Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Роль электрических синапсов в механизмах генерации дыхательного ритма и паттерна 11
1.1 Роль щелевых контактов в осуществлении жизнеобеспечивающих функций организма млекопитающих 11
1.1.1 Строение щелевых контактов 11
1.1.2 Функции щелевых контактов 12
1.2 Роль электрических синапсов в функционировании дыхательного центра 15
1.2.1 Электрические синапсы в нервной системе 15
1.2.2 Типы конексинов, характерные для нервной системы 17
1.3 Электрические синапсы в дыхательном центре млекопитающих 18
1.3.1 Роль электрических синапсов в генерации ритма респираторной активности 18
1.3.2 Роль электрических синапсов в генерации дыхательного ритма 19
1.3.3 Роль электрических синапсов в генерации дыхательного паттерна 25
1.3.4 Роль электрических синапсов в функционировании дыхательных мотонейронов 27
Глава 2 Материалы и методы исследования 33
Глава 3 Значение электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов в механизмах генерации инспираторной активности новорожденных крыс in vitro 42
3.1 Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга новорожденных крыс при общей перфузии препарата 43
3.2 Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга новорожденных крыс при изолированной перфузии продолговатого мозга 45
3.3 Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга новорожденных крыс при изолированной перфузии спинного мозга 47
3.4 Обсуждение 51
Глава 4 Значение электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов в механизмах генерации инспираторной активности у плодов крыс in vitro 54
4.1 Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга плодов крыс при изолированной перфузии продолговатого мозга 55
4.2 Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга плодов крыс при изолированной перфузии спинного мозга 58
4.3 Обсуждение 60
Глава 5 Участие естественных факторов в регуляции электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов и модуляции механизмов генерации респираторной активности у новорожденных крыс in vitro 64
5.1 Анализ влияния изменений параметров кислотно-основного равновесия в искусственной цереброспинальной жидкости на параметры инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс 64
5.1.1 Изменение инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс на фоне повышенного содержания протонов и углекислого газа в искусственной цереброспинальной жидкости 65
5.1.2 Изменение инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс на фоне избыточного содержания протонов в искусственной цереброспинальной жидкости в условиях нормокапнии 69
5.1.3 Изменение инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс на фоне избыточного содержания углекислого газа и нормальных значениях рН в искусственной цереброспинальной жидкости 71
5.2 Анализ влияния активатора внутриклеточного депо кальция - кофеина - на параметры инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс 73
5.3 Обсуждение 77
Заключение 82
Выводы 86
Список литературы
- Роль щелевых контактов в осуществлении жизнеобеспечивающих функций организма млекопитающих
- Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга новорожденных крыс при общей перфузии препарата
- Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга плодов крыс при изолированной перфузии продолговатого мозга
- Анализ влияния изменений параметров кислотно-основного равновесия в искусственной цереброспинальной жидкости на параметры инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс
Введение к работе
Актуальность исследования
Благодаря развитию и внедрению в нейрологию новых научных
технологий, происходит коренное изменение представлений о механизмах,
обеспечивающих взаимодействие нейронов в нервной системе.
Иммуногистохимические исследования доказывают широкое
распространение практически во всех отделах центральной нервной системы млекопитающих коннексинов, образующих межклеточные щелевые контакты, выполняющих функцию электрических синапсов (Dermietzel R. et al., 1989). На всех этапах онтогенеза млекопитающих в нервной системе обнаруживаются нейронные сети, связь в которых осуществляется как через химические, так и электрические синапсы (Kopell N., Ermentrout В., 2004). Интенсивное накопление морфофункциональных данных, подтверждающих широкое распространение электрических синапсов в нервной системе млекопитающих, ставит вопрос об их функциональном назначении.
Морфологическими и электрофизиологическими методами в нейронных сетях продолговатого мозга, осуществляющих генерацию дыхательного ритма и его регуляцию, обнаружены электротонически связанные нейроны (Rekling J.C., Feldman J.L., 1997; Bou-Flores С, Berger J. 2001). С помощью фармакологических блокаторов щелевых контактов (Solomon I.C. et al., 2003; Bou-Flores С, Berger J., 2001) установлено существенное значение электротонического взаимодействия бульбарных дыхательных нейронов для генерации дыхательного ритма у новорожденных и взрослых животных.
До 30% диафрагмальных мотонейронов новорожденных крысят имеют электротоническую связь с 1-2 соседними клетками (Martin-Caraballo М., Greer J.J., 1999). Однако через 10 дней после рождения эти связи полностью исчезают. Традиционно считается, что наличие электротонического
взаимодействия между диафрагмальными мотонейронами обеспечивает эффективную синхронизацию электрической активности для формирования адекватного инспираторного усилия у новорожденных (Martin-Caraballo М. et al., 2000). Кроме того, наличие обширных связей мотонейронов посредством щелевых контактов в перинатальном периоде может играть важную роль в осуществлении контроля над процессом формирования нейромышечных связей (Chang Q., 2000). Также установлено, что посредством щелевых контактов пулы мотонейронов спинного мозга образуют нейронные сети, обладающие собственной ритмической активностью и представляющие собой функциональные модули системы,, обеспечивающей координацию двигательной активности (Demir R. et al., 2002).
В настоящее время выявлен ряд факторов, способных вызывать закрытие коннексонов в щелевых контактах. Это могут быть как фармакологические препараты, к которым относятся производные глицирризиновой кислоты (Goldberg G.S. et al., 1996), некоторые высшие спирты (Spray D.C., Bennett M.V., 1985), так и большинство ингаляционных анестетиков (Yasui Y. et al, 2007). Кроме того, существует ряд естественных факторов, способных модулировать проницаемость щелевых контактов: ацидоз, гиперкапния, повышение концентрации кальция внутри клетки (Dean J.B. et al., 2002; Roerig В., Feller M.B., 2000; Scamps F. et al., 2004). Ha математических моделях и в условиях эксперимента доказано, что путем изменения уровня электротонического взаимодействия нейронов в сети можно модулировать электрофизиологические свойства нейронов и трансформировать поведение самой сети в широком диапазоне (Sherman А, Rinzel J., 1992; Skinner F.K. et al., 1999, Kepler T.B. et. al., 1990).
Представленные данные дают основание предположить, что модулирование уровня электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов может оказывать существенное влияние на эффективность контроля инспираторного усилия у новорожденных.
Цель исследования. Целью настоящего исследования являлось выявление роли электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов в механизмах генерации инспираторного паттерна на ранних этапах онтогенеза дыхательного центра крыс. Основные задачи исследования.
Изучить особенности изменения параметров инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс in vitro при изолированном воздействии блокатора щелевых контактов - галотана на структуры спинного мозга.
Провести сравнительный анализ возрастных особенностей влияния изолированного воздействия блокатора щелевых контактов - галотана на структуры спинного мозга бульбоспинального препарата плодов и новорожденных крыс.
Исследовать влияние естественных факторов, вызывающих блокаду щелевых контактов (гиперкапния, ацидоз, повышение внутриклеточной концентрации кальция), на параметры инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс in vitro при изолированном воздействии на структуры спинного мозга.
Положения, выносимые на защиту
Электротоническое взаимодействие диафрагмальных мотонейронов участвует в механизмах формирования амплитудно-временных и частотных характеристик инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс.
В перинатальный период роль электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов в формировании параметров инспираторной активности расширяется от участия в процессе контроля продолжительности инспираторного разряда до контроля их амплитуды и частотных характеристик.
3. Среди естественных факторов, способных оказывать влияние на проницаемость щелевых контактов (ацидоз, гиперкапния, повышение концентрации внутриклеточного кальция), наиболее выраженным угнетающим влиянием на процесс передачи инспираторнои активности к диафрагмальной мышце, характерным для блокады электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов, обладает ацидоз.
Научная новизна
Впервые установлено, что фармакологическая блокада электрических синапсов в структурах спинного мозга новорожденных крыс in vitro вызывает снижение эффективности процесса передачи инспираторнои активности диафрагмальными мотонейронами, которое характеризуется уменьшением амплитуды и продолжительности инспираторных разрядов, а также перераспределением соотношения мощностей осцилляции низко- и среднечастотного диапазонов. Установлено, что в бульбоспинальных препаратах мозга плодов эффективность передачи инспираторнои активности мотонейронами на диафрагмальную мышцу в меньшей степени зависит от наличия между ними электротонического взаимодействия, нежели в препаратах мозга новорожденных крыс.
Впервые проведен сравнительный анализ влияния естественных факторов, блокирующих проницаемость щелевых контактов на центральные механизмы формирования инспираторнои активности. Установлено, что характер влияния ацидоза на функционирование диафрагмальных мотонейронов полностью идентичен эффектам фармакологической блокады электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов галотаном.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные позволили установить значение
электротонических связей между диафрагмальными мотонейронами у новорожденных крыс для процесса генерации паттерна инспираторнои активности. Материалы работы расширили существующие теоретические представления о функциональном значении электротонического взаимодействия нейронов в нервной системе млекопитающих. Проведенная в работе оценка возможности естественных факторов, блокирующих щелевые контакты, модулировать функциональную активность диафрагмальных мотонейронов создает теоретическую предпосылку для разработки патогенетических механизмов нарушения вентиляции легких у новорожденных центрального генеза.
Апробация работы
Основные положения диссертации обсуждены и изложены на Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функциологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), II Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), 59 научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, 2005), V межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные медико-биологические проблемы» (Ижевск, 2005), Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Оренбургской области (Оренбург, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей (С-Петербург 2005), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), XIII Международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт Петербург, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Самарская физиологическая школа»,
посвященной 110-летию со дня рождения М.В. Сергиевского (Самара, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 - в центральной печати, в том числе 2 - в реферируемых журналах.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав с изложением результатов собственных исследований, заключительного обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 151 источников, в том числе 14 отечественных и 137 зарубежных.
Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 12 рисунков.
Роль щелевых контактов в осуществлении жизнеобеспечивающих функций организма млекопитающих
Согласно современной гипотетической модели, построенной на базе данных электронной микроскопии, щелевые контакты представляет собой участок сближения плазматических мембран до 2-4 нм. Диаметр такого соединения варьирует от 0,1 до 10 мкм. В каждой из двух соседних клеточных мембран находятся регулярно распределенные через небольшие промежутки коннексоны. Это кольцевидные структуры, состоящие из шести идентичных субъединиц, называемых коннексинами с молекулярной массой 25 000-54 000. Коннексон пронизывает всю толщу мембраны и представляет собой водную пору с диаметром 1,5 нм. При совмещении коннексонов двух соседних клеток образуется водный канал, по которому клетки могут обмениваться ионами и относительно крупными молекулами с молекулярной массой до 1000 (моносахара; вещества, контролирующие процессы эмбриогенеза, роста и дифференцировки клеток, Са2+, цАМФ, ИФ3). Коннексины могут подвергаться двусторонним конформационным изменениям, приводящим к открытию или закрытию канала. Функциональное значение ЩК определяется наличием интерцитоплазматических связей, позволяющих клеткам обмениваться различными веществами. Возможность ЩК пропускать ионы и относительно крупные молекулы обеспечивает механизмы сглаживания межклеточных концентрационных градиентов, обеспечивающих - координацию метаболической и электрической активности в системе связанных клеток. 0-4 Транспорт через щелевые контакты вторичных посредников (цАМФ, Са , ИФ3) позволяет формировать согласованную ответную реакцию связанных клеток на действие внеклеточных сигнальных факторов.
В жизни млекопитающих щелевые контакты начинают играть существенную роль в процессах жизнедеятельности уже с первых дней существования. Наличие межклеточного взаимодействия посредством щелевых контактов является одним из факторов, определяющих последовательность и правильность дифференцировки клеток в эмбриональном периоде. Начиная с 8-клеточной стадии, у эмбрионов позвоночных животных между бластомерами образуются щелевые контакты (Дыбан А.П., 1988). Считается, что обмен веществ между клетками в этот период необходим для реализации генетической информации. Например, обнаружено участие ЩК в транспорте факторов роста и апоптоза между эмбриональными клетками. Блокатор ЩК - глицирризиновая кислота -нарушает компактизацию клеток у эмбриона, что приводит к исключению их из дальнейшего развития и последующему лизису рыхло расположенных клеток (Becker D.L. et al., 1995).
Предполагается, что ЩК необходимы раннему зародышу для максимально эффективного приспособления к неблагоприятным условиям, например, позднее оплодотворение, длительное прохождение через Фаллопиеву трубу или ранний вход в матку (Дыбан А.П., 1988).
Существует мнение, что наличие ЩК обеспечивает согласованный клеточный ответ на сигналы, поступающие от материнского организма путем быстрого и равномерного распространения информации между клетками эмбриона. Обмен информацией в системе мать-плод начинает осуществляться ещё в преимплантационном периоде развития, что может способствовать увеличению скорости деления клеток и формирования бластоцисты (Bowman P., McLaren A. J., 1970).
Процесс дифференцировки клеточной массы эмбриона приводит к формированию тканей, клетки которых остаются связанными друг с другом и функционируют как единое целое. Известно, что на позднем этапе эмбрионального развития щелевые контакты обычно сохраняются только между клетками одного типа ткани. Это обеспечивает группу связанных клеток «позиционной информацией», необходимой для осуществления контроля их тканевой дифференцировки согласно локализации в эмбрионе (WolpertL., 1994). Роль щелевых контактов в функционировании организма млекопитающих не ограничивается участием в процессах роста и развития. У взрослых млекопитающих принцип единого коммуникационного внутриклеточного пространства, обеспечивающего согласованный ответ большого числа клеток при незначительной внешней стимуляции, использован для осуществления иерархического взаимодействия в некоторых электровозбудимых тканях (Wolpert L., 1969; 1994). Например, при незначительной степени двигательной иннервации скелетных мышц или реализации пейсмекерных механизмов в висцеральной гладкой мускулатуре и миокардиальнои ткани. Наличие щелевых контактов (нексусов) позволяет распространяться возбуждению с одной мышечной клетки на другую, обеспечивая одномоментное сокращение мышечного массива.
Таким образом, мы можем видеть, что ЩК принимают большое участие в межклеточном взаимодействии многих видов тканей, транспортируя различные сигнальные молекулы и ионы. Наиболее интересным, но недостаточно широко освещенным в современной литературе является вопрос о роли ЩК в функционировании нейронных сетей ЦНС. Поскольку через ЩК может осуществляться трансмембранный ток ионов в соседних клетках, одной из наиболее интересных сторон функционального назначения ЩК в нервной системе является их участие в распространении и трансформации электрических потенциалов нервных клеток. В связи с этим часто ЩК в применении к возбудимым тканям называют электрическими синапсами.
В нейронных сетях млекопитающих щелевые контакты не только обеспечивают синхронизацию электрической активности, но и лежат в основе процесса генерации осцилляционной активности, а также расширяют диапазон режимов их функционирования (Abbott L.F. et al., 1991; Sherman A., RinzelJ., 1992).
С момента обнаружения у ряда фармакологических препаратов свойства блокировать щелевые контакты у ученых появилась возможность более эффективно изучать их функции и расширить представление об их роли в жизнедеятельности организма млекопитающих.
Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга новорожденных крыс при общей перфузии препарата
В группе препаратов мозга новорожденных крыс, у которых осуществлялась общая перфузия ИЦЖ, содержащей галотан (Юммоль/л), в среднем через 5 мин (317,7±32,0 с) наступало обратимое торможение инспираторной активности (рис. 3.2, А). В середине временного интервала (TV2), в течение которого происходило полное угнетение инспираторной активности, достоверных изменений продолжительности инспираторного цикла не наблюдалось.
В то же время отмечалось значительное уменьшение амплитуды и продолжительности инспираторных разрядов (на 20% (р 0,05) и 25% (р 0,01) соответственно). Изменения претерпевали и спектральные характеристики инспираторных разрядов (рис. 3.1) — уменьшалась амплитуда пиков спектральной плотности мощности в низко-(1-10 Гц) и среднечастотном (11-50 Гц) диапазонах спектра на 69% (р 0,001) и 61% (р 0,01) соответственно (таб. 3.1). При этом не произошло достоверных смещений пиков в другие частоты в пределах диапазона. Снижение спектральной плотности мощности (СПМ) было более выраженным в низкочастотном диапазоне, чем в среднечастотном, о чем свидетельствует достоверное снижение соотношения амплитуды пиков СПМ на 19% (р 0,05) относительно исходной величины.
Представленные изменения инспираторной активности доказывают участие механизма электротонического межнейронного взаимодействия в функционировании генератора инспираторного паттерна. Однако подобные изменения могли возникнуть как при блокировании электрических синапсов в нейронных сетях спинного, так и продолговатого мозга.
Отсутствие достоверных различий по среднему времени наступления полного торможения инспираторной активности в экспериментах с общей перфузией препарата и изолированной перфузией продолговатого мозга подтверждает ранее полученные данные (Rekling J.C. et al., 2000) о важности механизма электротонического взаимодействия нейронов в сети генератора дыхательного ритма.
Значительно уменьшалась амплитуда пиков СПМ низко- и среднечастотного диапазонов спектра (на 61% (р 0,01) и 46% (р 0,001) соответственно), наиболее выраженное снижение происходило в низкочастотном диапазоне, на что указывает изменение соотношения амплитуд (МНЧ/МСЧ), которое снижается на 27% (р 0,05). В отличие от экспериментов, в которых осуществлялась общая перфузия БСП мозга новорожденных крыс, в данных экспериментах не происходило достоверного уменьшения продолжительности инспираторных разрядов. Этот факт позволяет предполагать, что именно уровень электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов в конечном итоге определяет продолжительность инспираторной активности.
В экспериментах с изолированной перфузией спинного мозга ИЦЖ, содержащей галотан (10ммоль/л), полного угнетения инспираторной активности не происходило. Она сохранялась на протяжении всего периода (40 мин.), в течение которого осуществлялось воздействие (рис. 3.2, В). Следовательно, блокада электротонического взаимодействия мотонейронов не является критичной для процесса передачи инспираторной активности на диафрагмальную мышцу.
В течение первых 10 минут воздействия происходило выраженное прогрессивное снижение амплитуды инспираторных разрядов на 5-ой минуте на 19% (р 0,01) и на 10-ой минуте на 38,6% (р 0,001) (таб. 3.3). Сопоставляя эти данные с результатами, полученными при изолированной перфузии продолговатого мозга, можно отметить, что наиболее выраженное угнетение амплитуды инспираторных разрядов происходит при воздействии галотана на структуры спинного мозга.
Степень снижения амплитуды инспираторных разрядов во время изолированной перфузии спинного мозга в среднем в 2 раза больше, по сравнению с наблюдаемым при изолированной перфузии продолговатого мозга (рис. 3.3). Следовательно, механизм электротонического взаимодействия респираторных нейронов на уровне спинного мозга в раннем постнатальном периоде имеет большее значение для реализации процессов, обеспечивающих формирование амплитуды инспираторных разрядов, чем на уровне продолговатого мозга.
Как видно на рисунке 3.3, наряду с уменьшением амплитуды инспираторных разрядов блокирование щелевых контактов структур спинного мозга приводит к уменьшению их продолжительности на 22% (р 0,001) от исходных значений. Подобный эффект наблюдается как при общей перфузии, так и при изолированной перфузии спинного мозга в БСП перфузатом, содержащим галотан, но отсутствует в тех экспериментах, когда воздействие осуществлялось изолированно на продолговатый мозг.
Анализ этих фактов дает основание высказать предположение, что от функционального состояния пула диафрагмальных мотонейронов зависит не только амплитуда разряда, но и его продолжительность. При этом одним из факторов, определяющих продолжительность инспираторных разрядов, формируемых диафрагмальными мотонейронами, является степень электротонического взаимодействия между ними.
При воздействии галотана на структуры спинного мозга происходят существенные изменения спектральных характеристик инспираторных разрядов (рис. 3.4). К 5-ой минуте перфузии на 44% (р 0,05) и 32% (р 0,05) снижается амплитуда пиков спектральной плотности мощности в низкочастотном (0-10 Гц) и среднечастотном (11-50 Гц) диапазонах спектрограмм инспираторных разрядов соответственно (таб. 3.3). Подобные изменения наблюдались нами в экспериментах, в которых осуществлялась изолированная перфузия продолговатого мозга ИЦЖ с галотаном.
Влияние галотана на электрическую активность БСП мозга плодов крыс при изолированной перфузии продолговатого мозга
В серии экспериментов, в которых производилась изолированная перфузия продолговатого мозга плодов ИЦЖ, содержащей 10 мМ галотана респираторная активность в С3-С4 исчезала в среднем через 219,43±13,34 с. При сравнении с данными аналогичных экспериментов, проведенных на препаратах новорожденных крыс, статистически значимых различий не было установлено. Это дает основание предположить отсутствие существенных изменений роли электротонического взаимодействия респираторных нейронов в процессах генерации дыхательного ритма.
При анализе паттерна инспираторной активности в период ТУг были обнаружены существенные различия между характером изменений параметров инспираторных разрядов, которые возникают на фоне блокады щелевых контактов галотаном в продолговатом мозге плодов и новорожденных крыс.
При изолированной перфузии продолговатого мозга БСП плодов ИЦЖ, содержащей галотан, не происходило достоверных изменений амплитуды инспираторных разрядов, регистрируемых в С3-С4. При этом продолжительность инспираторных разрядов на фоне действия галотана уменьшалась - на 14% (р 0,05) (таб. 4.1). При анализе спектрограмм инспираторных разрядов до и после воздействия галотана было выявлено существенное уменьшение мощностей низко- и среднечастотного пиков (на 38% (р 0,05) и 32% (р 0,05) соответственно).
Изменение спектральных характеристик инспираторных разрядов, регистрируемых в вентральных С3-С4, при изолированной перфузии продолговатого мозга Б СП ИЦЖ, содержащей галотан (ЮмМ) А — новорожденных крыс Б — плодов крыс Представленные данные позволяют говорить о том, что в пре- и постнатальном периоде роль электротонического взаимодействия респираторных нейронов бульбарной сети в процессе генерации инспираторного паттерна имеет ряд существенных различий. Это может быть связано как с возрастными изменениями в процессе генерации инспираторного паттерна, так и возрастными изменениями характера электротонического взаимодействия между нейронами.
В экспериментах, в которых осуществлялась изолированная перфузия структур спинного мозга бульбоспинального препарата мозга плодов крыс ИЦЖ, содержащей галотан (10ммоль/л), в течение первых 5 минут у всех препаратов амплитуда инспираторных разрядов существенно не изменялась.
Влияние изолированной перфузии спинного мозга бульбоспинальных препаратов мозга плодов ИЦЖ, содержащей галотан (ЮмМ), на параметры инспираторной активности вентральных корешков С3-С4 (М±т) Параметр Изолированная перфузия спинного мозга БСП Плоды (п=7) фон 5 мин Мощность низкочастотного пика, о.е. 3,66±0,63 3,25±0,39 Частота низкочастотного пика, Гц 2,85±0,15 2,69±0,17 Мощность среднечастотного пика, о.е. 0,75±0,12 0,82±0,08 Частота среднечастотного пика, Гц 12,15±1,20 13,15±1,39 Соотношение МНЧ/МСЧ 4,95±0,45 4,15±0,46 Продолжительность инспираторного разряда, с 0,738±0,052 0,635±0,057 Амплитуда разряда, мкВ 83,78±12,28 74,85±12,35 Продолжительность респираторного цикла, с 23,80±6,16 18,20±4,12 - достоверность различий параметров соответственно р 0,05, р 0,01, р 0,001 На пятой минуте изолированной перфузии спинного мозга БСП плодов ИЦЖ, содержащей галотан, происходило достоверное уменьшение продолжительности инспираторных разрядов (на 13,9% (р 0,05) (таб. 4.2). Подобные изменения были описаны выше, в экспериментах, проводившихся на БСП мозга новорожденных крыс (см. главу 3). Амплитуда инспираторных разрядов за этот период действия галотана у всех используемых в этой серии препаратов мозга плодов достоверно не изменяется (рис. 4.2). Анализ спектрограмм инспираторных разрядов, зарегистрированных до воздействия галотана
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в перинатальном периоде участие электротонического взаимодействия диафрагмальных мотонейронов в формировании инспираторной активности значительно расширяется. У плодов блокада щелевых контактов между диафрагмальными мотонейронами отражается только на продолжительности инспираторных разрядов, тогда как у новорожденных, дополнительно к этому, уменьшается амплитуда инспираторных разрядов и амплитуда пиков спектральной плотности мощности.
У крыс формирование кластеров мотонейронов, объединяющих от 4 до 10 клеток, происходит на 14 сутки внутриутробного развития. В дальнейшем происходят существенные изменения в системе электротонической связи мотонейронов спинного мозга. К рождению уменьшается количество кластеров (с 88 на 16 сутки гестации до 21) и количесво клеток, их образующих (с 3 на 16 сутки гестации до 2,5). (Bittman K.S.et al., 2004) Кроме того в этот период увеличивается гетерогенность коннексонов (Nagy J.I. et al., 2004). Наиболее существенные изменения в системе электротонических связей мотонейронов спинного мозга происходят к концу первой постнатальной недели (Martin-Caraballo М., Greer J.J., 1999; Chang Q. et al., 2000; Mentis G.Z. et al., 2002). Высказываются предположения, что исчезновение электротонической связи между диафрагмальными мотонейронами обусловлено усилением глутаматергической стимуляции опосредованном через NMDA-чувствительные рецепторы (Mentis G.Z. et al., 2002). Таким образом, в тот период развития спинного мозга, на который приходится наше исследование (20 сут. гестации — 4-е постнатальные сутки), происходят существенные изменения в характере электрототнического взаимодействия, поэтому установленные нами возрастные особенности влияния блокатора щелевых контактов — галотана — на характер инспираторнои активности можно связать с изменением системы электротонической связи.
Анализ влияния изменений параметров кислотно-основного равновесия в искусственной цереброспинальной жидкости на параметры инспираторной активности бульбоспинальных препаратов мозга новорожденных крыс
Незрелость механизмов регуляции дыхания на ранних этапах постнатального развития является одной из причин развития различных форм нарушения газового гомеостаза. В свою очередь возникающее при этом снижение напряжения кислорода, повышение напряжения углекислого газа и концентрации ионов водорода во внутренней среде организма оказывают влияние на структуры, обеспечивающие регуляцию дыхательной функции и вызывают нарушения в их осуществлении, усугубляя имеющуюся неэффективность этих механизмов. В связи с этим встает вопрос о характере влияния тех или иных отклонений параметров гомеостаза на осуществление процессов генерации дыхательного ритма. В респираторной нейронной сети существуют механизмы хеморецепции, которые обеспечивают формирование ответных реакций, направленных на поддержание параметров газового гомеостаза (Nattie Е.Е., 1999). Однако известно, что гиперкапния и ацидоз могут оказывать влияние на функцию не только хемочувствительных нейронов, но и тех, которые данным механизмом не обладают (Otsuguro К. et al., 2006). Ацидоз оказывает многокомпонентное влияние на функцию нейронных сетей, может изменять интенсивность секреции медиатора из пресинаптических окончаний, изменять электрофизиологические свойства, вызывать повышение внутриклеточной концентрации кальция (Tombaugh G.C. et al., 1997; Fedorovich S.V. et al, 2003; Chu X.P. et al., 2003; Yermolaieva O. et al., 2004; Wu L.G. et al., 2004; Wang V.Z. et al., 2006; Otsuguro K. et al., 2006). Одной из точек приложения влияния гиперкапнии и ацидоза могут быть щелевые контакты. В работах В. Rorig и соавт. (1996); Dean et al. (2001) показано, что при увеличении концентрации СОт и НҐ во вне- и внутриклеточной среде коннексоны закрываются и происходит развязывание электротонического взаимодействия нейронов. Учитывая значительную роль электротонического взаимодействия нейронов, в формировании параметров функционирования образованной ими сети, можно высказать предположение, что в условиях ацидоза и гиперкапнии нарушение электротонического взаимодействия, может играть существенную роль в снижении эффективности функционирования диафрагмальных мотонейронов. В данной части работы был проведен сравнительный анализ влияния на функционирование диафрагмальных мотонейронов естественных факторов и фармакологических веществ, вызывающих блокаду щелевых контактов. В1 условиях, когда в организме развивается некомпенсированный газовый ацидоз, во внутренней среде увеличивается как содержание углекислого газа, так и концентрация протонов. В первой серии экспериментов использовалась ИЦЖ, моделирующая условия некомпенсированного газового ацидоза, избыточно содержащая протоны и углекислый газ. Для этого ее насыщали гиперкапнической газовой смесью 10%СОги 90%О2. При длительном насыщении рН достигал значений 6,9-7,0.
В первой серии экспериментов осуществлялась общая перфузия БСП. При общей перфузии бульбоспинального препарата ИЦЖ, насыщенной гиперкапнической газовой смесью с рН 6,9-7,0, происходили значительные изменения в параметрах ритмической инспираторной активности, регистрируемой в вентральных корешках С3-С4. На 10 минуте воздействия было отмечено значительное сокращение продолжительности респираторного цикла. В среднем продолжительность респираторного цикла уменьшалась на 17% (р 0,05), а амплитуда инспираторных разрядов снижалась на 11% (р 0,05) от исходного уровня. На спектрограммах респираторных разрядов было выявлено снижение мощности низкочастотного пика СПМ на 21% (р 0,001) и мощность средиечастотного пика СПМ на 15% (р 0,01).
Кроме этого, на спектрограммах респираторных разрядов наблюдается смещение среднечастотного пика СПМ в сторону более низких частот с 20,01±0,17 до 18,79±0,18 (р 0,01) (таб. 5.1).
Данный комплекс изменений параметров инспираторной активности БСП мозга может быть обусловлен влиянием гиперкапнического ацидоза как на бульбарные механизмы их генерации, так и на спинномозговые механизмы. Для выявления компонентов, обусловленных влиянием ацидоза и гиперкапнии на структуры спинного мозга, была проведена серия экспериментов, в которых осуществлялось изолированное воздействие на структуры спинного мозга ИЦЖ, насыщенной гиперкапнической газовой смесью 10%СО2и 90%О2, с рН 6,9-7,0.
При изолированной перфузии спинномозговых структур ИЦЖ, насыщенной гиперкапнической газовой смесью с рН 6,9-7,0, частота генерации респираторных разрядов достоверно не изменялась. Достоверных различий между средними величинами продолжительности респираторного цикла до воздействия и на фоне гиперкапнического воздействия (рН 7,0) не выявлено. В то же время уменьшалась продолжительность инспираторных разрядов на 9,9% (р 0,05) от исходного уровня. Уменьшение продолжительности разрядов сопровождалось снижением и их амплитуды на 12,5% (р 0,05) от исходного уровня. При изолированной перфузии спинномозговых структур ИЦЖ, насыщенной гиперкапнической газовой смесью с рН 6,9-7,0, происходило уменьшение на 37,3% (р 0,05) мощности низкочастотного пика осцилляции (таб. 5.2).
