Введение к работе
Актуальность теки. В последние годы благо." -ря усовершенствованию методов изучения пищеварения у рыб был выполнен значительный объем морфологических и экологических исследований, уточнены спектр и свойства пищеварительных ферментов, выявлены особенности мембранного пищеварения. Появились такте работы, посвященные нейрогуморальної! регуляции пищеварения у низших позвоночных животных (Яржомбек А. А.. 1986: ШпарковсюШ И. Л.. 1936. 1992; Кузьмина В.В.. 1992; Holmgrens.. Grove D.J.. Fletcher D.J.. 1983;.
Усилившееся антропогенное воздействие і,і окружающую среду
обусловливает необходимость изучения адаптационных возможностей
организма животник, в том числе и рыб. к влиянию различных экс
тремальных факторов. а основании анализа многочисленных экспе
риментальных данных показано, что токсические вещества различной
химической структуры затрагивают на начальных о\ ах интоксика
ции специфические звенья метаболизма (Кузьмина В. В. и др..
1990). .
В связи с этим следует особо подчеркнуть роль энтсрал-чо! .) отдела метасимпатической нервной сиетепы (МНС), н.посредственно участвующей в поддержании органного и системного гомеостаза. а также в числе первых воспринимающей воздействие среды. В условиях стрессорного воздействия именно мегасимпатическая нервная система берет на себя задачу восстановления и поддержания гомеопатического равновесия, нарушенного в результате максимального напряжения деятельности органов и систем для защиты организма (Гнетов А. В.. 1979: Ноздрачев А.Л.. 1980. 1983. 1904, 1987. 1992; Качалов Ю.П.. 1980; Клипов П. К. л up'.. 1991).
Учитывая важность и значимость указанных аспектов р плане понимания роли метасимпатической нервной системы в реализации адаптационных механизмов стала очевидной необходимость изучения принципов организации нервно-клеточных ансамблей (модулей) и Форм их взаимодействия о зффекторнымя образованиями слизистой оболочки кишечника pro при воздействии на организм различных факторов среда.
Цель и задачи исследования. Важнейшим элементом оценки физиологического состояния рыб в условиях интенсивного рыбоводства
является определение показателей, характеризующих способность структур желудочно-кишечного тракта противостоять изменений внешних условий обитания.
Исходя из этого, основной целью настоящего исследования явилось выяснение степени участия структур функционального модуля энтеральноЛ части нетасимпатической нервной системы в восприятии процессов, происходящих в полости пищеварительного канала. Кроме того, мы пытались выяснить, какую роль играют структуры этого модуля, , асположенные непосредственно в пределах эпителия, в организации ответных реакций кишки на неадекватные раздражители, такие как сульфатний лигнин, являющийся основным компонентом сточных вод целлюлозно-бумажных предприятий.
В соответствии с целью работы были поставлены сведущие задачи:
-
На основании данных сканирующей электронной микроскопии конкретизировать изменения структури апикальной поверхности гк~ тероцитов и их связи в зг гелиальном пласте при хроническом воздействии на осетров сульфатного лигнина.
-
Используя гистохимические методы, установить локализация фермента холинэсгеразы в структурах 'гонкой кяшли остуо'а и карпов в нормальных условиях и при опосредованной воздействий токсических ьеществ. , , .
-
В условиях модельного эксперимента определить возношке цигофізиологические реакции эпителиальных структур нелудочно-іол-иечного тракта на химические стимулы.
-
Используя комплексную оценку иорфо-функциональныя изменений компонентов слизистой оболочки тонкой кишки, выявить реакцию эпителиальных структур и бокаловидных клетрк на непосредственное воздействие токсических веществ.
-
Определить возможные пути трансэпителись,ыюй передачи химической информации при избирательной воздействии на ишраэпи-телиалыше и интрамурадькые холинергическне структуры, используя специальную оценку секреторной и транспортной функць. киски. -
Шучная новизна работы.
і. Впервые рассмотрена особенности структурно-функциональной организации энтеральной часта метасиыпатической нервней сие-
твт у низких позвоночных <костно-хря!цевых и костистых рыб).
-
Впервые с помощью энзгоюгисгохимических исследования выявлена в составе эпителиального пласта клеточные элементы, обладающие высокой активностью холинэстеразы. Обнаружено, что при токсическом воздействии Ферментативная активность холинэстеразы возрастает.
-
В ходе интоксикации сульфатнім лигнином впервые обнару- . жены нарушения рельефа апикальной клеточной поверхности эпителия іаиечника рыб и дозозависимое увеличение десквамации эпителиальных клеток.
-
Впервые рассмотрены особенности реакіг кишечного эпителия на интра- и экстраэнтеральное воздействие токсикантов, а также холинолитиков и холиномиметиков.
-
Предложена схема организации реакции кишечного тракта на экстремальное воздействие, включающая первичные рецепторные элемента эпителиального пласта и функциональные мод""п метасимпати-ческой нервной системы.
Паушо-тсоретическпя значимость и практическая ценность, в работе рассмотрен .принципиально важный в теоретическом плане вопрос - выявлена функциональная организация перв'"'но-рецег. орного звена энтералыюи части кетасимпатической нервной системы и его взаимосвязь с нейронами подслизистого и межмышечного нервных сплетений.
Поступление питательных веществ у водных животных связано с опасностью проникновения.во внутреннюю среду токсических веществ, попадающих в водоемы в результате промышленных сбросов и накапливающихся в иловых отложениях. В работе представлено патофизиологическое обоснование методов экспресс-диагностики токсических воздействия на организм рыб. необходимых при проведении эколого-токсикологаческого мониторинга.
Структура п о5ъси работа, диссертация состоит из введения, обзора литературы. 5 глав, содержащих описание материала и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, общего заключения и выводов. Работа содержит 178 стр. машинописного текста, из которых 14 стр. занимают рисунки и таблицы, 30 стр. -список литературы, включающий 174 работы отечественных и 109 -
зарубежных авторов.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на: областной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Ярославль. 1990); Международном семинаре "Сенсорная морфофизиология морских рыб" (Дальние Зеленцы Мурманской области. 1992); VIII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск. 1992); XVII научной кон4ерен"'іи Ярославского государственного университета (Ярославль, 19^3); III Симпозиуме по экологической биохимии рыб (Кара-Дагское отделение ИнБЮМ, 1994).
Публикации. Ео теме диссертации опубликовано 6 работ.
' МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
В исследовании использовались представители низших позвоночных животных - костистые и костно-хрящевые рыбы. Для работы отбирали годовиков осетра -.ейского. . пресноводной формы осетра сибирского (Aclpenser faerl) и карпа чешуйчатого (Clprlnus саг-plo). выращенных в Волгореченском товарно-рыбоводном хозяйстве (Костромская область).
Метод ка прозедиш токсикологического эксперимента. Для проведения токсикологического исследования использовали методические рекомендации Главрыбвода Минрыбхоза СССР по установлению ПДК веществ в воде рыбохозяйс.твенных водоемов ( 1986. 1989). Рыб содержали е аквариумах екісостьв 40 литров с постоянной аэрацией и фильтрацией воды. Перед началом эксперимента животных адаптировали в теченг 10 - 12 суток. Исследовали две концентрации сульфатного лигнина - 2,5 и 10.0 иг/л. выделенного их сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината. Продолжительность хронического эксперимента 30 суток.
Приготовление препаратов для электрокно-иикроскопического исследования. Животных обездвиживали, разрушая спинной мозг пре-пар вальной иглой, Вскрывали брюцг ю полость, извлекали желудочно-кишечный тракт. Фрагмент проксимального отдела тонкой кишки длиной 10 мм. которую разрезали вдоль и расправляли на подложке слизистой оболочкой наружу. Препараты Фиксировали.в 1.5 х-ном
-.5 -
растворе глютаральдегнда ма 0.1 и фосфатной буфере при pi! 7,4 в течение 90 минут при комнатной температуре и дегидратировал!! в спиртах возрастающей концентрации. Суику осуществляли методом перехода критической точки С0Й в аппарате НСР - 2 "Hitachi". Затем образцы напыляли золотом в ионной нашлителе и изучали в сканирующем электронной микроскопе "Hitachi" - Н-300.
Приготовление препаратов для изучения механической стойкое- , та эпителия тонкой-кипам, Фрагменти проксимального отдела тонкой кишки длиной около 10 т разрезали вдоль л расправляли на предметной стекле слизистой оболочкой наружу. Препарат осторожно накрывали обезжиренным предметным стеклом на ' 2 секунды и на стекле получали отпечаток слизи, покрывающей опителі:і'і. Отпечаток фиксировали парами 10 Я-ного раствора формалина в течение 15 кинут, промывали и окравнвали гематоксилином по Гейденгайну. Окра-щеиный мазок обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации. Клетки подсчитывали в 10 полях зрения при увелич- ши х 600.
Приготовление препаратов для уст.опеплепнл локализации холи-нзетеразы ей структурам тонной кипхи риб. В работе использовали ингактаых осетров н карпов, а также осетров, находящихся в течение 30 суток под воздействием растворов сульфат- гп лиги; л с концентрацией 2,5 и 10,0 мг/л. Распределение фермента холинэсте-разы изучали тиохолпновын методом Карновского-Рутс (Karnovsky М.G.; Roots L.А., -1964) на нефиксированных тотальных препаратах проксимального участка тонкой кишки, а также на отпечатках слизи, покрывающей эпителий.
Методика проведения модельных экспериментов по выявлению цнтофизиологическия реакция структур то:;хсЛ кіеки ссетрся на изменение условий среды. Моделирование патофизиологических реакций проводили на изолированных из организма фрагментах проксимального отдела тонкой кишки длиной Ю мм. Освобожденные от содержимого отрезки кишечной трубки обсушивали - на беззольных фильтрах, взвешивали и помещали в кюветы объемом 1.5 мл. где в кишечную трубку вводили 0, 3-0,4 мл раствора., Для гньекций использовали растворы следующего состава: раствор Рингера. сульфатный лигнин (2,5 и 10,0 мг/л). приготовленный на растворе Рингера, аквариумная вода, сульфатный лигнин (2,5 и 10,0 мг/л),. приготовленный на
аквариумной воде. Кюветы заполняли аналогичными введвюши внутрь
кишки растворами. Одну серию -эксперимента проводили на -гашенных
Фрагментах, помещенных во влажнуй 'камеру без перфузироваюш ка
кими-либо растворами (т.е. ' штактныхЬ Время экспозиции состав
ляло 240 минут при температуро окрухаиэдзй.среды 15 - 1G С. Для
виявлення ііькішієшій состояния кишки во .время "цнкуСащщ . предва
рительно обсушенные Фрагмента юшеи--азвзпивала наздає 15 минут в
течение первого часа, и ;са;;:даэ 80 минут в течение ' последует;:
часов. , *'. ' . . , '
КеТОДІІ ОГ<ріДЄЛ2НІ1ІІ фуііКЦИОНаЛЬІІОГО СОСїййіЩ СЩ'ІІ'ЦР В.ІШ-
тсчиального слоя тонкой шшш виз. Для гистологического .анализа использовали арагмзнты тонкой шика -осетров, инкубдрсвшшиз в течение 240 илнут' в раствор є pjiarepa л. в растворах .сульфатного лигнина (2.5 и 10,0 яг/л). приготовление яз растаорэ Ршігера. іїа препаратах олределллл высоту ашггелиалыюго слоя складок слизистой оболочки, количество бокаловидных.'клеток па складка и объем мукоцнтов, который р считывали по'ор;іула эллипсоида вращения.
Методы изучения ..р^ши?.::! гл:жн грі .ГіГ.0і«і>аїЛЬ::Оіі 'ОздсГ:схг;п: дінкческзіх веществ на ішразютелиалмиа и ш^гра-чуралыше хсяг-норгичесьие структуры. Изолирований участие ішзчлоїї труйек длиной 15 ми очвдэли, от сод ршічого и взвешивала, на.концы шї-качіісй трубки накладывали лигатуру и производили ее перфузию растворами постоянном тчп^рятуру к определимого состава Діїїї кандон серии .экспериментов, после этого затягивали лигатуры и . взвешивали кишечньй мешочек. Следующий этап работы заключался в определения веса "ишечного мешочка пооле экспозиции в-инкубационной среде также различного состава для каждой серии опытов.' Бремя экспозиции составляло 120 кинут. Объем инкубационной скеси равнялся 30 мл. После снятия лигатур и освобождена, кишки от содержимого, производилось повторное взвешивание'кишечной трубки, в контрольных опытах для перфузии к'инкубирования служил раствор Ринг^а для рыб (Проссер Л.. Браг Ф.. 1967). В друг...: экспериментах применяли растворы атропина (0,1 иг/кг) и прозерина (ОД мг/кг). а также токсическое вещество сульфатный 'лигнин в 'концентрациях 2.5 и Ю.О мг/л, приготовленных на растворе Рішгера.
В работе представлено 25 серий опытов.
Весь экспериментальный матернол обработан с применением методов вариационной статистики на IBM PC XT/AT.