 из ядер, предотвращая тем самым более сильное снижение экспрессии генов при разгрузке. Мы впервые обнаружили наличие реципрокных взаимоотношений AMПK и PKD в скелетной мышце на ранних сроках гравитационной разгрузки.
Данные этого эксперимента показали, что дефосфорилирование АМРК участвует в парадоксальном увеличении фосфорилирования p70S6K в раннем периоде функциональной разгрузки.