Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Валиуллина Флиза Фаритовна

Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши
<
Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Валиуллина Флиза Фаритовна. Роль гамкб рецепторов в долговременной пластичности в перисоматических синапсах между св1+/сск+ интернейронами и пирамидными нейронами са1 области гиппокампа мыши: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.03.01 / Валиуллина Флиза Фаритовна;[Место защиты: ФГАОУВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»], 2017.- 101 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 13

1.1 Исторический очерк изучения разнообразия клеток головного мозга 13

1.2 Два основных типа перисоматических интернейронов 15

1.3 Асинхронный выброс нейромедиатора ССК+ интернейронами 20

1.4 ГАМКБ рецепторы 23

1.5 Типы клеток, участвующих в гиппокампальных осцилляциях 27

1.6 Механизмы долговременной синаптической пластичности в возбуждающих синапсах гиппокампа 31

1.6.1 Механизмы долговременной синаптической пластичности в ГАМКергических синапсах гиппокампа 33

Экспериментальная часть 38

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38

2.1 Объекты и растворы 38

2.2 Отведение и регистрация сигналов 39

2.3 Статистический анализ данных 43

2.4 Анализ коэффициента вариации 43

ГЛАВА 3. Результаты исследований 45

3.1 Комбинированная тета-гамма стимуляция вызывает долговременную депрессию в синапсах между CB1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши 45

3.2 Функциональная фармакологическая идентификация входов с СВ1+/ССК+ интернейронов на пирамидные нейроны СА1 области гиппокампа 51

3.3 Различные виды пластичности, вызванные комбинированной тета гамма стимуляцией 57

3.4 Роль ГАМКБ рецепторов в долговременной депрессии, вызванной комбинированной тета-гамма стимуляцией в синапсах между CB1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами 61

3.5 Долговременная депрессия в синапсах между CB1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами является результатом снижения внутриклеточной концентрации цАМФ в постсинаптической клетке 65

3.6 Пластичность синапсов между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами CА1 области гиппокампа зависит от параметров стимуляции 68

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 71

4.1 Разработка методики неинвазивной внеклеточной стимуляции входов с СВ1+/ССК+ интернейронов на пирамидные нейроны СА1 области гиппокампа 71

4.2 Тип синаптической пластичности в перисоматических синапсах гиппокампа зависит от природы пресинаптических интернейронов 73

4.3 Роль ГАМКБ рецепторов в индукции долговременной депрессии в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа 74

4.4 Механизм долговременной депрессии в синапсах между СВ1+/ССК+

интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа 75

4.4.1 Роль цАМФ зависимой протеинкиназы в селективной направленности индукции долговременной пластичности 77

Заключение 79

Выводы 80

Список сокращений 81

Список литературы

Введение к работе

Актуальность темы исследования

Долговременные изменения в эффективности синаптической передачи, вызываемые активностью нейронов, лежат в основе многих процессов в центральной нервной системе (Citri et al, 2008). В частности, считается, что долговременная потенциация (ДВП) и долговременная депрессия (ДВД) передачи в возбуждающих синапсах лежат в основе памяти и обучения (Martin et al, 2000; Pastalkova et al, 2006; Whitlock et al, 2006).

В то время как механизмы долговременной пластичности в возбуждающих синапсах достаточно хорошо изучены, значительно меньше известно о механизмах долговременных изменений в ГАМКергической синаптической передаче. ГАМКергические интернейроны модулируют как афферентные входы, так и эфферентную активность и возбудимость пирамидных глутаматерги-ческих нейронов и других интернейронов, и тем самым способны синхронизировать работу больших нейронных ансамблей (Buzsaki, 1997). Поэтому долговременная модуляция эффективности тормозной синаптической передачи имеет важное значение в функционировании нейрональных сетей.

Однако, данные о долговременной пластичности в ГАМКергических синапсах зачастую противоречивы. В отличие от возбуждающих синапсов, которые являются сравнительно гомогенными по свойствам пластичности, схожие паттерны активности могут вызывать различные по выраженности, а иногда и противоположные типы пластичности (ДВД и ДВП) в различных тормозных синапсах в зависимости от типа пресинаптических интернейронов (Gaiarsa et al., 2002). Механизмы, лежащие в основе этого разнообразия, в настоящее время остаются малоизученными. Одним из возможных объяснений является гетерогенность ГАМКергических синапсов. Например, активация цАМФ-зависимой протеинкиназы может иметь разный эффект на тормозные постси-наптические токи, опосредованные ГАМКА рецепторами, в различных типах постсинаптических клеток, а также в различных синапсах на одном и том же нейроне (Poisbeau et al., 1999). В отдельно взятом постсинаптическом нейроне субъединичный состав ГАМКА рецепторов варьирует между различными синапсами, сформированными разными пресинаптическими интернейронами (Sieghart, 1995; Stephenson, 1995; Barnard et al., 1998). Поскольку модуляция активности различных подтипов ГАМКА рецептора одним и тем же сигнальным каскадом может приводить к различным, а иногда и противоположно направленным изменениям в свойствах ГАМКА рецептора в зависимости от его субъединичного состава (Moss et al, 1996), можно предположить, что один и тот же

паттерн синаптической активности, вызывающий активацию одних и тех же постсинаптических сигнальных систем, может приводить к различным долговременным эффектам на ГАМКергическую передачу в разных синапсах.

Одной из важных сигнальных систем, которые могут быть вовлечены в процессы долговременной пластичности в ГАМКергических синапсах является система, активируемая ГАМКБ рецепторами. ГАМКБ рецептор – метаботроп-ный трансмембранный G-белок-связанный подтип ГАМК рецепторов. Известно, что активация ГАМКБ рецепторов вызывает освобождение из компле кса G субъединиц G субъединицы и прямое блокирование G субъединицей потенциал-чувствительных Са2+ каналов (Misgeld et al., 1995; Bettler et al., 2004; Kohl et al., 2010; Padgett et al., 2010). В то же время G субъединица активирует К+ каналы внутреннего выпрямления (Kohl et al., 2010; Lewohl et al., 1999; Reuveny, 2013). Помимо этого, пресинаптические и постсинаптические ГАМКБ рецепторы также активируют Gi/o-тип G белка, который ингибирует работу аденилатциклазы (АЦ) (Bettler et al., 2004; Padgett et al., 2010). Активация пост-синаптических ГАМКБ рецепторов, в свою очередь, приводит к уменьшению синтеза циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) через АЦ и, соответственно, к снижению активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА) (Chalifoux et al., 2010). Ингибирование ПКА сдвигает баланс фосфорилирова-ния мишеней этой киназы, в том числе и ГАМКА рецепторов в сторону дефос-форилированного состояния (Heuschneider et al., 1989; Tehrani et al., 1989; Leidenheimer et al., 1991; Moss et al., 1992; Browning et al., 1993; Poisbeau et al., 1999). Эффект фосфорилирования, опосредованного ПКА, на активность ГАМКА рецепторов зависит от типа субъединицы, входящей в их состав: ГАМКА рецепторы, содержащие 1 субъединицу угнетаются, тогда как каналы, содержащие 3 субъединицу увеличивают свою проводимость в результате фосфорилирования цАМФ-зависимой протеинкиназой (Feigenspan et al., 1994; McDonald et al., 1998; Vithlanietal et al., 2011). Ранее было продемонстрировано вовлечение ГАМКБ рецепторов в долговременную пластичность в тормозных синапсах, сформированных корзинчатыми клетками на телах клеток Пуркинье мозжечка, через ПКА сигнальную систему (Kawaguchi et al., 2002). Также, в гиппокампе активация ГАМКБ рецепторов в ответ на комбинированную тета-гамма стимуляцию приводит к ДВП тормозных постсинаптических токов в локальной тормозной сети между интернейронами stratum lacunosum-moleculare и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа (Patenaude et al., 2003).

Среди разнообразия интернейронов коры головного мозга значительный интерес представляет особый тип интернейронов, которые формируют перисо-матические синапсы на принципиальных нейронах и экспрессируют каннаби-ноидные рецепторы первого типа (СВ1 рецепторы), а также нейропептид холе-цистокинин (ССК). Этот тип СВ1+/ССК+ интернейронов имеет важное значение в эффекторном контроле над принципиальными нейронами посредством тормозных синапсов, стратегически расположенных на теле постсинаптической клетки вблизи места генерации потенциалов действия. В СА1 области гиппо-кампа СВ1+/ССК+ интернейроны играют важную роль в генерации тета-ритма, который связан с исследовательским поведением и парадоксальным сном (Klausberger et al., 2008). Вместе с тем, пластичность ГАМКергических синапсов, формируемых СВ1+/ССК+ интернейронами, остаётся малоизученным явлением.

Синапсы между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами
СА1 области гиппокампа содержат уникальную композицию ГАМКА
рецепторов, которые главным образом содержат 2/3 субъединицы (Nyiri et al.,
2001; Ramadan et al., 2003; Kasugai et al., 2010) в отличие от подавляющего
большинства других гиппокампальных ГАМКергических синапсов, где ГАМКА
рецепторы имеют в своем составе 1/2(1) субъединицы. Учитывая особые
свойства ГАМКА рецепторов, в состав которых входит 3 субъединица,
возникает гипотеза, что опосредованная ПКА долговременная модуляция этих
связей может иметь специфический характер. В частности, можно
предположить, что подавление фосфорилирования, опосредованного ПКА, в
большинстве синапсов будет приводить к потенциации, тогда как в
перисоматических синапсах, образованных СВ1+/ССК+ интернейронами,
напротив к долговременному подавлению постсинаптических

ГАМКергических токов.

Цель исследования – изучение механизмов долговременной пластичности в перисоматических синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши in vitro.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать пластичность и определить ее зависимость от частотных паттернов активности в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши.

2. Исследовать роль эндоканнабиноидной системы в индукции долговременной пластичности в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши.

3. Изучить вклад ГАМКБ рецепторов в индукцию и поддержание долговременной пластичности в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши.

  1. Определить пре- и постсинаптические механизмы, лежащие в основе долговременной пластичности в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши.

  2. Сравнить синаптическую пластичность, вызываемую тета-гамма паттернами стимуляции в синапсах между СВ1+ и СВ1- интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши.

Научная новизна работы

Впервые было показано, что длительная комбинированная тета-гамма стимуляция синапсов, образованных СВ1+/ССК+ интернейронами на телах пирамидных нейронов СА1 области гиппокампа мыши, приводит к долговременному подавлению ГАМКергической синаптической передачи. Было продемонстрировано, что эндоканнабиноидная сигнальная система не участвует в долговременной депрессии (ДВД), а вовлекается другой каскад, ассоциированный с активацией рецепторов, связанных с G-белками. Блокада ГАМКБ рецепторов предотвращает индукцию ДВД, и более того, на фоне присутствия антагониста ГАМКБ рецепторов комбинированная тета-гамма стимуляция вызывает значительное долговременное усиление вызванных ГАМКергических постсинаптических ответов. Также впервые было показано, что активация ГАМКБ рецепторов требуется исключительно для индукции ДВД, но не для поддержания этого типа пластичности. Несмотря на то, что ГАМКБ рецепторы экспрессируются как на пресинаптических нервных окончаниях, так и на мембране постсинаптических нейронов, было показано, что активация именно постсинаптических ГАМКБ рецепторов приводит к ДВД. Используя внутриклеточный диализ для селективного изменения внутриклеточного состава постсинаптического нейрона, было доказано, что искусственное увеличение концентрации цАМФ подавляет индукцию ДВД. Более того, было показано, что тот же самый протокол активности в фармакологически изолированных СВ1-негативных синапсах гиппокампа мыши при прочих равных условиях эксперимента приводит к значительной долговременной потенциации постсинаптических ГАМКергических ответов. Наконец, было впервые исследовано влияние различных паттернов активности

на синаптическую передачу и показано, что не столько общее количество стимулов и частота стимуляции, сколько близость паттерна стимуляции к физиологичному тета-гамма паттерну активности является определяющим фактором в возникновении долговременных изменений в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами.

Теоретическая и практическая значимость работы

Основное значение результатов проведенных исследований состоит в получении новых данных о физиологических процессах, лежащих в основе долговременных изменений синаптической эффективности, а именно долговременной депрессии синаптической передачи в перисоматических синапсах, образуемых СВ1+/ССК+ интернейронами на телах пирамидных нейронов в СА1 области гиппокампа мыши. Использованный в работе протокол стимуляции в комбинированной тета-гамма частоте фактически отражает природную активность этих типов интернейронов во время гиппокампального тета-ритма (Klausberger et al., 2008).

На поверхности мембраны ССК+ интернейронов экспрессируются 6 различных типов рецепторов (5-НТ3; 7, 4 никотиновые рецепторы; СВ1 рецепторы; ГАМКА рецепторы, обогащенные 2 субъединицей; рецепторы эстрогена), которые вовлечены в расстройства настроения (в особенности тревогу) (Freund et al., 2003), поэтому полученные данные имеют важное значение для понимания функционирования и диагностики нарушений центральной нервной системы. Особый интерес вызывают СВ1 рецепторы на мембране ССК+ интернейронов, так как они опосредуют психоактивный эффект биологически активного вещества марихуаны (дельта-9-тетрагидроканнабинола) (Freund et al., 2003).

Таким образом, проведенные исследования имеют теоретическое и практическое значение, так как полученные экспериментальные данные позволяют ближе подойти к пониманию физиологической роли биологических детерминант, опосредующих перисоматическое ингибирование в гиппокампе. Детальное описание механизмов, лежащих в основе долговременных изменений тормозной синаптической передачи, имеет ценность не только для фундаментальной науки, но может быть полезно для более глубокого понимания патофизиологических состояний гиппокампальной нейрональной сети, так как дисфункция ГАМКергической синаптической передачи часто лежит в основе различных расстройств нервной системы. Например, гипоактивность ГАМКергической системы приводит к эпилепсии, стрессу,

расстройствам сна, депрессии, боли. А шизофрения, напротив, ассоциирована с гиперактивностью системы (Benes et al., 2001).

Методология и методы исследования

Исследовалась природа долговременной пластичности ГАМКергической синаптической передачи в перисоматических синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши in vitro во время третьей недели после рождения (Р14-21). Для регистрации внутриклеточной электрической активности отдельных нейронов использовались стеклянные пипетки (парная пэтч-кламп методика в конфигурации «целая клетка» (whole-cell)); для стимуляции входов с СВ1+/ССК+ интернейронов применялись два метода, а именно: парная регистрация методом пэтч-клампа синаптически связанных нейронов и внеклеточная локальная стимуляция с использованием стеклянных микроэлектродов, вытянутых из тета трубок.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Комбинированная тета-гамма стимуляция вызывает долговременную депрессию ГАМКергической передачи в перисоматических синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа мыши.

  2. Индукция долговременной депрессии в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами опосредуется активацией постсинаптических ГАМКБ рецепторов, а поддержание этого типа пластичности опосредуется цАМФ-зависимыми постсинаптическими механизмами.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных данных основана на большом объеме результатов экспериментальных исследований с использованием адекватных методических подходов и статистической обработки полученных результатов.

Материалы работы представлены на Всероссийской с международным участием школе-конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Яльчик, 2012); Международной научной конференции «Наука будущего» (Санкт-Петербург, 2014); IX Международном форуме нейробиологов FENS (Милан, Италия, 2014); VI Российской с международным участием научной конференции по управлению движением «Motor control 2016» (Казань, 2016); Международной научной конференции «Трансляционная медицина, настоящее и будущее» (Казань, 2016), X Международном форуме нейробиологов FENS (Копенгаген, Дания, 2016), II Международной научной

конференции «Наука будущего» (Казань, 2016), V съезде физиологов СНГ (Сочи, 2016).

Работа выполнена при поддержке гранта Правительства РФ ведущим ученым №11.G34.31.0075, а также программы конкурентного развития Казанского федерального университета.

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе - 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в систему цитирования Web of Science и рекомендованных ВАК.

Личный вклад диссертанта в исследования

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных, их анализ и интерпретацию, оформление публикаций.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 101 странице; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы; иллюстрирована 19 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 196 источников, из них 196 - иностранных авторов.

Асинхронный выброс нейромедиатора ССК+ интернейронами

Исследования разнообразия нервных клеток начались в конце XIX века. Эти исследования были тесно связаны с идеями Ramоn y Cajal, одного из основоположников современной нейробиологии. По мере развития новых методов окрашивания и изучения деталей нервной системы, Ramоn y Cajal получил новые данные, касающиеся структуры и функций нервной системы. Благодаря его работам (Cajal, 1911), сформировалось понятие о том, что нейроны, составляющие любую область коры головного мозга, далеко не однородны в отношении их морфологии, связей и способны взаимодействовать друг с другом в сложной и разнообразной форме.

На протяжении полувека, опираясь на описания Ramоn y Cajal, нейроанатомы называли два основных типа клеток, «пирамидные» и «непирамидные» нейроны. Более детальная характеристика «непирамидных» клеток была описана в работах Lorente de Nо (1934), в частности для гиппокампа, и только 1966 году, Colonnier обращает внимание на большое разнообразие интернейронов с различной морфологией дендритов и аксонов. В 1968 году им же был сделан следующий важный шаг в познании того, что тела пирамидных клеток, где корзинчатые интернейроны устанавливают свои контакты, покрыты исключительно тормозными синапсами. Огромное количество исследований в этой области свидетельствуют о том, что электрофизиология взаимодействий двух связанных нейронов и функционально различных популяций нейронов, в сочетании с четкими данными о структуре синапсов, в конечном счете, является единственно реалистичным экспериментальным подходом в изучении комплексных вопросов функций интернейронов (Buzsaki et al., 1992; Gulyis et al., 1993a,b; Buhl et al., 1994; Sik et al., 1995; Ylinen et al., 1995a,b; Miles et al., 1996). ГАМКергические интернейроны во многом отличаются от принципиальных клеток: организацией дендритов; контактами, которые устанавливают их аксоны; внутренними биофизическими свойствами; характером генерации потенциалов действий; и их ролью в сетевой активности и поведенческими коррелятами (Freund et al., 1996; Somogyi et al., 1998; McBain et al., 2001; Somogyi et al., 2005; Buzski et al., 2004; Markram et al., 2004). В настоящее время, в гиппокампе, по крайней мере, определены 16 различных типов интернейронов (Somogyi et al., 2005), и этот список пополняется новыми типами (Jinno et al., 2007).

ГАМКергические интернейроны составляют 15-20% от всех нейронов коры головного мозга (Hendry et al., 1987; DeFelipe, 1993; Somogyi et al., 1998; Markram et al., 2004). Их синапсы охватывают почти всю поверхность мембраны пирамидных нейронов, от кончиков тончайших отростков дендритов и до начального сегмента аксона. Интернейроны, которые иннервируют дендриты пирамидной клетки, ответственны за контроль эффективности и пластичности глутаматергических входов от специфических источников. Тормозные нейроны, которые образуют свои синапсы в области тела пирамидной клетки, отвечают за синхронность генерации потенциалов действия больших популяций принципиальных клеток. Примерно треть интернейронов иннервируют тело либо начальный сегмент пирамидных нейронов (Freund et al., 1996). Например, клетки канделябры или аксо-аксональные клетки специализированы селективно иннервировать начальный сегмент аксона принципиальных клеток, формируя так называемые «картриджи» - аксональные терминали, которые напоминают свечи и придают аксональному дереву вид канделябр (Somogyi, 1977). Клетки-канделябры содержат кальций-связывающий белок парвальбумин (Kosaka, et al., 1987). Одна клетка-канделябр может иннервировать более 200 пирамидных клеток (Somogyi et al., 1982), что позволяет данному типу клеток участвовать в синхронизации разрядов локальных сетей пирамидных клеток (Кlausberger et al., 2003). 1.2 Два основных типа перисоматических интернейронов

Два основных типа перисоматических интернейронов коры больших полушарий - парвальбумин- (PV) и холецистокинин- (CCK) экспрессирующие интернейроны – яркий пример того, как ГАМКергические интернейроны эволюционировали так, что они могут синергично выполнять конкретные задачи в генерации паттернов электрической активности и как нарушение в их работе может приводить к комплексу неврологических и психических расстройств. Функциональная дихотомия этих двух типов корзинчатых клеток связана с характерными для них типов связей, содержанием нейромедиаторов и характерных маркерных пептидов, а также с экспрессией рецепторов на поверхности их мембраны (Freund et al., 2003). Несколько направлений исследований подтверждают гипотезу о том, что PV+ интернейроны работают как часовой механизм для генерации сетевых осцилляций, в то время как ССК+ интернейроны функционируют как устройство тонкой настройки. Следовательно, коллапс сети PV+ интернейронов ожидаемо приведет к серьезному ухудшению всех функций коры головного мозга, в то время как сбои в устройстве тонкой настройки могут привести к расстройствам настроения, особенно механизмов возникновения тревоги. В частности, это объясняется тем, что ССК+ интернейроны экспрессируют на поверхности своей мембраны серотониновые 5-HT3 рецепторы, никотиновые 7 и 4 рецепторы, а также каннабиноидные рецепторы первого типа (СВ1 рецепторы) (Freund et al., 2003).

В гиппокампе, оба типа клеток имеют дендритные деревья, которые пронизывают все слои; поэтому, электрическая стимуляция в любом слое вызывает возбуждающий постсинаптический ток в обоих типах корзинчатых клеток (Glickfeld et al., 2006). Однако, в соответствии с реконструкцией электронной микроскопии, оказалось, что PV+ интернейроны получают в три раза больше асимметричных синапсов от глутаматергических пирамидных нейронов гиппокампа (Gulys et al., 1999; Mtys et al., 2004). Кроме того, пик амплитуды возбуждающих постсинаптических токов в PV+ интернейронах в 7,5 раза больше, чем в ССК+ интернейронах. Примечательно, что PV+ интернейроны имеют маленький компонент НМДА опосредованных ответов (Geiger et all., 1997), в соответствии с низким уровнем экспрессии НМДА рецепторов (Nyiri et al., 2003). Дальнейшее различие между двумя типами перисоматических интернейронов имеет место в свойствах кратковременной синаптической пластичности их глутаматергических входов. Возбуждающий постсинаптический потенциал в ССК+ интернейронах характеризуются сильной кратковременной депрессией (Glickfeld et al., 2006), что может объяснить их меньшую вовлеченность в сетевой ответ во время повторяющейся стимуляции. PV+ интернейроны, благодаря своим коротким мембранным константам и менее выраженной кратковременной депрессии, способны точно следовать за высокочастотной повторяющейся стимуляцией. С другой стороны, более длительные мембранные константы ССК+ интернейронов позволяют им интегрировать возбуждающие входы в течение более продолжительных временных окон (Glickfeld et al., 2006). ССК+ интернейроны действительно нуждаются в таких свойствах, потому что они являются главными мишенями подкорковых афферентных волокон (Ferezou et al., 2002; Freedman et al., 1993; Freund et al., 1990; Morales et al., 1997; Porter et al., 1999), которые характеризуются более медленной скоростью проведения потенциала действия (ПД), и поэтому активируют клетки-мишени менее синхронно (Jacobs et al., 1992). Оба типа перисоматических интернейронов получают прямые (feed-forward) и обратные (feed-back) возбуждающие входы. Тем не менее, CCK+ интернейроны уникально подходят для интеграции прямого и возвратного возбуждения от принципиальных клеток гиппокампа.

Статистический анализ данных

Пэтч пипетки изготавливались из боросиликатных стеклянных капилляров BF150-86-10 (Sutter instrument, США). Для улучшения контроля мембранного потенциала, К+ каналы постсинаптических клеток блокировались внутриклеточной заменой ионов К+ на ионы Cs+. Поэтому электроды для постсинаптических пирамидных клеток заполнялись раствором следующего содержания (в мМ): Сs-глюконат 100, Сs-Cl 40, HEPES 10, NaCl 8, MgATP 4, NaGTP 0.3, фосфокреатин 10 (pH 7.4). Раствор для пресинаптических интернейронов содержал в своем составе (в мМ): K-глюконат 100, KCl 40, HEPES 10, NaCl 8, MgATP 4, NaGTP 0.3, фосфокреатин 10 (pH 7.4).

Пресинаптические клетки (СВ1+/ССК+ интернейроны) идентифицировались по локализации в гиппокампе, мультиполярной морфологии тела и характеру ответов на длительную гиперполяризацию/деполяризацию. СВ1+/ССК+ интернейроны были локализованы в sratum radiatum, близко к границе stratum pyramidale СА1 области гиппокампа (от 20 до 100 мкМ). Типичный паттерн генерации потенциалов действия (ПД) во время длительной деполяризации показан на рисунке 6А. После этого, с помощью второй пипетки, в stratum pyramidale находился пирамидный нейрон, который был синаптически связан с интернейроном. Ещё одним критерием правильного отбора СВ1+/ССК+ интернейрона был ярко выраженный асинхронный выброс тормозного нейромедиатора ГАМК в ответ на высокочастотную стимуляцию (10 ПД, 50 Гц) (Рисунок 6Б).

Два разных подхода использовались для изучения долговременной пластичности синапсов, образуемых СВ1+/ССК+ интернейронами: 1) парная пэтч-кламп регистрация электрической активности постсинаптического нейрона в ответ на стимуляцию СВ1+/ССК+ интернейрона через пэтч-пипетку (Рисунок 7 А1, А2); 2) пэтч-кламп регистрация электрической активности постсинаптического нейрона в ответ на внеклеточную электрическую стимуляцию СВ1+/ССК+ нервных окончаний (Рисунок 7 Б1, Б2).

Парная пэтч-кламп регистрация в режиме «целая клетка» (whole-cell) проводилась либо с помощью 2-канального усилителя HEKA EPС 7, либо EPС 10 (HEKA Elektronik Dr. Schulze, GmbH, Ламбрехт/Пфальц, Германия) с частотой дискретизации 100 мкс и фильтрации 3кГц.

Внеклеточная электрическая стимуляция производилась биполярным электродом, изготовленным в виде стеклянной тета-пипетки в присутствии антагонистов ионотропных глутаматных рецепторов (10 мкМ СNQX, 40 мкM D-APV). Сила стимула подбиралась таким образом, чтобы уменьшить вероятность вовлечения в суммарный ответ других входов на пирамидные нейроны СА1 области гиппокампа.

Для индукции долговременных изменений синаптической передачи производилась стимуляция 4 пачками по 5 импульсов чаcтотой 50 Гц, разделенных 200 мс интервалами. Данный паттерн стимуляции имитировал тета-гамма диапазон активности нейронов гиппокампа. Рисунок 6 – Характерные особенности СВ1+/ССК+ интернейронов А) Ответы СВ1+/ССК+ интернейрона на длительную гиперполяризацию/деполяризацию; Б) Выраженный асинхронный выброс нейромедиатора (красным), зарегистрированный от пирамидного нейрона в ответ на стимуляцию СВ1+/ССК+ интернейрона 10 деполяризующими импульсами частотой 50 Гц. Сверху 10 потенциалов действия, зарегистрированные от СВ1+/ССК+ интернейрона (чёрным). 42 Рисунок 7 - Схематичные изображения экспериментальных подходов А1) Парная пэтч-кламп регистрация синаптически связанных СВ1+/ССК+ интернейрона (желтым) и пирамидной клетки (зелёным) СА1 области гиппокампа; А2) Асинхронный выброс нейромедиатора (красным), зарегистрированный от постсинаптической клетки в ответ на стимуляцию СВ1+/ССК+ интернейрона 10 деполяризующими импульсами частотой 50 Гц. Сверху 10 потенциалов действия, зарегистрированных от СВ1+/ССК+ интернейрона (чёрным); Б1) Внеклеточная стимуляция нервных окончаний СВ1+/ССК+ интернейрона (жёлтым), образующих синаптические контакты на теле пирамидной клетки (зелёным); Б2) Асинхронный выброс нейромедиатора (красным), зарегистрированный от постсинаптической пирамидной клетки в ответ на электрическую стимуляцию СВ1+/ССК+ нервных окончаний 10 импульсами (чёрным) частотой 50 Гц. 2.3 Статистический анализ данных

Групповые данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическая оценка существования различий в сравниваемых выборках оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента.

Анализ коэффициента вариации - классический метод для "квантового" анализа синаптических ответов, который позволяет однозначно идентифицировать пре- и постсинаптический локус, лежащий в основе синаптической пластичности, только тогда, когда обширные упрощающие ограничения уже сделаны. Для расчета используется следующая формула: CV = а/М, где CV - коэффициент вариации, о - стандартное отклонение, М -средний синаптический ответ. Вследствие этого, CV не зависит от размера кванта (Martin, 1966; McLachlan, 1978). Затем, когда синаптическая эффективность меняется, в зависимости от того пре- или постсинаптическая сторона контакта участвует в процессе, два крайних случая могут быть выполнены. В первом случае, (CV) увеличивается или снижается пропорционально изменениям М. Во втором случае, (CV) не изменяется. Эти условия проиллюстрированы (Рисунок 8) как отношение двух параметров: г = СУ2д0/СУ2после л= Мпосле /Мдо, где г - отношение квадратов коэффициента вариации до и после воздействия, ж - фактор модификации. В частности, когда механизм потенциации или депрессии постсинаптический, значение CV J CV после равно 1. В случае пресинаптической природы изменений значение CV\ / CV после как функции располагается в зонах II, а в случае смешанного механизма в зонах III (Рисунок 8).

Роль ГАМКБ рецепторов в долговременной депрессии, вызванной комбинированной тета-гамма стимуляцией в синапсах между CB1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами

Отношение парных импульсов (ТПСТ2/ТПСТ1), измеренное до и после применения КТГ стимуляции, существенно не изменялось (0.78±0.12 до, 0.71±0.09 после стимуляции, р 0.05, n=10, Рисунок 14А). Усредненное значение CV2контроль/CV2КТГС было близко к единице (1.06±0.23, n=10, Рисунок 14Б).

Полученные результаты противоречат более ранним сообщениям, которые показывают, что КТГ стимуляция вызывает потенциацию синаптической передачи в ГАМКергических синапсах гиппокампа (Perez et al., 1999; Patenaude et al., 2003; Evstratova et al., 2011).

Для того чтобы решить кажущееся противоречие, изучался эффект КТГ стимуляции на синаптическую передачу в СВ1-негативных тормозных синапсах. Синаптическая передача в СВ1+ нервных окончаниях блокировалась активацией СВ1 рецепторов с помощью СР55940. После аппликации СР55940 выброс медиатора из СВ1+ терминалей был полностью заблокирован, что подтверждалось полным отсутствием асинхронного выброса нейромедиатора вне зависимости от месторасположения стимулирующей пипетки. В остальном, условия индукции были идентичны тем, что использовались в предыдущих опытах. Однако, в присутствии СР55940 КТГ стимуляция вызывала существенную долговременную потенциацию (147±11% по сравнению с контролем, n=5, p 0.01, Рисунок 15А). Более того, анализ коэффициента вариации показал, что в СВ1-негативных синапсах ДВП имеет пресинаптическую природу. Усредненное значение CV2контроль/CV2КТГС было 1.75±0.23, (n=5, Рисунок 15Б). Таким образом, долговременная депрессия вызванная КТГ стимуляцией на СВ1+ синапсах является специфическим свойством данного типа связи.

Внеклеточная комбинированная тета-гамма (КТГ) стимуляция вызывает долговременную депрессию (ДВД) тормозных постсинаптических токов в синапсах с выраженным асинхронным выбросом нейромедиатора А) Динамика изменения амплитуды тормозных постсинаптических токов (ТПСТ) в контроле и после применения внеклеточной КТГ стимуляции в присутствии антагонистов ионотропных глутаматных рецепторов (10 мкМ СNQX, 40 мкM D-APV) и антагониста СВ1 рецепторов АМ-251 (2 мкМ). Выше, типичный постсинаптический ответ (красным) на применение КТГ стимуляции (чёрным). Под графиком усреднённые записи ТПСТ до (черным) и после (красным) индукции ДВД; Б) На графике представлены результаты анализа коэффициента вариации. Черные точки соответствуют одиночным экспериментам; красная точка усреднённым данным. Рисунок 15 - Внеклеточная комбинированная тета-гамма (КТГ) стимуляция индуцирует долговременную потенциацию (ДВП) тормозных постсинаптических токов (ТПСТ) в синапсах между СВ1 негативными интернейронами и пирамидными нейронами в СА1 области гиппокампа А) Динамика изменения амплитуды ТПСТ в контроле и после применения внеклеточной КТГ стимуляции в присутствии антагонистов ионотропных глутаматных рецепторов (10 мкМ СNQX, 40 мкM D-APV). СВ1+ ответы были заблокированы аппликацией СР55940. Вставка над диаграммой демонстрирует типичный постсинаптический ответ, регистрируемый в присутствии агониста СВ1 рецепторов, который отличается отсутствием асинхронного выброса нейромедиатора в ответ на высокочастотную стимуляцию. Под графиком усреднённые записи ТПСТ до (черным) и после (красным) индукции ДВП; Б) На графике представлены результаты анализа коэффициента вариации. Черные точки соответствуют одиночным экспериментам; красная точка усреднённым данным. 3.4 Роль ГАМКБ рецепторов в долговременной депрессии, вызванной комбинированной тета-гамма стимуляцией в синапсах между CB1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами Вовлеченность различных типов рецепторов, связанных G-белком, в долговременные изменения синаптической пластичности была показана для многих типов ГАМКергических связей. Как описано в главе 4.3, блокада СВ1 рецепторов не влияла на долговременную депрессию (ДВД) в синапсах между СВ1+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа. Однако оба этих класса нейронов, СВ1+/ССК+ интернейроны и пирамидные нейроны, экспрессируют ГАМКБ рецепторы. По литературным данным известно, что ГАМКБ рецепторы могут быть локализованы как на пре-, так и на постсинапсе (Kaupmann et al., 1997; Kaupmann et al., 1998; Jones et al., 1998; White et al., 1998; Kuner et al., 1999).

Поэтому следующая серия экспериментов была посвящена исследованию роли активация ГАМКБ рецепторов в индукции ДВД. Для этого активность этих рецепторов была заблокирована внеклеточной аппликацией антагониста ГАМКБ рецепторов (CGP55845, 3 мкМ). Присутствие CGP55845 в перфузируемом растворе не повлияло на свойства синапской передачи между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами. Однако, комбинированная тета-гамма (КТГ) стимуляция на фоне хронической аппликации CGP55845 блокировала возникновение ДВД, более того приводила к долговременному увеличению амплитуды тормозных постсинаптических токов (ТПСТ) (128±8% относительно контрольного значения, n=5; р 0.01; Рисунок 16). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что активация ГАМКБ рецепторов вовлечена в индукцию ДВД в этих синапсах.

Тип синаптической пластичности в перисоматических синапсах гиппокампа зависит от природы пресинаптических интернейронов

Многочисленные исследования демонстрируют участие G-белок связанных рецепторов в возникновении и поддержании двух форм синаптической пластичности, долговременной потенциации (ДВП) и долговременной депрессии (ДВД) (Kawaguchi et al., 2002; Younts et al., 2013). Изучаемый тип синапса характеризуется экспрессией пресинаптических СВ1 и ГАМКБ рецепторов. Кроме того было показано, что постсинаптические клетки-мишени СВ1+/ССК+ интернейронов (принципиальные СА1 нейроны) экспрессируют ГАМКБ рецепторы и способны к ретроградному выделению эндоканнабиноидов (Davies et al., 1993). Поэтому с целью исследования вовлеченности ГАМКБ и каннабиноидных сигнальных каскадов в долговременную депрессию в ответ на КТГ стимуляцию, фармакологически селективно блокировались эти два каскада. Блокада эндоканнабиноидных рецепторов первого типа (СВ1) не отменяло индукцию ДВД, что позволяет сделать заключение, что эндоканнабиноиды и эндоканнабиноидные рецепторы не участвуют в этом типе пластичности. Блокада ГАМКБ рецепторов до индукции ДВД комбинированная тета-гамма (КТГ) стимуляцией приводила к полной отмене депрессии, и более того приводила к значительному увеличению амплитуды постсинаптических ГАМКергических ответов. Это наблюдение позволяет заключить, что метаботропные ГАМКБ рецепторы вовлечены в процесс возникновения долговременной депрессии в данном типе синапсов. Следующим вопросом было, является ли устойчивая активация ГАМКБ рецепторов необходимым условием для поддержания ДВД или относительно кратковременная активация достаточна для перестройки синаптической передачи. В случае справедливости первого утверждения, блокада ГАМКБ рецепторов после индукции ДВД должна приводить к восстановлению амплитуд постсинаптических токов. Тем не менее, в наших экспериментах аппликация селективного блокатора ГАМКБ рецепторов CGP55940 на 15 минуте после использования КТГ стимуляции не увеличивала амплитуду вызванных синаптических токов. Это позволяет нам заключить, что активация ГАМКБ рецепторов необходима для индукции, но не для поддержания ДВД.

Так как ГАМКБ рецепторы экспрессируются как в пресинатических нервных окончаниях (СВ1+/ССК+ интернейронов) и на мембране постсинаптических пирамидных нейронов СА1 области гиппокампа (Kaupmann et al., 1997; Kaupmann et al., 1998; Jones et al., 1998; White et al., 1998; Kuner et al., 1999), следующей задачей исследования являлось определение локализации ГАМКБ рецепторов, вовлеченных в индукцию ДВД в данном типе синапсов. В случае пресинаптического падения выброса нейромедиатора, ожидаемо изменение соотношения амплитуд ответов, вызванных парными потенциалами действия. В нашем случае, соотношение парных ответов (ТПСТ2/ТПСТ1) не изменялась после КТГ стимуляции, что указывает на постсинаптический механизм возникновения ДВД. Более того, сравнительный анализ коэффициента вариации синаптических ответов до и после КТГ стимуляции подтвердил заключение о постсинаптической природе ГАМКБ зависимой долговременной депрессии в этом типе синапсов. Таким образом, длительная активация ГАМКБ рецепторов в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа запускает метаболитические процессы, приводящие к угнетению амплитуд постсинаптических ответов.

Исследование сигнального пути, лежащего в основе индукции долговременной депрессии в синапсах между СВ1+/ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами СА1 области гиппокампа, раскрывает механизм, связанный с активацией постсинаптических ГАМКБ рецепторов.

Постсинаптические ГАМКБ рецепторы могут активировать К+ каналы внутреннего выпрямления (Kohl et al., 2010; Lewohl et al., 1999; Reuveny, 2013), вызывая так называемый «медленный» тормозной ответ, либо подавлять активность аденилатциклазы (АЦ) (Bettleret al., 2004; Padgett et al., 2010). В наших экспериментах участие ионов К+ в индукции долговременной депрессии (ДВД) исключалось перфузией клеток пипеточным раствором, содержащим ионы Cs+, которые как известно эффективно блокируют калиевые каналы. Таким образом, наиболее вероятным путем, вовлеченным в долговременные изменения синаптической передачи, следует признать подавление аденилатциклазной активности в ответ на активацию ГАМКБ рецепторов. Продуктом аденилатциклазной активности является синтез циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), важного вторичного посредника во многих внутриклеточных метаболитических реакциях. В частности, цАМФ активирует цАМФ-зависимую протенкиназу (ПКА) – фермент, отвечающий за фосфорилирование ГАМКА рецепторов. Поэтому с целью оценки вовлеченности длинной метаболитической цепи, связывающей активацию ГАМКБ рецепторов через подавление АЦ с функциональностью ПКА, мы использовали внутриклеточную намывку негидролизируемого аналога цАМФ (8Br-cAMP), гарантирующую постоянную активность этого типа киназы. Присутствие 8Br-cAMP в пипеточном растворе полностью блокировало индукцию ДВД в ответ на КТГ стимуляцию, подтверждая участие аденилатциклазного каскада, и, по всей видимости ПКА в постсинаптических изменениях, приводящих к падению амплитуд вызванных тормозных ответов.