Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 12
1.1. Актуальность темы. Основные современные представления о холинергической регуляции миокарда 12
1.2. Задачи исследования 15
1.3. Научная новизна исследования 16
1.4. Научно-практическая значимость 17
1.5. Основные положения, выносимые на защиту 18
2. Обзор литературы 21
2.1. Парасимпатическая иннервация сердца 21
2.1.2. Внутрисердечное нервное сплетение 24
2.1.3. Структура вегетативных синапсов в сердечной ткани 30
2.2. Жизненный цикл АХ 33
2.2.1. Синтез АХ в нейронах 33
2.2.2. Синтез АХ в мышечных клетках 35
2.2.3. Квантовая секреция АХ 36
2.2.4. Распад АХ. Ацетилхолинэстераза 39
2.2.5. Обратный захват холина. Система захвата холина высокого сродства 41
2.3. Неквантовая секреция АХ 43
2.3.1. Открытие неквантовой секреции АХ 43
2.3.2. Механизм неквантового выделения АХ 44
2.3.3. Неквантовая секреция АХ в нейронах, иннервирующих гладкие мышцы дыхательных путей 46
2.3.4. Неквантовая секреция АХ в сенсорных нейронах позвоночных и беспозвоночных 47
2.3.5. Регуляция неквантовой секреции АХ 48
2.3.6. Гипотезы о физиологической роли феномена неквантовой секреции АХ 54
2.4. Реализация холинергических эффектов в сердце 55
2.4.1. Общая характеристика мускариновых рецепторов 56
2.4.2. Мускариновые рецепторы в сердце 58
2.4.3. М2-рецепторы в сердце 60
2.4.4. М3-рецепторы в сердце млекопитающих 65
2.5. Особенности холинергичекой стимуляции при возникновении патологических состояний в сердце 72
2.5.1. Ишемическое повреждение миокарда и М3-рецепторы 73
2.5.2. Патологическая гипертрофия сердца и М3-рецепторы 74
2.5.3. Аритмия и мускариновые рецепторы 75
2.5.4. Сердечная недостаточность и М3-рецепторы 2.6. Особенности холинергической регуляции миокарда у низших позвоночных 77
2.7. Развитие холинегической регуляции в ходе онтогенеза 82
3. Методика 86
3.1. Животные 87
3.1.1. Взрослые млекопитающие 87
3.1.2. Получение крысят и 19-дневных крысиных эмбрионов 87
3.1.3. Хроническая десимпатизация крыс 88
3.1.4. Рыбы и амфибии 88
3.2. Внутриклеточная регистрация электрической активности 89
3.2.1. Получение препаратов миокарда млекопитающих 89
3.2.2. Внутриклеточная регистрация ПД 91
3.2.3. Ход эксперимента 92
3.2.4. Обработка препаратов миокарда ботулиническим токсином 93
3.2.5. Обработка результатов 93
3.3. Метод пэтч-кламп 94
3.3.1. Выделение изолированных кардиомиоцитов крысы 94
3.3.2. Регистрация кальциевого тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах методом пэтч-кламп 95
3.3.3. Регистрация калиевых токов в изолированных кардиомиоцитах методом пэтч-кламп 96
3.3.4. Обработка результатов
3.4. Оценка динамики эндоцитоза и экзоцитоза в предсердных препаратах с помощью флуоресцентной метки FM1-43 97
3.5. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда
3.5.1. Использованные антитела 99
3.5.2. Протокол окраски
3.6. Определение общего количества мускариновых рецепторов с помощью специфических антител 100
3.7. Молекулярно-биологические исследования уровня экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
3.7.1. Выделение тотальной РНК из препаратов сердечной мышцы 101
3.7.2. Обработка ДНКазой I 102
3.7.3. Обратная транскрипция 103
3.7.4. Выделение геномной ДНК 104
3.7.5. Праймеры, использованные в работе 105
3.7.6. Полимеразная цепная реакция 106
3.8. Использованные в работе физиологически активные вещества 107
4. Результаты 109
4.1. Неквантовый способ секреции АХ в миокарде, выяснение его механизма и способов регуляции. 110
4.1.1. Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде млекопитающих 110
4.1.2. Свидетельства широкого распространения феномена неквантовой секреции АХ в миокарде среди позвоночных животных. 134
4.1.3. Выяснение механизма неквантовой секреции в миокарде на примере предсердного миокарда крысы 141
4.1.4. Регуляция неквантовой секреции АХ различными кардиотропными сигнальными соединениями 151
4.2. Исследование рецепторных механизмов холинергической регуляции сердца 163
4.2.1. Молекулярно-биологические доказательства наличия М3-рецепторов в миокарде млекопитающих 163
4.2.2. Электрофизиологические эффекты стимуляции М3-холинорецепторов в миокарде млекопитающих 169
4.2.3. Молекулярные механизмы электрофизиологических эффектов стимуляции М3-рецепторов 177
4.3. Изучение особенностей механизмов холинергической регуляции миокарда на ранних стадиях онтогенеза. 187
4.3.1. Особенности электрической активности предсердного и желудочкового миокарда крыс на ранних стадиях онтогенеза. 188
4.3.2. Доказательство наличия неквантовой секреции АХ в миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза. 192
4.3.3. Выявление уровня экспрессии генов М2 и М3-холинорецепторов в желудочковом и предсердном миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза. 196
4.3.4. Исследование электрофизиологических эффектов стимуляции М2 и М3-холинорецепторов в желудочковом и предсердном миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза. 198
5. Обсуждение результатов 203
5.1. Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде 203
5.2. Механизм неквантовой секреции АХ 206
5.3. Регуляция неквантовой секреции АХ в миокарде 207
5.4. Наличие функционально активных М3-холинорецепторов в миокарде крысы и мыши 209
5.5. Новый молекулярный механизм электрофизиологических эффектов стимуляции М3-рецепторов 210
5.6. Становление холинергической регуляции миокарда в процессе онтогенеза 212
5.7. Ограничения и возможные недостатки проведенного исследования 214
5.8. Перспективы дальнейших исследований 216
6. Выводы 219
7. Список литературы 220
8. Благодарности
- Научная новизна исследования
- Неквантовая секреция АХ в нейронах, иннервирующих гладкие мышцы дыхательных путей
- Получение крысят и 19-дневных крысиных эмбрионов
- Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде млекопитающих
Научная новизна исследования
Полученные данные существенно меняют устоявшиеся представления о механизмах холинергической регуляции миокарда, так как показывают принципиально новый способ выделения АХ в миокарде, а также новый механизм модуляции электрической активности, связанный с ингибированием кальциевого тока L-типа посредством М3-холинорецепторов. Проведенное нами исследование открывает возможность новых подходов к проблеме использования естественного кардиопротекторного действия холинергической иннервации сердца в терапевтических целях. В настоящее время предложены пути применения карбаматного ингибитора АХЭ пиридостигмина, отличающегося сравнительно мягким воздействием на организм и применяемым также в терапии болезни Альцгеймера, для коррекции хронических ишемических состояний [Castro et al, 2004; Zimerman et al, 2010]. Главной проблемой, возникающей на этом пути, является органная и тканевая неспецифичность используемых ингибиторов АХЭ. Тем не менее это направление не кажется нам бесперспективным, поскольку в одной из наших работ было показана принципиальная возможность создания тканеспецифичных ингибиторов АХЭ. Исследованное соединение воздействовало только на АХЭ скелетной мускулатуры, но совершенно не вызывало кардиотропных эффектов [Abramochkin et al., 2008]. Создание ингибитора АХЭ с противоположными свойствами, то есть действующего исключительно на АХЭ миокарда могло бы стать ключом к широкому применению кардиопротекторных свойств АХ в клинике.
Данные о физиологической роли М3-холинорецепторов в миокарде также представляют важную практическую ценность. Так, например, протеинкиназа С, которая активируется через фосфоинозитидный каскад, запускаемый М3-рецепторами, на данный момент является перспективной мишенью для разработки новых лекарственных препаратов от ишемической болезни сердца [Inagaki et al., 2006], гипертрофии, сердечной н едостаточности [Ferreira et al ., 2011] и других синдромов. То же можно сказать и в отношение самих рецепторов третьего типа, однако разработке этого направления на данный момент мешает отсутствие селективных агонистов М3-рецепторов с преимущественным действием на сердце.
1. АХ способен выделяться неквантовым путем, то есть посредством работы мембранных переносчиков, без экзоцитоза синаптических везикул, из окончаний интрамуральных парасимпатических нейронов как в сердцах теплокровных, так и в сердцах низших позвоночных (рыб и амфибий). Данное заключение было получено в результате анализа эффектов ингибиторов АХЭ на различные типы миокарда млекопитающих, а также на предсердный миокард трески, предсердный и желудочковый миокард лягушки. Ингибиторы АХЭ вызывали выраженные в большей или меньшей степени электрофизиологические эффекты, характерные для АХ, а именно уменьшение длительности ПД, замедление ритма пейсмекера, а в некоторых видах миокарда – уменьшение амплитуды ПД. Все эффекты снимались атропином. Следовательно, они обусловлены действием АХ, накапливающегося в миокарде в условиях отсутствия холинэстеразной активности и воздействующего на мускариновые рецепторы. Использованные нами способы подавления квантовой секреции АХ, а именно блокада ганглионарной синаптической передачи бромидом гексаметония, подавление импульсной активности постганглионарных нейронов с помощью тетродотоксина и, наконец, устранение любых видов экзоцитоза, в том числе и экзоцитоза синаптических везикул с АХ, с помощью ботулинического токсина, не вызвали значимого снижения выраженности эффектов ингибиторов АХЭ. Следовательно, накопление АХ в миокарде не связано с экзоцитозом АХ-содержащих везикул и происходит за счет неквантовой секреции медиатора из нервных окончаний. Поскольку эффекты ингибиторов АХЭ подавляются блокатором транспортеров системы обратного захвата холина высокого сродства (СЗХВС) гемихолинием III, но никак не изменяются под действием везамикола, ингибитора другого потенциального посредника неквантовой секреции, везикулярного транспортера АХ (ВТАХ), можно заключить, что в миокарде неквантовая секреция реализуется именно за счет СЗХВС.
2. Неквантовая секреция АХ в миокарде является регулируемым процессом, по крайней мере, она может подавляться норадреналином и оксидом азота. Норадреналин (10-6М) в присутствие -адреноблокатора пропранолола снижает выраженность эффектов ингибиторов АХЭ, по которой мы судим об интенсивности неквантовой секреции АХ. Доноры оксида азота, важнейший регулятор неквантовой секреции АХ в нервно-мышечном синапсе, также подавляют эффекты ингибиторов АХЭ.
3. М3-рецепторы экспрессируются в миокарде крысы и мыши, где участвуют в опосредовании холинергических изменений электрической активности миокарда. Анализ образцов различных типов миокарда крысы и мыши методом РВ-ПЦР показывает присутствие мРНК как М2, так и М3-холинорецепторов. Наличие белковых молекул М2 и М3-рецепторов в сердце крысы и мыши подтверждено иммуногистохимической окраской препаратов миокарда мыши и анализом образцов миокарда крысы методом вестерн-блоттинга с использованием селективных антител к М2 и М3-рецепторам. В электрофизиологических экспериментах на изолированных препаратах предсердного и желудочкового миокарда крысы, а также синоатриального узла мыши, при стимуляции М3-рецепторов мускариновым агонистом пилокарпином в присутствие высокоселективного блокатора М2-рецепторов метоктрамина наблюдалось уменьшение длительности ПД в рабочем миокарде, а также замедление автоматической активности в синоатриальном узле.
4. Эффекты активации М3-рецепторов реализуются главным образом через активацию фосфоинозитольного каскада внутриклеточной сигнализации и протеинкиназы С, приводящую в конечном счете к ингибированию кальциевого тока L-типа (ICaL). В экспериментах на изолированных препаратах предсердного миокарда крысы ингибиторы фосфолипазы С, U-73122 и неомицин, а также хелеретрин, ингибитор активируемой диацилглицеролом протеинкиназы С, более чем в 2 раза снижали выраженность эффектов стимуляции М3-рецепторов. Блокатор рецепторов инозитолтрифосфата, второго вторичного посредника, участвующего в реализации фосфоинозитольного сигнального пути, не влиял на выраженность электрофизиологических эффектов М3-стимуляции. Снижение ICaL под действием пилокарпина на фоне блокады М2-рецепторов метоктрамином было показано в экспериментах на изолированных предсердных миоцитах крысы. При этом не было выявлено значимого влияния стимуляции М3-рецепторов ни на один из известных в миокарде крысы калиевых токов, IKir, Ito и IKur.
5. В ходе постнатального развития крысы многократно снижается уровень экспрессии гена М3-холинорецептора в желудочковом миокарде. Методом РВ-ПЦР было показано, что относительное количество мРНК М3-рецепторов в желудочках 19-дневных эмбрионов и новорожденных крысят в несколько раз выше, чем у трехнедельных крысят и взрослых крыс. В отличие от взрослых животных, М3 20 рецепторы вносят решающий вклад в холинергическую регуляцию желудочкового миокарда у новорожденных крысят и 19-дневных эмбрионов, поскольку действие избирательной стимуляции М3-рецепторов на электрическую активность в препаратах желудочкового миокарда крыс этих возрастов выражено многократно сильнее, чем у взрослых крыс. При этом, в сердцах новорожденных и 19-дневных эмбрионов идет процесс неквантовой секреции АХ, более того в последнем случае весь АХ, воздействующий на миокард через мускариновые рецепторы, имеет неквантовое происхождение. Таким образом, как неквантовая секреция АХ в сердце, так и новая мишень АХ, М3-холинорецепторы, вносят наиболее существенный вклад в реализацию холинергической регуляции миокарда крысы на ранних стадиях онтогенеза.
Неквантовая секреция АХ в нейронах, иннервирующих гладкие мышцы дыхательных путей
Подробные анатомические исследования, проведенные на других видах животных (морская свинка [Batulevicius et al., 2005], свинья [Batulevicius et al., 2008], овца [Saburkina et al., 2010], собака [Pauza et al., 2002], человек [Pauza et al., 2000] et al.), продемонстрировали сходное расположение основных элементов интракардиального нервного сплетения в сердцах различных видов млекопитающих.
Среди клеток, принадлежащих ВНСп, выделяют два принципиально разных типа: SIF (small intensely fluorescent) клетки и собственно внутрисердечные нейроны. Работа обоих типов клеток регулируется разнообразными нейротрансмиттерами и нейромодуляторами [Parsons, 2004].
При иммуногистохимическом окрашивании на ХАТ большинство сердечных нейронов оказались иммунореактивными, как и SIF-клетки, что позволяет отнести нейроны к постганглионарам ПНС. Такие исследования были проведены на различных видах животных, включая человека [Richardson et al., 2003; Rysevaite et al., 2011; Petraitiene et al., 2014]. Окрашивание на высокоаффинный транспортер холина , также являющийся высокоспецифичным маркером холинергических нейронов, дало сходные результаты. При двойном окрашивании на ХАТ и траспортер холина тела большинства сердечных нейронов были окрашены антителами к ХАТ, а вокруг них были обнаружены варикозы, иммунореактивные к транспортеру. Также, в меньшем количестве обнаружены ХАТ-иммунореактивные нейроны, не окрашенные антителами к транспортеру холина [Hoover et al., 2009].
Сравнительно недавние исследование показали, что большая часть парасимпатических постганглионаров ВНСп человека иммунореактивны также к нейрональной NO-синтазе. Распределение nNOS в клетках ВНСп говорит о том, что NO является котрансмиттером АХ в терминалях этих нейронов [Hoover et al., 2009]. В более ранних работах было показано, что в подобных структурах NO может действовать аутокринно, приводя к усилению выброса основного нейротрансмиттера, АХ [Choate et al., 2001; Conlon, Kidd, 1999]. С данной точкой зрения согласны, однако не все авторы: в некоторых исследованиях показано, что только около 40% нейронов ВНСп окрашиваются антителами к nNOS [Шуклин, Швалев, 2006]. Данное расхождение может быть связано с различиями в локализации интракардиальных ганглиев, попавших в исследование. Аналогичные работы, проведенные на других видах животных, продемонстрировали еще меньший процент nNOS-иммунореактивных нейронов (от общего числа нейронов ВНСп): 4% у крысы [Klimaschewski et al., 1992], 5% у морской свинки [Mawe et al., 1996], и 16% у мыши [Choate et al., 2001]. Некоторые нейроны ВНСп обнаруживают иммунореактивность к ключевым ферментам синтеза и хранения катехоламинов, тирозингидроксилазе (TH) и везикулярному транспортеру моноаминов (vesicular monoamine transporter 2 - VMAT2). У человека и других приматов процент норадренергических нейронов в ВНСп может достигать 50%; таким образом, многие нейроны имеют двойной холин-норадренергический фенотип (двойственный фенотип нейронов ВНСп был обнаружен и у других животных - морских свинок, мышей, крыс) [Weihe et al., 2005; Hoover et al., 2009; Bauk, Gabella, 1990; Mawe et al., 1996]. Эти нейроны также оказались иммунореактивны к ферментам метаболизма катехоламинов: декарбоксилазе ароматических аминокислот (AADC) и дофамин--гидроксилазе (DH), что позволяет им реализовать полный цикл жизни катехоламинов. Помимо этого, иммунореактивность к ТН была обнаружена у SIF-клеток мыши и морской свинки; они располагаются кластерами по 3-8 клеток, в ганглиях или отдельно на стенке сердца. Функциональная роль этих клеток остается неясной [Rysevaite et al., 2011].
Наконец, некоторые нейроны ВНСп окрашиваются антителами к различным сигнальным пептидам. В человеческом сердце были обнаружены нейроны, окруженные варикозами нервных терминалей, иммунореактивными к вазоактивному интестинальному пептиду (vasoactive intestinal polypeptide - VIP), веществу Р (substance P - SP) и пептиду, родственному гену кальцитонина (сalcitonin gene-related peptide - CGRP). Ни один из этих пептидов не колокализован с транспортером холина, что свидетельствует о том, что эти нервные окончания являются не холинергическими, а пептидергическими [Hoover et al., 2009]. Многочисленные аналогичные исследования, проведенные на животных, подтвердили наличие пептидергических входов в ВНСп: обнаружена иммунореактивность к таким сигнальным пептидам, как VIP, SP, CGRP, соматостатин, нейропептид Y (NPY), динорфин, гипофизарный пептид, активирующий аденилатциклазу (pituitary adeylatcyclase activating peptide - PACAP) и т.д. [Horackova et al., 1999; Steele et al., 1994; Richardson et al., 2003; Rysevaite et al., 2011]. Некоторые авторы предполагают, что такие пептидергические варикозы могут принадлежать терминалям ноцицептивных нейронов, лежащих за пределами сердца; другие не исключают возможности существования пептидергических нейронов в пределах ВНСп [Hoover et al., 2009] Такое разнообразие пептидергической регуляции в ВНСп дает возможность тонко модулировать работу ганглиев сплетения и сердечную функцию: так, NPY снижает выброс АХ из холинергических терминалей [Serone, Angus, 1999], а VIP сам по себе воздействует на миокард, оказывая положительный хроно- и инотропный эффект [Henning, Sawmiller, 2001]. Соотношение сигнальных пептидов в терминалях может значительно изменяться при развитии различных патологий, что открывает широкие перспективы для создания новых стратегий лечения различных сердечных патологий [Dvorakova et al., 2014].
Итак, в ВНСп обнаружено несколько возможных нейрохимических фенотипов нейронов: холинергический, NO-ергический, норадренергический и пептидергический; причем часть нейронов сплетения может обладать двойным фенотипом. Все это свидетельствует о том, что ВНСп представляет собой сложную структуру с тонко регулируемыми многофункциональными элементами.
Получение крысят и 19-дневных крысиных эмбрионов
В разделе 2.2 мы вкратце рассмотрели основные стадии жизненного цикла АХ, за исключением воздействия медиатора на мишень. Данный этап жизненного цикла устроен принципиально по-разному в различных типах тканей, обладающих холинергической иннервацией. Поэтому в данном разделе будут рассмотрены исключительно механизмы воздействия АХ на миокард. Хорошо известно, что в отличие, к примеру, от волокон скелетной мускулатуры, кардиомиоциты не несут никотиновых рецепторов к АХ. Холинергические воздействия на миокард реализуются посредством метаботропных мускариновых холинорецепторов различных типов. 2.4.1. Общая характеристика мускариновых рецепторов
Мускариновые рецепторы к ацетилхолину (М-рецепторы) являются членами обширного семейства рецепторов, ассоциированных с G-белками (G-protein-coupled receptors - GPCRs). Все рецепторы данного семейства являются метаботропными. GPCRs состоят из одной полипептидной цепи; их структура включает в себя 7 гидрофобных трансмембранных доменов, объединенных тремя внеклеточными и тремя внутриклеточными гидрофильными доменами [Baldwin, 1994]. Высокая степень гомологии прослеживается как между мускариновыми рецепторами и другими белками семейства GPCRs [Hulme et al., 1990], так и между различными подтипами М-рецепторов у разных видов животных: например, мускариновые рецепторы крысы на 90% гомологичны М-рецепторам человека [Hall et al., 1993; Myslivecek et al., 2008].
Известные на данный момент мускариновые рецепторы подразделяются на 5 типа (М1-М5). Полипептидная цепь этих гликопротеинов включает в себя 460-590 аминокислотных остатков [Hulme et al.,1990]. Ее С-конец, расположенный во внутриклеточной среде, способен окрашиваться антителами только после искусственного увеличения проницаемости мембран клеток [Lu et al., 1997]. С внешней стороны клеточной мембраны расположен N-конец цепи, несущий на себе несколько сайтов гликозилирования. Экспериментально было показано, однако, что гликозилирование М-рецепторов не влияет на их экспонирование на мембране, связывание агонистов и устойчивость к деградации. [van Koppen, Nathanson, 1990].
Взаимодействие М-рецепторов с G-белками в значительной степени опосредуется 2-ой (i2) и 3-ей (i3) внутриклеточными петлями рецептора. В передаче сигнала важную роль играет расположенная на петле i2 высококонсервативная последовательность аспартат-аргинин-тирозин (Asp-Argyr), а именно Arg123, как это было продемонстрировано в работах с использованием мутантных М-рецепторов [Zhu et al., 1994; Wess et al., 1997; Lu et al., 1997; Jones et al., 1995]. Leu173 опосредует связь рецептора с –субъединицей G-белка [Hu et al., 2010]. Эксперименты с химерными М-рецепторами показали, что тип мускаринового рецептора и его связь с тем или иным G-белком определяется структурой петли i3. Так, М2-рецепторы с i3-петлей, характерной для М3-рецептора (m2/m3-химеры), при активации демонстрировали М3-эффекты, и наоборот. В ходе дальнейших исследований выяснилось, что критичными для проявления специфических свойств петли i3 являются первые 16-21 аминокислот с NH2-конца и 19 аминокислот с COOH-конца [Wess et al., 1990; Kubo et al., 1988]. Остаток Asp105, расположенный на N-конце третьего трансмембранного домена, по всей видимости, опосредует взаимодействие с молекулой лиганда, а именно с ее положительно заряженной головкой [Curtis et al., 1989; Spalding et al., 1994].
Изменения конформации М-рецептора при связывании АХ приводят к активации связанного с ним G-белка, являющегося -гетеротримером. G-субъединица неактивного G-белка связана с ГДФ (гуанозиндифосфат). Активация G-белка сопровождается заменой ГДФ на ГТФ и диссоциацией белка на комплексы G-ГТФ и G, способные в свою очередь независимо друг от друга запускать различные каскады внутриклеточной сигнализации. Реассоциация комплекса индуцируется гидролизом ГТФ до ГДФ G-субъединицей – соответственно, скорость этого процесса определяет продолжительность сигнала [Cabrera-Vera et al., 2003].
Подтипы мускариновых рецепторов объединяют в два более обширных функциональных класса. М-рецепторы типов 1, 3 и 5 относят к классу "нечетных". Их функционирование связано с нечувствительным к коклюшному токсину (PTX) Gq/11-белком. Сигнальный каскад, запускаемый активным Gq/11-белком, активирует фосфолипазу С (PLC) и, вероятно, модулирует определенные ионные токи. С "четными" рецепторами (М2 и М4) сопряжен чувствительный к PTX белок Gi/G0, активация которого приводит к угнетению работы аденилатациклазы [Harvey, 2012].
Современная фармакология позволяет селективно воздействовать на определенные подтипы М-рецепторов с помощью ортостерических антагонистов и агонистов. Так, селективными блокаторами для М1-рецепторов являются пирензепин и выделенные из яда зеленой мамбы белковые токсины МТ1 и МТ7. Трипитрамин, AF-DX 116, AF-DX 384 и метоктрамин селективно блокируют М-рецепторы типа 2. Гексагидро-силадифенидол гидрохлорид и 4-дифенилацетокси-N-метилпиперидина йодметилат (4-DAMP) являются избирательными М3-блокаторами. Селективными антагонистами М4-рецепторов являются токсины МТ3 и МТ1, тропикамид, химбацин и PD102807(28) [Caulfield, Birdsall, 1998; Wang et al., 2004; Myslivecek et al., 2008]. Сравнительно недавно удалось идентифицировать селективный блокатор М5-рецепторов: VU0488130 [Gentry et al., 2014]. Для большинства блокаторов, однако, специфичность действия может быть достигнута лишь в узком диапазоне концентраций. Исключением являются белковые токсины, выделенные из яда черной и зеленой мамбы и демонстрирующие большую степень селективности, чем перечисленные выше антагонисты [Jerusalinsky et al., 2000]. Для некоторых типов М-рецепторов известны достаточно избирательные агонисты. TBPB (1-(1 -2-метилбензил)-1,4 -бипиперидин-4-ил)-1H бензо[d]имидазол-2(3H)-один) [Jones et al., 2008], VU0357017 и VU0364572 селективно активируют М1-рецепторы [Digby et al., 2012]. Производные N-замещенного 7-азаиндолина демонстрируют избирательность к М1- и М4-рецепторам [Suwa et al., 2014; Takai et al., 2014]. Пилокарпин [Wang et al., 1999], холин и тетраметиламмоний [Shi et al., 1999a] являются слабыми селективными агонистами М3-рецепторов. На данный момент ведутся активные поиски аллостерических и битопических агонистов и антагонистов мускариновых рецепторов. Данные фармакологические агенты позволят серьезно продвинуться вперед в области коррекции различных патологий [Schmitz et al., 2014; Kruse et al., 2014].
Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде млекопитающих
Процесс эндоцитоза в интрамуральных сердечных нервах активировался посредством их стимуляции в присутствии FM1-43 в соответствии с методикой, впервые описанной в работе Vincenzi и West [Vincenzi, West, 1963]. Параметры стимуляции имели следующие значения: частота стимуляции - 100 Гц, продолжительность стимула - 100 мсек, амплитуда 15 В, длительность пачки стимулов - 15 с, интервал между пачками стимулов - 45 с. Продолжительность стимуляции, 20 мин, была определена эмпирически, по результатам нескольких пробных опытов. Соблюдение всех означенных условий обеспечивало успешную загрузку метки в нейроны.
После выполнения протокола загрузки нервных окончаний флуоресцентной меткой препарат перфузировали раствором Тироде с добавлением циклодекстрина ADVASEP-7 (2x10 М, Sigma, St Louis, МО, США), связывающего и удаляющего FM1-43 из внеклеточной среды, что приводило к снижению фонового уровня флуоресценции [Cochilla et al., 1999]. В экспериментах, включающих выгрузку метки из интрамуральных нервов, сперва загружали нервные окончания красителем по описанной схеме, а затем, после удаления фонового красителя стимулировали нервы по такому же протоколу в течение 50 минут в отсутствие красителя во внеклеточной среде.
Нервные окончания с загруженным в них FM1-43 визуализировали на флуоресцентном микроскопе Olympus BX51 с 40 водно-иммерсионным объективом (Olympus, Tokyo, Япония) и пропускающим фильтром 510 нм (Chroma, Rockingham, VT, США). Источником возбуждающего света (488 нм) был монохроматор Polychrome V (TILL Photonics, Munich, Германия). Изображение было получено посредством камеры AxioCam MRm (Zeiss, Jena, Германия). Полученные данные флуоресценции анализировали в программе ImageJ 1.42. Достоверность различия скорости разгрузки в препаратах разных групп оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни.
Метод иммуногистохимического окрашивания заключается в обработке фиксированного препарата так называемыми первичными антителами, специфически связывающимися с исследуемым белком, а затем - вторичными, имеющими аффинность к первичным и конъюгированными с молекулами флуорохрома. Флуорохром флуоресцирует при возбуждении светом определенной длины волны, поэтому визуализация окрашенного препарата требует микроскопа с соответствующим источником света. Наилучшим образом этой цели соответствует конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
В данной работе иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда проводилось по протоколу, использованному ранее для изучения препаратов правого предсердия мыши [Liu et al., 2007].
Для иммуногистохимического окрашивания предсердного и желудочкового миокарда мыши в работе были использованы следующие первичные поликлональные антитела (IgGs): anti-Cx43 – антитела к коннексину-43 (Cx43), выработанные в организме кролика против антигена мыши (rabbit, cat. no. sc-9059, разведение 1:200, Santa Cruz Biotechnologies, США), аnti-M3 – козьи антитела, выработанные против М3-холинорецепторов мыши (goat, cat. no. sc-31486, в разведении 1:100, Santa Cruz Biotechnologies, США), аnti-M2 – козьи антитела, выработанные против М2-холинорецепторов мыши (goat, cat. no. sc-31483, разведение 1:100, Santa Cruz Biotechnologies, США). Окраску на коннексин Сх43 проводили с целью определения местоположения центральной части САУ мыши, лишенной данного белка.
Локализацию первичных IgGs обнаруживали после окрашивания вторичными IgGs, конъюгированными с флуоресцентной меткой. Для визуализации первичных антител к коннексину Сх43 были использованы вторичные антитела, выработанные в организме осла против антигена кролика, связанные с флуорохромом Alexa Fluro 647 (donkey anti-rabbit Alexa 647, cat. no. A31573, в разведении 1:100, Invitrogen, США). Первичные антителак М2- и М3-рецепторам выявляли с помощью ослиных антител к козьим IgG, связанных с флуорохромом Alexa Fluro 488 (donkey anti-goat Alexa 488, cat. no. A11055, в разведении 1:100, Invitrogen, США).
Препараты миокарда мыши были изготовлены согласно описанной в разделе 3.1 методике, после чего их фиксировали в параформальдегиде (3%) на протяжении 12 часов при температуре 4С и отмывали фосфатным буфером (PBS, 0,01 М) 3 раза в течение часа. Улучшение проницаемости мембран препаратов достигалось инкубацией в PBS с добавлением 1% Triton X-100 в течение 12 часов при 4С, после чего следовало отмывание препарата в PBS. Во избежание неспецифического связывания первичных антител препарат инкубировали 1 час при комнатной температуре в растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, 1%), содержащем 1% Triton X-100.
После этого проводили окрашивание препаратов первичными антителами (раздел 3.8.1), разведенными в 1% BSA на PBS при 4С в течение 24 часов. Окрашивание включало в себя одновременную инкубацию с двумя видами антител: к коннексину Сх43 и М2- (n=8) или М3-рецепторам (n=14). После отмывания в PBS (3 раза в течение часа) препараты инкубировали со вторичными антителами на протяжении 2 часов при комнатной температуре. Затем следовала трехкратная отмывка в PBS.
За контроль принимали препараты миокарда, инкубированные только с вторичными антителами либо только с первичными антителами, что не вызывало существенного их окрашивания. На основании этого можно утверждать, что полученные изображения являются результатом визуализации только меченых антител, связавшихся с белком.
Препараты помещали под покровное стекло; дальнейшие процедуры для предотвращения выгорания флуорохромов проводили без доступа света. Исследование окрашенных фрагментов миокарда проводили с использованием лазерного конфокального сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 META, оснащенного фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). Для работы использовали 10х воздушный объектив и маслоиммерсионный с 63х увеличением. Фотосъемку препаратов производили при помощи камеры LSM 510 Meta, анализ полученных изображений осуществлялась в ImageJ 1.45 (NIH, США). При обработке фотографий флуоресценция вторичных антител, соответствующих локализации Сх43, отмечалась красным псевдоцветом. Флуоресценция, отмечавшая М2- или М3-холинорецепторы, обозначалась зеленым псевдоцветом. Также производили фотосъемку препаратов в видимом свете.