Введение к работе
Актуальность, цель и задачи исследований. Интенсификация ведения животноводства и перевод его на промышленную основу выдвигают все большие требования к повышению продуктивных качеств и обеспечению высокой воспроизводительной способности животных одновременно с организацией четкой ритмичности в получении приплода. В этой связи перед биологической наукой особенно остро встает задача разработки методов активного регулирования функцнн воспроизведения у сельскохозяйственных животных.
Разработанный И. И. Ивановым и развитый далее отечественными « зарубежными исследователями метод искусственного осеменения сельскохозяйственных животных позволяет уже сравнительно легко регулировать участие производителя в процессе воспроизводства (В. К- Милованов, В. А, Морозов, И. И. Родин, А. В. Бесхлебнов, И. В. Смирнов, Ф. И. Осташко, П. И. Пакенас, С. Polge, N. Van Demark и др.). Определенные успехи достигнуты в понимании закономерностей нейроэндокринной регуляции и управлення репродуктивной функцией у самок сельскохозяйственных животных {АЛ. М. Завадовский, А. И. Лопырин, Н. В. Логинова, А. В. Квасницкий, А. П. Студенцов, И. И. Соколовская, Г. В. Паршутин, Г, В. Зверева, А, Л, Падучева, В. С. Ши-пилов, П. И. Шаталов, Н. И, Полянцев, Ю. Д. Клиискнй, Д. Д. Логвинов, С. И. Сердюк, Г,А". Кононов, Г. С. Степанов, L. Casida, A. Nalbandqv, W. Hansel и др.). В последние годы предложены многочисленные гормональные препараты и способы их применения для стимуляции функции яичников и синхронизации охоты, то есть контроля ее проявления в точно регламентированные сроки. Однако для многих из них не дано глубокого физиологического обоснования и три широкой производственной проверке own оказались недостаточно эффективными. Это выдвигает на первый план необходимость дальнейшего накопления фундаментальных знаний о зако-
Цгл;. клея С;;5л"0ТЕї:а
Ь'Г:С*. {-/д. ;-;;:;:;э СЭЯЫЗ.
а;;ад. щ, ц, д, Тішшззі
номерностях ненроэндокрннной регуляции функции воспроизведения.
Сведения о динамике уровня гонадотропних гормонов в крови животных в течение полового цикла до настоящего времени остаются недостаточными, чтобы составить полное представление о роли гипоталамо-гипофизарного комплекса в регуляции функции яичников в разные фазы цикла. Поэтому изучение закономерностей гонадотропной секреции в течение полового цикла у разных видов сельскохозяйственных животных является одной из актуальных задач эндокринологи» репродуктивной функции.
Секреция гонадотропних гормонов гипофиза контролируется по принципу обратной связи половыми стероидами, продуцируемыми яичниками самки. Это положение, выдвинутое впервые М. М. Завадовским, является по существу научной базой для разрабатываемых ныне способов синхронизации охоты у сельскохозяйственных животных. Отсюда совершенствование приемов регулирования функции воспроизведения у животных должно базироваться на дальнейшем развитии и углублении наших представлений о механизмах взаимодействия гормонов в организме животного. Огромные успехи современной химии создали широкие возможности в использовании фармакологических средств для торможения и стимуляции гппоталамо-гнпофизариого комплекса у животных. Одной из важных задач биологической наук» является создание в содружестве с химиками эффективных гормональных препаратов, веществ, оказывающих влияние на медпаторные процессы в центральной нервной системе, и разработка теоретических основ их применения в животноводстве.
В целях разработки более эффективных способов регулирования воспроизводительной функции у самок сельскохозяйственных животных большой интерес представляют половые стероиды пролонгированного действия. В опытах на лабораторных животных выявлены соединения этого типа с пролонгацией действия близкой к продолжительности полового цикла (К. Junkman, 1954; М. И. Прокофьев и др., 1975), что позволяет ограничиться однократным их введением для обеспечения необходимой продолжительности торможения охоты и овулящш. Изучение физиологических аспектов действия этих соединений открывает возможности разработки новых малотрудоемких методов синхронизации охоты у сельскохозяйственных животных.
В связи с интенсификацией ведения животноводства особую значимость приобретает проблема эффективного использования воспроизводительной способности самок с высоким
генетическим потенциалом путем многократного получения от них эмбрионов на ранних стадиях развития it пересадки их менее ценным в генетическом отношении самкам. Эта проблема привлекла в последнее время большое внимание исследователей и животноводов-практиков (L. Rowson et а]., 1969, Л. К. Эрнст и др., 1977; М. И. Прокофьев и др., 1977; 1978). К настоящему времени решены основные этапы технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Однако, судя по числ^беременных реципиентов на одного донора, эффективность метода сравнительно низкая (Е. Graham, 1974), В этой связи особую актуальность представляет изыскание путей повышения выхода полноценных эмбрионов и совершенствование техники их пехирургической трансплантации.
Задачами настоящей работы было решение следующих вопросов.
Совершенствование методов получения и определения пшофшарных гонадотроппнов в биологических жидкостях (кровь, моча) и изучение на этой основе особенностей гонадотропної! регуляции полового цикла у самок разных видов сельскохозяйственных животных.
Изучение роли плацентарных гонадотроппнов и половых стероидов в регуляции гипофизарно-яичииковых взаимоотношений у самок сельскохозяйственных животных в условиях проявления нормальной репродуктивной функции.
Изучение взаимоотношений между структурой и функцией производных прогестерона и разработка теоретических основ применения прогестагенов пролонгированного действия, для регуляции функции воспроизведения у самок сельскохозяйственных животных.
Разработка новых способов синхронизации охоты у самок основных видов сельскохозяйственных животных с использованием стероидных производных пролонгированного действия.
Изучение эндокринных механизмов вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота с целью разработки способа повышения выхода полноценных зародышей и ускоренного размножения потомства от высокоценных особей методом трансплантации эмбрионов.
Материалы и методика исследований. Экспериментальные исследования проводили в период 196^—1978 гг. на коровах и половозрелых телках в 29 сериях лабораторных и 13 научно-производственных опытов в ОПХ «Красный Водопад» научно-исследовательского института животноводства МСХ
УзССР, в плем совхозе-техникуме «Чнназ» и колхозе «Политотдел* Ташкентской области, в .„ племсовхозе «Малек» Сырдарьинской области, в совхозе 50-летия образования СССР Бухарской облает», в совхозе им. Ильича КК АССР, а также в хозяйствах Калужской и Московской областей; на овцах каракульской породы в случной сезон в колхозах «Коммунизм* и им. Свердлова Бухарской области; на свиньях 8—10-месячного возраста крупной белой породы и их помесях в ОПХ «Красный Водопад» ц в совхозах Галля-Кудук Ташкентской области и им. Тельмана КК АССР; на индейках в ОПХ «Красный Водопад» и совхозе «Химик»' Ташкентской области.
Группы животных формировали по принципу аналогов с учетом массы тела, возраста и породы. Во всех опытах животные получали рационы, общепринятые по набору кормов и сбалансированные по питательности.
В лабораторных и научно-производственных опытах 17«-окенпрогестероиа капронат (17-КОП) инъецировали в смеси растительного масла (7 частей) и бензпл-бензоата (3 части) в 5%-ной концентрации (овцам) или 10%-ной (крупному рогатому скоту, свиньям).
Кровь для исследования динамики уровня гормонов брали у крупного рогатого скота из яремной вены, у свиней из кавернозного синуса по усовершенствованной нами' методике (М. И. Прокофьев, Ю. Л. Селиверстов, 1965) и у индеек из подкрыловой вены.
В сыворотке крови исследовали радноиммунологнческнм методом прогестерон с использованием наборов реактивов PPOGK и эстрадиол-17р при помощи набора реактивов ESTRK; фолликулостнмуллрующий гормон (ФСГ) определяла в крови методом S. Stceiman a. F. РоЫеу (1953), а лю-теинизирующий гормон (ЛГ) методом A. Parlow (1961) и радноиммунологическим методом G. Niswender (1969) в нашей модификации (М. И. Прокофьев и др.; 1975). Концентрирование гонадотропинов в сыворотке крови для биологического тестирования проводили по разработанной нами методике (М. И. Прокофьев, Ю. А. Селиверстов, 1965; М. И. Прокофьев и др., 1977), а в моче каолин-ацетоновым методом A. Albert (1956) в модификации Г. С. Степанова (1961) и В, М. Дильмана (1965). В качестве стандартов использовали гонадотропные препараты Национального института здоровья США (NIH) и препараты, полученные нами из лабораторії М. Jutisz (Франция), также отстандартизированные по NIH: 1 мг LH—М2 (Франция) эквивалентен 2,5 мг NIH —
LH—S8.-
Гестагеїшую активность испытуемых стероидных производных определяли в модифицированном тесте G. Clauberg (1930) в индексах по Макфайлу-Юнкману.
В цервикальном секрете коров определяли хлориды методом A. Vogel (1966), общий и остаточный белок методом И. Lowry (1951); электрическое сопротивление слизистой, влагалища коров с помощью «Эстрометр-2»; индекс арборн-зацни секретов оценивали по б-баллыюй шкале (С. Atlis-ton et al., 1958).
Макрометрнческие исследования яичников проводили по> методике Е. Ф. Поликарповой (1957) с помощью пластинчатого аппарата. Массу всей фолликулярной жіндкости ir наибольшего фолликула устанавливали путем определения различия в массе цельного яичника и после удаления из него жидкости, соответственно из всех везикулярных фолликулов «ли из наибольшего. Гистоморфологические исследования яичников и матки проводили по общепринятой методике ( Г. А. Меркулов,' 1969). Оценку нормальных и атрети-ческих фолликулов проводили по классификации G. Marion et al., (1968).
Статистическую обработку полученных данных проводили по Стьюденту (Е. К. Меркурьева,, 3970) и с использованием непараметрнческой статистики (S. Siege!, 1956).
Научная новизна. Разработан способ повышения чувствительности биологических методов определения ФСГ и ЛГ в сыворотке крови животных, использование которого позволило впервые изучить количественные изменения уровня го-нлдотропных гормонов гипофиза в крови у самок крупного рогатого скота, свиней и индеек. На основании полученных данных выявлена общефизиологическая закономерность ритмичного выделения гипофизом гонадотропных гормонов в течение полового цикла у млекопитающих и овуля-торного цикла у птицы, В яичниках коров в течение полового цикла выявлены три, а не две, как это предполагалось раньше, волны роста и развития фолликулов, что хорошої коррелирует по времени с периодами повышенной секреции гнлофнзарных гонадотропинов. Установлено, что в дискретности секреции гонадотропинов гипофизом и развитии фолликулов в яичниках коров проявляется одна из закономерно-стен, присущая саморегулирующей системе, которая обеспечивает устойчивое равновесие функционирования гипотала-мо-гнпофнзарного комплекса и половых желез. Это положение развивает теорию М. М. Завадовского «плюс—минус
взаимодействия» н обосновывает перспективу новых поисков регулирования функции воспроизведения у животных.
Определена положительная корреляция между уровнем ЛГ в крови в предовуляторный период и оплодотворяемостью коров, что открывает возможности повышения воспроизводительной функции коров путем усиления ЛГ-активности во время охоты,
В комплексных исследованиях с ВНИХФИ Минздрава СССР установлена зависимость биологической активности ряда производных прогестерона от «защиты» метаболических центров стероидной молекулы и пролонгации действия от превращения 3-оксистероидов в эфиры жирных кислот. На основе выявленных взаимосвязей между биологической активностью и структурой молекулы производных прогестерона определены пути создания новых прогестагенов с заданными биологическими свойствами. Среди исследованных стероидных соединении выявлены прогестагены с высокой биологической активностью и удовлетворительной пролонгацией действия, которые рекомендуются для разработки новых малотрудоемкнх методов синхронизации охоты у сельскохозяйственных животные.
Разработано теоретическое обоснование и предложены новые способы синхронизации охоты у самок сельскохозяйственных животных путем однократного парентерального применения прогестагенов пролонгированного действия (авторское свидетельство № 367866; получены положительные решения о выдаче авторских свидетельств по заявкам № 1904192/15 и № 2149961/30—15).
Определены особенности секреции гонадотропних и половых гормонов у коров при вызывании суперовуляцин, которые могут быть причиной низкого выхода полноценных эмбрионов; разработан новый способ вызывания суперовуляции у коров, основанный на сочетанием применении гона-дотропинов и прогестерона (получено решение о выдаче авторского свидетельства по заявке № 2615974/30—15).
На основе дифференцированного растворения белковых фракций в растворах нейтральных солей, в частности сернокислого аммония, разработан новый способ получения препаратов ФСГ -из гипофизов животных (авторское свидетельство № 413947; патенты: в США № 3, 973, 004, во Франции № 215914 и в Швеции № 7215903).
Практическая значимость работы. Разработанный способ синхронизации охоты у ремонтных телок, овец и свиней путем однократного парентерального введения прогестагенов пролонгированного действия в сочетании с эстрогенами и ХГ позволяет до минимума сократить трудоемкость обработки
животных. Применение этого способа сокращает сроки плодотворного осеменения телок на 20—25 дней и' сервис-период у коров на 17—35 дней.
Использование предложенного способа вызывания супер-овуляцнн у коров, включающего введение животным прогестерона одновременно с сывороточным гонадотропином (ГСЖК) в фолликулярную фазу полового цикла, повышает примерно на 30% число животных, реагирующих супер-овуляцией, и значительно сокращает вариабельность реакции яичников коров по числу овуляций.
Усовершенствованные инструменты и способы трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота повышают эффективность их извлечения и пересадки и приближают технику исполнения нехирургическоп трансплантации к методу искусственного осеменения, что расширяет возможности внедрения его в практику животноводства.
Предложенный способ концентрирования гонадотропи-лов в крови животных повышает чувствительность известных биологических методов определения ФСГ в 5—6 раз, а ЛГ в 2 раза. Применение этого способа дает возможность исследовать концентрацию гонадотропииов в.іфови животных биологическими тестами.
Способ получения ФСГ из гипофизов животных путем дифференцированного растворения этого гормона в растворах сернокислого аммония отличается простотой исполнения, дешевизной и высоким выходом продукта из гнпофизарного сырья. Отработана технология получения ФСГ из гипофизов разных видов животных, которая может быть применена на заводах по производству эндокринных препаратов из гнпофнзарного сырья.
Гормональный метод торможения инстинкта насиживания у индеек, предложенный нами, вызывает прекращение насиживания более чем у 90% клохчущих индеек через одни сутки после обработки н способствует значительному повышению яйценоскости (на 18%).
Структура и объем работы. Диссертация построена по принципу изложения и обсуждения литературных и собственных исследований в каждой главе работы. В заключение проведено обсуждение объединенных материалов диссертации, сформулированы основные научные положения и выводы.
Диссертация содержит 347 страниц машинописного текста с 71 таблицами, 27 рисунками и 4 фотографиями. Приложение состоит из 36 таблиц и других материалов. Список используемой литературы включает 863 наименования работ, в том числе 645 работ иностранных авторов.