Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Дофаминергическая система мозга в онтогенезе 10
1.1.1 Образование дофаминергических нейронов 11
1.1.2 Морфогенез развивающихся дофаминергических нейронов 12
1.1.3 Функциональная характеристика дофаминергических нейронов в онтогенезе 14
1.1.2 Нервная и гуморальная регуляция развития дофаминергической системы 23
1.2. Гематоэнцефалический барьер в онтогенезе 24
1.2.1 Общая структурно-функциональная характеристика гематоэнцефалического барьера 24
1.2.2 Формирование гематоэнцефалического барьера для катехоламинов 27
1.3. Периферическая дофамин-продуцирующая система в онтогенезе 28
1.3.1 Периферические органы, синтезирующие дофамин 28
1.3.2 Синтез дофамина в периферических органах 29
1.3.3 Запасание и выделение дофамина 30
1.3.4 Захват дофамина 31
1.3.5 Деградация дофамина 32
1.3.6 Рецепторы к дофамину 34
1.3.7 Паракринная и аутокринная роль дофамина в регуляции функционирования периферических органов-мишеней 35
1.3.8 Роль дофамина в развитии периферических органов-мишеней 36
1.4. Эндокринная регуляция дофамином секреции пролактина гипофиза 37
1.4.1 Гипоталамо-гипофизарная дофаминергическая система 38
1.4.2. Развитие гипофиза в онтогенезе 38
1.4.3 Гипоталамо-гипофизарная система циркуляции в онтогенезе 41
1.4.4 Роль дофамина в регуляции секреции пролактина у взрослых животных и в онтогенезе з
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1 Животные 44
2.2. Эксперименты 45
2.2.1. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс 45
2.3 Взятие и обработка материала 48
2.4. Методы 50
2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография 50
2.3.1 Иммуногистохимия 50
2.4.1 Иммуноферментный анализ 51
2. 3.4 Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени 51
2.4 Статистическая обработка результатов 53
ГЛАВА 3. Результаты 54
3.1. Определение влияния дофамина на синтез пролактина in vitro 54
3.1.1 Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки влияния дофамина на синтез пролактина in vitro 54
3.1.2 Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки специфичности влияния дофамина на синтез пролактина in vitro 55
3.2. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге крыс на П2 57
3.2.1 Концентрация ДА и его метаболитов в мозге, плазме крови, двенадцатиперстной кишке, желудке и почках после подкожного введения 6-ГДА 57
3.2.2 Концентрация дофамина и его метаболитов в мозге, плазме крови, двенадцатиперстной кишке, желудке, почках и надпочечниках после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 61
3.3. Оценка морфофункционального состояния медиобазального гипоталамуса при
хроническом выключении синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс 65
3.3.1 Концентрация ДА в гипоталамусе, стриатуме, среднем мозге, стволе и остальной
части мозга после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга
крысам на П2 65
3.3.2 Определение активности тирозингидроксилазы после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 66
3.3.3 Определение количества моно- и биферментных нейронов, синтезирующих дофамин в аркуатном ядре после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 67
3.4. Изучение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на
синтез пролактина in vivo 67
3.4.1 Определение содержания пролактина в гипофизе и плазме крови через 72 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга 67
3.4.2 Определение содержания мРНК пролактина и Д2-рецепторов в гипофизе через 72 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга. 68
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 69
4.1 Влияние дофамина на синтез пролактина гипофизом неонатальных крыс in vitro 70
4.2 Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс 72
4.3 Оценка морфофункционального состояния тубероинфундибулярной системы гипоталамуса при моделировании хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс 75
4.4 Определение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции на синтез пролактина in vivo 77
Заключение 79
Выводы 80
Cписок сокращений 81
Список литературы 82
- Функциональная характеристика дофаминергических нейронов в онтогенезе
- Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс
- Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки влияния дофамина на синтез пролактина in vitro
- Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс
Функциональная характеристика дофаминергических нейронов в онтогенезе
ДА синтезируется из общего клеточного метаболита тирозина в серии реакций, состоящей из двух шагов: тирозин превращается в L-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА) ферментом ТГ, из L-ДОФА образуется ДА под действием фермента декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (ДАА) (рисунок 2). Оба этапа синтеза происходят в цитоплазме [Iversen, 1967; Nagatsu, Sjarne, 1998].
ТГ относится к классу оксигеназ и катализирует присоединение гидроксильной группы к L-тирозину в мета-положении с образованием L-ДОФА. В качестве субстрата ТГ использует молекулярный кислород и тирозин. ТГ так же может осуществлять гидроксилирование фенилаланина до тирозина с последующим образование L-ДОФА [Fitzpatrick, 2000]. Константа Михаэлиса для тирозина лежит в микромолярных концентрациях, в связи с чем в тканях поддерживается его высокая концентрация. Кроме того, субстратом для ТГ могут так же являться аминокислотные аналоги тирозина, например, -метил-п-тирозин. Кофактором в данной реакции является тетрагидробиоптерин, выступающий в качестве донора водорода. В связи с тем, что тетрагидробиоптерин является кофактором в ряде других биохимических реакций (например, гидроксилирование триптофана в процессе метаболизма серотонина), его доступность является ограничивающим фактором в регуляции активности ТГ, что делает данный этап синтеза ДА скорость-лимитирующим [Nagatsu, Ichinose, 1999]. Активность ТГ регулируется по принципу отрицательной обратной связи продуктами синтеза – L-ДОФА, ДА и норадреналином. Еще одним путем регуляции активности ТГ является ее обратимое взаимодействие с полианионами (например, сульфат гепарина) или фосфолипидами (например, фосфатидилсерин), которое способствует снижению константы Михаэлиса для тетрагидробиоптерина. Кроме того, для регуляции ТГ осуществляется ее посттрансляционное фосфорилирование киназами, которые активируются входящими в клетку ионами кальция [Kumer, Vrana, 1996; Tank et al., 1998]. Уровень активности ТГ в различных областях мозга коррелирует с общим содержанием ДА [Iversen, 1967].
Финальным этапом синтеза ДА является декарбоксилирование L-ДОФА до ДА под действием ДАА. Кофактором в данной реакции является пиридоксаль фосфат (активная форма витамина В6). Константа Михаэлиса данной реакции для L-ДОФА достаточно низкая, а максимальная скорость реакции напротив высокая, что говорит о том, что под действием ДАА L-ДОФА достаточно быстро и продуктивно превращается в ДА. В ряде работ было показано, что активность ДАА во много раз выше активности ТГ [Levitt et al.,1965]. На активность ДАА оказывают влияние различные факторы. Так, ионы Mg2+, Ca2+ и Al3+ увеличивают активность фермента, а ионы Cu2+, Zn2+ и Hg2+ снижают ее [Christenson et al., 1970].
Наряду с L-ДОФА субстратом для ДАА могут также являться другие ароматические L-аминокислоты. Так, ДАА может катализировать превращение 5-гидрокситриптофана в серотонин и триптофана в триптамин [Elsworth, Roth, 1997].
Известно, что помимо истинно ДА-ергических нейронов, экспрессирующих оба фермента синтеза ДА, существуют также нейроны, содержащие по одному из ферментов. Такие моноферментные нейроны впервые были обнаружены в 80-ые годы прошлого века с помощью двойного иммуногистохимического мечения в различных отделах головного мозга [Meister et al., 1988; Okamura et al., 1988; Ugrumov, 2013]. Кроме того, в ряде работ было показано, что данные нейроны способны в кооперации совместно синтезировать ДА [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov, 2013].
Онтогенез Экспрессия ТГ в нейронах промежуточного мозга начинается не одновременно во всех популяциях нейронов, а в соответствии с дорсовентральным направлением. Так, например, в зоне инсерта (группа А13) ТГ начинает синтезироваться сразу после образования нейронов, а в аркуатном ядре (группа А12) лишь спустя несколько дней [Ugrumov et al., 1989b; Borisova et al., 1993; Balan et al., 1996].
Уровень синтеза ТГ постепенно увеличивается на протяжении второй недели постнатального развития, а активность продолжает возрастать вплоть до периода полового созревания [Kedzierski, Porter 1990; Arbogast, Voogt, 1991]. Для нейронов вентрального таламуса (А13) было показано, что экспрессия ТГ в данной области контролируется транскрипционными факторами cсемейства Dlx. Он начинает экспрессироваться на самых ранних этапах нейрогенеза (Э9-Э10,5 для мышей). Эндрюс с коллегами показали, что у нокаутных эмбрионов мышей Dlx1/2-/- экспрессия ТГ в нейронах группы А13 полностью отсутствует [Andrews et al., 2003].
Синтез ДА нейронами среднего мозга начинается сразу после их образования (у крыс на Э12,5). В стриатуме ДА начинает детектироваться лишь с Э16 [Fiszman et al., 1991].
Для нейронов среднего мозга было показано, что экспрессия гена ТГ контролируется несколькими транскрипционными факторами. Так, ядерные рецепторы Nurr1 индуцируют экспрессию ТГ в развивающихся ДА-ергических нейронах. Было показано, что у эмбрионов нокаутных мышей Nurr1-/- в нейронах среднего мозга не запускается экспрессия ТГ, в то время как в популяциях нейронов, расположенных в других отделах мозга, ТГ экспрессируется на нормальном уровне [Zetterstrom et al., 1997; Castillo et al., 1998; Saucedo-Cardenas et al., 1998; Smits et al., 2003]. Еще одним транскрипционным фактором, влияющим на экспрессию ТГ в данной области является Ptx3. У мутантных мышей Ptx3-/-, так же как и у мышей Nurr1-/- , в нейронах среднего мозга ТГ не экспрессируется вообще [Smidt et al., 2003].
Как и в случае ТГ, экспрессия ДАА происходит в соответствии с дорсовентральным градиентом [Jaeger, 1986]. Несмотря на то, что отсутствуют специальные исследования последовательности экспрессии ТГ и ДАА в нейронах гипоталамуса, по всей вероятности, в процессе развития реализуются оба варианта – экспрессия ТГ предшествует ДАА и наоборот. Так, существует мнение, что в некоторых случаях ДАА может экспрессироваться еще до момента образования ДА-ергических нейронов, т.е. в нейроэпителиальных клетках-предшественниках, тогда как экспрессия ТГ начинается после выселения нейронов в места их окончательной закладки [Teitelman et al., 1983].
В некоторых отделах гипоталамуса, например в аркуатном ядре, истинные ДА-ергические нейроны у незрелорождающихся животных появляются только в постнатальном периоде развития. Так, доля нейронов, экспрессирующих одновременно ТГ и ДАА, в аркуатном ядре крысы до П9 не превышает 30%, а в пренатальном периоде составляет всего 1 % (Ershov, 2002). Было показано, что данные моноферментные нейроны осуществляют совместный синтез ДА. В пренатальном и раннем постнатальном периоде развития данный путь синтеза ДА в аркуатном ядре является основным [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov, 2013]. Рисунок 2 – Схема синтеза дофамина
Как уже было отмечено ранее, превращение тирозина в L-ДОФА, и L-ДОФА в ДА происходит в цитоплазме. Вновь синтезированный ДА запасается в везикулы. Транспорт ДА в везикулы обеспечивается специфическим везикулярным моноаминовым транспортером 2-ого типа (ВМАТ2). Он представляет собой белок с двенадцатью трансмембранными доменами, который может осуществлять транспорт через везикулярную мембрану различных биогенных аминов. Механизм переноса КА через мембрану является АТФ-зависимым процессом, ассоциированным с протонной помпой. Концентрация КА внутри везикул может достигать 0,5 моль/л. Везикулы в ДА-ергическом нейроне выполняют ряд важных функций: 1) предотвращение ферментативной деградации ДА под действием моноаминоксидазы (МАО); 2) предотвращение выделения ДА из клетки при помощи диффузии; 3)упрощение регуляции высвобождения медиатора; 4) быстрое восстановление истощенных запасов нейротрансмиттера [Ben-Jonathan 2001]; 5) существует гипотеза, согласно которой везикулы предохраняют клетку от токсического действия ДА [Lohr et al. 2014].
Существует 2 вида везикул, содержащих ДА: мелкие полупрозрачные пузырьки, которые называются синаптическими везикулами, и большие плотные пузырьки, которые называются секреторными гранулами [Millhorn, Hokfelt, 1988]. Первые формируют так называемый функциональный (легко выделяемый) пул ДА, который расположен в непосредственной близости пресинаптической мембраны. При активации кальциевых каналов везикулы мгновенно сливаются с мембраной, и происходит высвобождение медиатора в синаптическую щель. Секреторные гранулы формируют так называемый резервный пул, он начинает реагировать на потенциал действия только при полном истощении функционального пула. При этом 30% ДА находится в функциональном пуле и 70% в резервном [Iversen, 2010] (рисунок 3).
Выделение ДА в синаптическую щель может быть стимулированным и спонтанным. Считается, что спонтанное выделение является Ca2+-независимым процессом, однако, существуют данные, согласно которым кальций может принимать участие в данном процессе. Физиологическая роль спонтанного выделения является недостаточно хорошо изученной. Так, долгое время считалось, что оно приводит лишь к потере незначительного количества медиатора и не играет какой-либо важной роли [Raiteri et al., 1979]. Однако существуют данные, согласно которым данный вид выделения играет важную роль в регуляции синтеза дендритных белков и таким образом влияет на экспрессию рецепторов на постсинаптической мембране [Glitsch, 2008].
Стимулированное выделение является Ca2+-зависимым процессом. С его помощью происходит синаптическая передача сигнала от нейрона к нейрону [Elsworth, Roth, 1997].
В большинстве нейронов медиатор после выделения в синаптическую щель связывается с рецепторами на постсинаптической мембране. Однако нейросекреторные нейроны гипоталамуса не имеют настоящих синаптических контактов. В данном случае ДА диффундирует через периваскулярное пространство и транспортируется по сосудам портальной системы циркуляции к гипофизарным клеткам-мишеням. Скорость высвобождения медиатора из таких нейронов гораздо ниже, чем из классических [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001].
Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс
Лактотрофы – эозинофильные клетки, расположенные в передней доле гипофиза. У крыс лактотрофы сосредоточены в вентролатеральном отделе передней доли гипофиза и вдоль ее границы с промежуточной долей [Tougard, Tixier-Vidal, 1988; Scully, Rosenfeld, 2002].
Лактотрофы отличаются наличием хорошо развитого секреторного аппарата, включающего стэки параллельных цистерн эндоплазматического ретикулума и комплекс Гольджи, а также различные по размеру секреторные гранулы. В зависимости от размера секреторных гранул в популяции лактотрофов выделяют три типа клеток: первый тип содержит маленькие (100 нм) сферические гранулы; второй - полиморфные гранулы среднего размера (150-250 нм), третий тип клеток отличается наличием довольно крупных (300-700 нм) плеоморфных гранул. Данные морфологические особенности обусловлены функциональной гетерогенностью различных видов клеток. Так, клетки с маленькими секреторными гранулами интенсивно выделяют ПРЛ, при этом фактически не запасая его. Клетки с большими секреторными гранулами, напротив, содержат большое количество ПРЛ, при этом выделяя его достаточно слабо [Childs, 2006; Takahashi, 1995].
Кроме истинных лактотрофов, т.е. клеток, которые синтезируют только ПРЛ, существуют также клетки, в которых одновременно идет синтез сразу двух гормонов – гормона роста и ПРЛ. Данные клетки были названы мамосоматотрофами. Было показано, что их количество зависит от уровня стероидных гормонов в организме. Считается, что они выполняют резервную функцию [Frawley et al., 1991; Kineman et al., 1991; Porter et al., 1991].
Данные о том, когда происходит появление лактотрофов в онтогенезе, весьма противоречивы. Наиболее раннее обнаружение лактотрофов датируется Э16 [Nemeskeri et al., 1988], однако, ряд исследователей впервые выявляют лактотрофы в передней доле гипофиза в первые дни после рождения [Hoeffler et al., 1985]. Наиболее часто встречаются работы, в которых лактотрофы впервые выявляют в конце эмбрионального периода на Э18-Э21 [Takahashi, 1995]. Период активной пролиферации лактотрофов приходится на первые недели постнатального развития [Takahashi, 1995; Taniguchi et al., 2002]. Дифференцировка лактотрофов в гипофизе идет в рострокаудальном и вентродорсальном направлениях [Nemeskeri, 1988]. Существование региональной разницы в дифференцировке лактотрофов показывает, что есть факторы, которые отвечают за дифференцировку клеток гипофиза. Считается, что нормальная дифференцировка лактотрофов у неонатальных крысят стимулируется материнскими сигналами, поступающими с молоком [Porter et al., 1991]. Такими сигналами могут быть гонадотропин-рилизинг гормон [Baram et al., 1977; Amarant et al., 1982; Smith, Ojeda, 1984], тиреотропин-рилизинг гормон [trbk et al., 1980; Heritier, Dubois, 1993], нейротензин [Westrom et al., 1987]; соматотропин-рилизинг гормон [Werner et al., 1988]; соматостатин [Takeyama et al., 1990], эпидермальный фактор роста [Carpenter, 1980], инсулиноподбный фактор роста [Prosser et al., 1991] и др. Считается, что данные сигнальные молекулы могут принимать участие в регуляции экспрессии гена ПРЛ, взаимодействуя с транскрипционным фактором Pit-1 [Takahashi, 1995; Denef, 2003; Scully, Rosenfeld, 2002].
В экспериментах in vitro было показано, что спонтанное выделение ПРЛ начинается одновременно с его синтезом [Khorram et al., 1984; Nemeskeri et al., 1995]. В пренатальном периоде ПРЛ выделяют лишь 5% всех лактотрофов. После рождения число клеток, выделяющих ПРЛ, растет и к П10 достигает 35% [Nemeskeri et al., 1995].
Кровоснабжение гипофиза осуществляется из верхних и нижних гипофизарных артерий, являющихся ответвлениями внутренней сонной артерии. Верхние гипофизарные артерии вступают в воронку гипоталамуса и, проникая в мозг, разветвляются в первичную гемокапиллярную сеть; эти капилляры собираются в портальные вены, которые направляются по ножке в переднюю долю гипофиза, где снова разветвляются на капилляры, образуя вторичную капиллярную сеть. Нижние гипофизарные артерии снабжают кровью преимущественно заднюю долю. Верхние и нижние гипофизарные артерии анастомозируют друг с другом. Венозный отток происходит в пещеристые и межпещеристые синусы тврдой мозговой оболочки [Page, 1986; Fing, 2012]
Сосудистая сеть всех компонентов гипофиза образуется из поверхностной сети кровеносных сосудов, охватывающей прозэнцефалический желудочек. Первичные портальные вены появляются на Э13, а васкуляризация передней доли гипофиза видна уже на Э15. Крупные портальные вены появляются на Э16 [Szabo, Csanyi, 1982]. Промежуточная доля гипофиза и срединное возвышение остаются неваскуляризованными на протяжении всего эмбрионального периода [Szabo, Csanyi, 1982]. Несмотря на то, что в ряде работ капилляры на поверхности срединного возвышения обнаруживают еще до рождения, внутреннее сплетение капиллярных петель развивается после рождения и окончательно формируется к концу первой недели постнатального развития [Page, 1986; Glydon, 1957]. Считается, что из-за недоразвития портальной системы циркуляции гипоталамические факторы не оказывают влияния на развитие гипофиза в перинатальном периоде онтогенеза [Chatelain et al. 1976; Watanabe, Daikoku 1976; Gash et al. 1977; Begeot et al. 1981].
В конце 1970-х годов впервые было показано, что тоническое ингибирующее влияние ДА на секрецию ПРЛ лактотрофами гипофиза опосредовано через Д2-рецепторы. Существует две изоформы Д2-рецепторов: короткая Д2к и длинная Д2д. Обе изоформы кодируются одним геном и приобретают специфическую структуру в процессе альтернативного сплайсинга. Они имеют аналогичные фармакологические свойства и совместно экспрессируются в одних и тех же клетках, однако, могут быть сопряжены с различными G-белками. Обе изоформы ингибируют аденилатциклазу, а Д2к также участвует в фосфолипазном сигнальном пути. Д2д изоформа является преобладающей [Missale et al., 1998; Ben-Jonathan, Hnasko, 2001].
Несмотря на то, что физиологический эффект ингибиторного воздействия ДА на секрецию ПРЛ описан достаточно давно, точный механизм данного процесса до сих пор обсуждается. Считается, что в течение первых нескольких секунд воздействия ДА вызывает гиперполяризацию клеточной мембраны, что приводит к инактивации кальциевых каналов и снижению уровня внутриклеточного кальция. В результате происходит подавление выделения ПРЛ. Если ДА воздействует на Д2-рецепторы более продолжительный промежуток времени (от нескольких минут до нескольких часов), то происходит подавление активности аденилатциклазы и метаболизма инозитолфосфата, что приводит к подавлению экспрессии гена ПРЛ, а также к изменениям в морфологии клеток. При воздействии ДА продолжительностью более 12 часов происходит подавление пролиферации лактотрофов и уменьшение размеров гипертрофированных лактотрофов [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001; Gregerson et. al., 2001]. Кроме того, в нескольких работах было показано, что низкие концентрации ДА (0,1нМ) способны стимулировать выделение ПРЛ [Denef et al., 1980; Burris, Freeman, 1993]. Однако данный вопрос является весьма спорным и требует дополнительного изучения.
Было показано, что Д4-рецепторы также экспрессируются в передней доле гипофиза, однако, их роль до сих пор остается неясной [Van Tol et al., 1992; Missale et al., 1998]. Онтогенез Д2-рецепторы начинают экспрессироваться в гипофизе достаточно рано – на Э16 у крыс [Sales et al., 1989]. Однако ингибирующее влияние ДА на секрецию ПРЛ впервые выявляют лишь на Э20, что может быть связано с достаточно поздней дифференцировкой самих лактотрофов [Melnikova et al., 1998].
Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки влияния дофамина на синтез пролактина in vitro
У взрослых животных ДА обеспечивает тонический ингибиторный контроль секреции ПРЛ [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Вопрос о том, когда устанавливается гипоталамический контроль функционирования гипофиза до сих пор остается открытым. С одной стороны, большинство гипоталамических факторов, в том числе и ДА, начинают синтезироваться в мозге млекопитающих достаточно рано (еще до рождения) [Ugrumov et al., 1989; Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994] . Фактически одновременно с началом синтеза ДА в мозге в гипофизе появляются Д2-рецепторы к ДА [Sales et al., 1989]. Эти данные дают основание предполагать, что установление гипоталамического дофаминового контроля секреции ПРЛ возможно еще в пренатальном периоде развития. С другой стороны, существует предположение, согласно которому гипоталамические факторы никак не влияют на развитие и функционирование гипофиза в пренатальном периоде, так как внутренне сплетение капиллярных петель срединного возвышения формируется лишь к концу первой недели постнатального развития [Chatelain et al. 1976; Watanabe, Daikoku 1976; Gash et al. 1977; Begeot et al. 1981]. Однако ранее в нашей лаборатории были полученны данные, согласно которым галоперидол, антагонист рецепторов к ДА, повышает уровень ПРЛ в плазме крови впервые на Э20, что свидетельствует о включении дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактина в данный период [Melnikova et al., 1998]. Еще одним интересным фактом является то, что в отсутствие ГЭБ, который у крыс для катехоламинов формируется лишь к концу второй недели постнатального развития [Kostrzewa, 2007; Miyaguchi et al., 1999], весь мозг в целом может выделять в общую систему циркуляции физиологически активные вещества и, таким образом, оказывать влияние на развитие и функционирование периферических органов-мишеней [Ugrumov, 2010]. В данной гипотезе, которая была выдвинута в нашей лаборатории, можно выделить два принципиально важных момента: во-первых, мозг в период с момента образования нейронов и начала специфического синтеза физиологически активных веществ может являться их источником в общей системе циркуляции до закрытия ГЭБ; во-вторых, данные вещества, поступающие из мозга в общую систему циркуляции, могут оказывать влияние на развитие и функционирование периферических органов мишеней. На модели кратковременного специфического ингибирования синтеза ДА в мозге неонатальных крыс были получены прямые доказательства того, что мозг является источником ДА в общей системе циркуляции. При этом в периферической крови создается физиологически активная концентрация ДА, сопоставимая с таковой в гипоталамо-гипофизарной портальной системе циркуляции у взрослых животных [Сайфетярова и др. 2011; Ugrumov et al., 2012]. Принимая во внимание данный факт, можно предположить, что дофаминовый контроль секреции ПРЛ в перинатальном периоде онтогенеза может осуществляться как через портальную систему циркуляции нейронами тубероинфундибулярной системы гипоталамуса, так и нейронами других ДА-ергических популяций мозга через общую систему циркуляции. Изучение данного вопроса является очень важным как с точки зрения доказательства второй части нашей гипотезы об эндокринном влиянии развирающегося мозга на периферические органы-мишени, так и с точки зрения понимания процесса становления нейроэндокринной регуляции функционирования гипофиза гипоталамусом.
Первая часть данной работы посвящена вопросу о том, какое влияние может оказывать ДА на функционирование лактотрофов гипофиза в неонатальном периоде онтогенеза. Считается, что у взрослых животных длительность действия ДА на Д2-рецепторы на лактотрофах обуславливает различные эффекты на секрецию ПРЛ. Так, кратковременное влияние ДА (от нескольких секунд до нескольких минут) приводит к инактивации кальциевых каналов и снижению уровня внутриклеточного кальция, в результате чего происходит ингибирование выделения ПРЛ. Влияние на синтез ПРЛ осуществляется посредством изменения активности аденилатциклазы, что требует значительно большего времени воздействия (по различным данным от нескольких минут до нескольких часов) [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Ранее в нашей лаборатории в экспериментах ex vivo при кратковременной инкубации гипофизов неонатальных крыс в Кребс-Рингер буфере были получены доказательства того, что ДА в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови неонатальных крыс, оказывает ингибирующее влияние на выделение ПРЛ из лактотрофов гипофиза [Сайфетярова и др. 2012]. Однако инкубация «переживающих» гипофизов возможна в течение относительно короткого времени, что позволяет судить только о регуляции выделения ПРЛ, но не его синтеза. Поэтому для выяснения возможности влияния ДА на синтез ПРЛ в ходе данной работы использовали органотипическую культуру, что позволило поддерживать жизнеспособность ткани в течение гораздо более длительного времени по сравнению с инкубацией в Кребс-Рингер буфере. В проведенных нами ранее экспериментах было показано, что концентрация ДА в плазме крови 3-дневных крыс, у которых отсутствует ГЭБ, составляет 1,9 нг/мл и снижается до 0,4 нг/мл после специфического ингибирования синтеза ДА в мозге (Сайфетярова и др., 2011, Ugrumov et al., 2012). Следовательно, доля ДА мозгового происхождения составляет 1.5 нг/мл. Именно в этой концентрации добавляли ДА в культуру аденогипофиза в данной работе. Показателем изменения уровня синтеза ПРЛ служило его суммарное содержание в ткани и среде. При использовании такой in vitro модели важно было контролировать, в каком функциональном состоянии находится ткань гипофиза в процессе инкубирования. Для этого мы использовали стандартную методику подсчета живых и мертвых клеток в камере Горяева в ткани гипофизов после инкубации при окрашивании красителем трипановым синим. После содержания ткани гипофизов в условиях in vitro в течение суток количество живых клеток составляло около 70%.
Через два часа после начала инкубации органотипической культуры гипофизов с ДА в концентрации 1,5 нг/мл наблюдалось достоверное снижение концентрации ПРЛ в инкубационной среде. Эти данные еще раз подтверждают, что ДА в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови неонатальных крыс, оказывает влияние на выделение ПРЛ лактотрофами гипофиза. Через восемь часов после начала инкубации гипофизов двухдневных крыс в культуральной среде, содержащей ДА, суммарное содержание ПРЛ в клетках гипофиза и в среде достоверно уменьшалось по сравнению с контролем, что является доказательством ингибирующего влияния ДА на синтез ПРЛ.
Для доказательства специфичности действия ДА, гипофизы культивировали в течение того же времени (8 часов) в среде в присутствии одновременно ДА и галоперидола – ингибитора рецепторов к ДА на лактотрофах гипофиза. При этом суммарное содержание ПРЛ в клетках гипофиза и в среде сохранилось на уровне контроля. Другими словами, галоперидол вызвал «отмену» действия ДА, что доказывает специфичность его ингибирующего влияния на синтез ПРЛ лактотрофами.
Несмотря на то, что полученные нами данные о влиянии ДА на синтез ПРЛ являются достаточно убедительными, исследования in vitro, как правило, не дают полной картины физиологических процессов, протекающих в организме. Лактотрофы в условиях in vivo находятся под постоянным тоническим воздействием ДА, при этом в условиях in vitro клетки гипофиза долгое время содержатся в среде без ДА, что, по мнению некоторых ученых, может качественно менять физиологию клетки. Кроме того, в данной серии экспериментов мы оценивали влияние той концентрации ДА, которая поддерживается в периферической крови неонатальных крыс, но при этом до сих пор неизвестно в какой концентрации находится ДА в портальной крови. На данный момент решение этого вопроса представляется методически невыполнимым, так как портальные сосуды неонатальных животных настолько малы, что нет возможности их конюлирования. То есть используемый нами в данной работе подход не дает нам возможности оценить через какую именно систему циркуляции (портальную или общую) идет регуляция секреции ПРЛ. Анализ литературных данных позволил нам предположить, что данную проблему можно решить при хроническом (длительном) ингибировании синтеза ДА в мозге с помощью 6 гидроксидофамина (6-ГДА) - специфического нейротоксина КА-ергических нейронов. 6-ГДА является наиболее распространенным нейротоксином, используемым при моделировании дефицита ДА [Kostrzewa, Jacobowitz, 1974; Blum et al., 2001] . Он представляет собой гидроксилированный аналог ДА. Специфичность воздействия 6-ГДА обусловлена тем, что он может поступать в клетку лишь с помощью переносчиков ДА и норадреналина. После попадания в клетку 6-ГДА ингибирует процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях, что приводит к ее гибели [Blum et al., 2001]. То есть использование данного нейротоксина позволит нам получить хроническое снижение уровня ДА в мозге неонатальных крыс. Кроме того, в ряде исследований было показано, что ДА-ергические нейроны тубероинфундибулярной системы имеют низкую чувствительность к различным нейротоксинам, в том числе и к 6-ГДА, по сравнению с другими ДА-ергическими нейронами мозга [Yokoyama et al., 1992; Benskey et. al., 2012, 2013]. Поэтому можно ожидать, что при введении в мозг он вызовет дегенерацию ДА-ергических нейронов, расположенных в основном за пределами тубероинфундибулярной системы. В связи с этим данную модель, вероятно, можно будет использовать для дифференцированной оценки влияния ДА, поступающего к гипофизу через общую систему циркуляции, на функционирование лактотрофов у неонатальных животных.
Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс
Введение 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга через 96 часов привело к значительному снижению концентрации ДА в стриатуме, среднем мозге и стволе, в то время как в гипоталамусе никаких изменений выявлено не было. В желудке, двенадцатиперстной кишке и почках концентрация ДА также не изменилась, что свидетельствует о специфическом выключении синтеза ДА в мозге, но не в периферических органах. Однако, вопреки нашим ожиданиям, концентрация ДА в плазме крови не изменилась по сравнению с контролем. При этом в надпочечниках наблюдалось ее достоверное увеличение. Согласно литературным данным, хромаффинные клетки надпочечников экспрессируют Д2-рецепторы к ДА. Считается, что ДА таким образом влияет на проводимость кальциевых каналов, и, соответственно, на выделение КА [Bigornia et al., 1988; Kujacic et al., 1990]. В связи с этим мы предположили, что длительное снижение ДА в плазме крови могло привести к усилению секреции ДА надпочечниками через 96 часов. Для того чтобы избежать влияния компенсаторных процессов на уровень ДА в плазме, в следующей серии экспериментов мы сократили время воздействия нейротоксина на организм до 72 часов.
При стереотаксическом введении 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки концентрацию ДА определяли в целом мозге, чтобы сопоставить изменения концентраций ДА в мозге и плазме крови. Через 72 часа после введения 6-ГДА было показано снижение концентрации ДА в мозге на 54 %. При этом в плазме крови наблюдалось резкое (на 73%) снижение уровня ДА. Таким образом, нам удалось свести компенсаторные процессы в организме к минимуму и показать, что мозг играет ведущую роль в формировании физиологически активной концентрации ДА в крови. В почках, желудке и двенадцатиперстной кишке и надпочечниках после введения нейротоксина не произошло достоверных изменений концентрации ДА. Концентрация норадреналина в мозге снижалась незначительно, а в плазме крови и периферических органах оставалась неизменной, что говорит о нейроспецифичности разработанной модели.
Следующей задачей данной работы являлось изучение на разработанной модели морфофункционального состояния ДА-ергических нейронов в туберо-инфундибулярной системе, а, следовательно, возможности ее дальнейшего использования для дифференциальной оценки дофаминовой регуляции секреторной активности лактотрофов гипофиза через портальную и общую систему циркуляции. В отличие от взрослых животных, у которых ДА, поступающий из гипоталамуса к гипофизу, регулирует функционирование периферических мишеней только через портальную систему циркуляции, у неонатальных животных, согласно нашей гипотезе, ДА в отсутствие ГЭБ может также поступать из всех популяций нейронов непосредственно в общую систему циркуляции. Ранее нам не удавалось разобщить эти два пути эндокринной регуляции у неонатальных животных.
Было показано, что уровень экспрессии ДАТ в нейронах гипоталамуса достаточно низкий [Elsworth, Roth, 1997]. Это можно объяснить тем, что большинство нейронов данной области не образуют классических синапсов и являются нейросекреторными, то есть нейромедиаторы из них выделяются не в синаптическую щель, а в сосуды портальной системы циркуляции и действуют на мишени как гормоны [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Однако у взрослых животных введение 6-ГДА в боковые желудочки мозга вызывает гибель ДА ергических нейронов медиобазального гипоталамуса, хотя данный эффект менее выражен, чем, например, в нигростриатной системе [Bell et al., 1970]. По литературным данным, 6-ГДА у неонатальных животных не вызывает дегенерацию ДА-ергических нейронов тубероинфундибулярной системы, что связывают с недостаточным уровнем развития механизмов захвата [Towle et al., 1989; Yokoyama et al., 1992]. Эти данные дали нам возможность предположить, что на разрабатываемой модели хронического выключения синтеза ДА в мозге нам удастся разобщить описанные выше пути регуляции функциональной активности лактотрофов гипофиза ДА мозгового происхождения. На основании имеющихся в литературе данных нельзя сделать однозначный вывод о том, что эффекты, которые будут наблюдаться на модели, обусловлены только ДА, поступающим из мозга в общую систему циркуляции. Для того чтобы оценить, влияет ли нейротоксин на ДА-синтезирующие нейроны аркуатного ядра, мы, в первую очередь, оценили содержание ДА и его метаболитов в данной области после введения 6-ГДА. Было показано, что на разработанной модели уровень ДА в медиобазальном гипоталамусе не меняется по сравнению с контролем, в то время как в стриатуме, среднем мозге и стволе наблюдается его достоверное снижение. Эти данные можно рассматривать как интегральный показатель того, что секреторная активность гипоталамуса не меняется под действием токсина.
Синтез ДА осуществляется из аминокислоты тирозина с помощью двух ферментов: ТГ и ДАА. В данной цепи реакций скорость лимитирующим этапом является синтез L-ДОФА из тирозина под действием ТГ [Nagatsu, 2006]. Поэтому в качестве прямого показателя синтеза ДА на разработанной модели мы оценивали активность данного фермента путем определения накопления L-ДОФА в медиобазальном гипоталамусе после ингибирования второго фермента сминтеза ДА – ДАА. Оказалось, что уровень L-ДОФА в данной области не менялся по сравнению с контролем, то есть активность ТГ не меняется под действием нейротоксина. В то же время, в остальной части мозга концентрация L-ДОФА снижалась в 2 раза по сравнению с контролем.
При оценке степени деградации нейронов мозга под действием 6-ГДА в основном используют метод иммуномечения по ТГ. Однако известно, что помимо истинно ДА-ергических нейронов, экспрессирующих оба фермента синтеза ДА, существуют также нейроны, содержащие по одному из ферментов. Такие моноферментные нейроны впервые были обнаружены в 80-ые годы прошлого века с помощью двойного иммуногистохимического мечения в различных отделах головного мозга [Meister et al., 1988; Okamura et al., 1988; Ugrumov, 2013]. В нашей лаборатории ранее было показано, что в аркуатном ядре у крыс в перинатальном периоде развития число моноферментных нейронов значительно превышает число биферментных. Так, на Э21 количество моноферментных нейронов в данной области составляет 99%, а биферментных всего 1%. На П9 биферментные нейроны составляют 38% [Ershov et al., 2002]. При этом было показано, что моноферментные нейроны способны осуществлять совместный синтез ДА [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov et al., 2014]. Кроме того, было показано, что при функциональной недостаточности тубероинфундибулярной системы гипоталамуса, вызванной введением в мозг 6-ГДА, у взрослых животных увеличивается число как ТГ-, так и ДАА-содержащих моноферментных нейронов [Ershov et al., 2005]. По-видимому, такая реакция является проявлением компенсаторных процессов. В связи с этим в данной работе на модели дефицита ДА мы оценивали количество нейронов в аркуатном ядре с помощью двойного иммуномечения по ТГ и ДАА. Было показано, что на разработанной модели количество биферментных, моноферментных ТГ-содержащих и моноферментных ДАА-содержащих нейронов не менялось по сравнению с контролем.
Таким образом, на разработанной модели мы получили доказательство того, что специфическое выключение синтеза ДА в мозге с помощью нейротоксина 6-ГДА не меняет морфофункциональное состояние тубероинфундибулярной системы гипоталамуса. Это означает, что если на данной модели будут наблюдаться изменения в синтезе ПРЛ, то они будут обусловлены влиянием ДА исключительно через общую систему циркуляции.
Синтез ПРЛ, как и любого другого белка, включает в себя этапы транскрипции, трансляции и процессинга. Считается, что для характеристики процесса синтеза белковой молекулы необходимой и достаточной является оценка двух показателей: мРНК, как показатель, характеризующий процесс транскрипции, и сам белок, как показатель, характеризующий процесс трансляции.
Было показано, что при снижении уровня ДА в плазме крови на 73% концентрация ПРЛ увеличилась на 50%. Данный показатель характеризует уровень выделения ПРЛ лактотрофами гипофиза. Столь значительное увеличение концентрации ПРЛ в плазме в ответ на снижение концентрации ДА говорит о том, что в данный период онтогенеза (первая неделя постнатального развития) лактотрофы гипофиза уже находятся под стойким ингибиторным контролем ДА, причем скорее всего данное влияние оказывается именно через общую систему циркуляции, а не через портальную. Интересным является тот факт, что при моделировании дефицита ДА концентрация ПРЛ в гипофизе увеличивается на 48%. Это говорит о том, что ДА, поступающий к гипофизу через общую систему циркуляции не просто ингибирует выделение ПРЛ, но и оказывает влияние на его синтез, что также указывает на зрелость механизмов дофаминового ингибиторного контроля в данный период онтогенеза. Для того чтобы подтвердить влияние ДА на синтез ПРЛ на разработанной модели мы также оценивали уровень его мРНК. Было показано, что уровень экспрессии мРНК ПРЛ у животных с дефицитом ДА возрастал в гипофизе в 2,5 раза по сравнению с контрольными.
Учитывая то, что влияние ДА на лактотрофы гипофиза осуществляется через Д2-рецепторы, можно предположить, что изменение уровня ДА в плазме крови могло привести также к изменению уровня экспрессии Д2-рецепторов на лактотрофах. Так, Johnston с коллегами в экспериментах in vitro показали, что ДА оказывает стимулирующее влияние на экспрессию Д2-рецепторов [Johnston et al., 1993]. Однако в данной работе на разработанной модели дефицита ДА в мозге неонатальных крыс экспрессия Д2-рецепторов в гипофизе оставалась на уровне контроля. Это может быть связано с тем, что данный механизм запускается лишь при более длительном дефиците ДА. Так, существуют данные, согласно которым агонисты и антагонисты рецепторов к ДА не влияют на экспрессию Д2-рецепторов в течение пяти суток [Autelitano et al., 1989].