Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Концепция образования и развития сосудистой сети 7
1.1 Васкулогенез. 8
Ангиогенез. 9 1.2.1. Гипоксия - механизм запуска ангиогенеза. 9 1.2.2 Фазы ангиогенеза. 10 1.2.3. Ангиогенные факторы 12
Артериогенез 15
Сосудистый эндотелиальный фактор роста [VEGF] - основной регулятор ангиогенеза 17
Урокиназа в ремоделировании сосудов и ангиогенезе. 19
Ангиогенез, внеклеточный протеолиз и урокиназа. 19
Структура урокиназы 20
Рецептор урокиназы 21
Ингибиторы активаторов плазминогена 22
Функции урокиназы 22
Урокиназы в ремоделировании сосудов 25
Урокиназы в ангиогенезе 26
4. Терапевтический ангиогенез 33
4.1. Генная терапия для терапевтического ангиогенеза 34
Методы генетической трансфекции в генной терапии 34
Основные векторные системы 35
5. Способы доставки генетического матириала и рекомбинантных
ангиогенных факторов в миокард и скелетные мышцы. 39
б.Доклинические исследования по терапевтическому ангиогенезу 46
7. Клинические испытания по терапевтическому ангиогенезу 48
Заключение 55
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы 57
1. Культура клеток 57
Выделение эндотелиальных клеток 57
Культивирование клеток 57
Культивирование эндотелиальных клеток в условиях гипоксии 57
Оценка формирования тубулярных структур эндотелиальными клетками 58
Определение пролиферации эндотелиальных клеток 58 2.Модели сердечно-сосудистой патологии у животных и морфологический анализ 59
Модель инфаркта миокарда у крысы и внутримиокардиальное введение растворов плазмид 59
Модели ишемии задней конечности крысы и мыши и внутримышечное введение растворов плазмид 60 2.3. Подготовка тканей сердца и мышц 61 2.3.1. Выделение и препаровка сердца. 61 2.3.2 Подготовка мышечной ткани 62
2.4 Иммуногистохимическое выявление кровеносных сосудов в образцах
миокарда и скелетных мышц 62
2.5 Подсчёт сосудов 63
2.6 Оценка инфильтрации периинфарктной зоны макрофагами. 63
2.7 Определение размера инфаркта 63
Анализ востановлсния кровотока в ишемизированной конечности мыши 64
Оценка развития отека мышц задней конечности после введения плазмид 65 2.Биохимические и молекулярно-биологические методы анализа
3.1 Выделение мембран эндотелиальных клеток 65
3.2 Определение активности аденилатциклазы в препаратах мембран
эндотелиальных клеток 65
Конструирование плазмид 66
Трансфскция клеток 66
Иммуноферментный анализ содержания урокиназы и VEGF в клетках и среде культивирования 67
Оценка уровня экспрессии бета-галактозидазы 68
Выделение РНК из культивируемых клеток и образцов тканей 70
Полуколичественный ПЦР 70
3.9 ПЦР в реальном времени 71
3.10 Определение концентрации белка в пробах 72
3.11 Электрофорез белков и иммуноблоттинг 72
4. Статистическая обработка данных 73
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Влияние гипоксии на экспрессию и секрецию урокиназы
эндотелиальными клетками 73
1.1. Влияние гипоксии на содержание урокиназы в среде культивирования
эндотелиальных клеток. 73
1.2. Влияние гипоксии на содержание белка и мРНК урокиназы в
эндотелиальных клетках. 74
Экспрессия рецептора урокиназы в условиях гипоксии 75
Влияние гипоксии на активность аденилатциклазы в эндотелиальных клетках 76
2. Динамика экспрессии эндогенной урокиназы в ишемизированном
миокарде крысы 77
3. Получение плазмидных конструкций, содержащих кДНК урокиназы и
фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и проверка их
функциональной активности 79
Конструирование плазмид 79
Проверка функциональной активности плазмид 82
Активность бета-галактозидазы в транфицированных клетках 83
Продукция белков фактора роста эндотелия сосудов и урокиназы в
транфицированных клетках 83
3.3.3. Определение экспрессии VEGF-165 по его биологической активности
4. Оценка эффективности трансфекции миокарда и скелетных
мышц при прямом введении плазмид
4.1. Эффективность трансфекции скелетных мышц и миокарда при
использовании внутримышечного/внутримиокардиального
введения плазмидных конструкций 86
4.2 Динамика экспрессии трансгенов - урокиназы и VEGF человека -
в сердце крысы после введения соответствующих плазмид 88
5. Влияние трансгенной экспрессии урокиназы на ангио-
артериогенез в периинфарктной зоне сердца крысы.
5.1. Количество сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с
генами урокиназы и VEGF 89
Размера инфаркта при введении генов uPA и VEGF в перииифарктную зону сердца крысы 91
Инфильтрация периинфарктной зоны моноцитами/макрофагами после ведения плазмид с генами урокиназы и VEGF 92 6. Влияние трансгенной экспрессии урокиназы на ангиогенез в
ишемизированной задней конечности крысы и мыши
6.1 Количество капилляров в ишемизированных мышцах задней
конечности крысы после введения плазмид с генами урокиназы и
VEGF 94
6.2. Восстановление кровотока и ангиогенез в ишемизированной
конечности мыши после трансгенной экспрессии урокиназы и
VEGF 95
6.3.Развитие отека мышц при введении плазмид с генами урокиназы и
VEGF. 98
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112
ВЫВОДЫ 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
Список сокращений
БСА бычий сывороточный альбумин
ИФА иммуноферментный анализ
ММП матриксные металло-протеазы
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭК предшественники эндотелиальных клеток
ФСБ фосфатно-солевой буфер
bFGF основной фактор роста фибробластов
EGF эпидермальный фактор роста
GM-SCF колоние-стимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов
HGF фактор роста гепатоцитов
HIF активируемый гипоксией фактор
IGF-1 инсулино-подобный фактор роста
IL-6 интерлейкин-6
МСР-1 хемотаксический фактор моноцитов
PDGF высвобождаемый тромбоцитами ростовой фактор
PIGF плацентарный ростовой фактор
VEGF фактор роста эндотелиальных клеток
VEGFR рецептор фактора роста эндотелиальных клеток
TGFP трансформирующий ростовой фактор-Р
иРА урокиназа
uPAR рецептор урокиназы
aFGF кислотный фактор роста фибробластов
Ang-І ангиопоэтин-1
Eph эфрины
ГСК гематопоэтических стволовых клеток
ГМК гладкомышечные клетки
ЭК - эндотелиальные клетки
кДНК- копийная дезоксирибонуклеиновая кислота
CD34- рецептор к L-селектину
АС 133 (CD 133) - антиген, экспрессирующийся на гематопоэтических клетках и
клетках-предшественниках
SDF-1- Stromal cell-derived factor
ICAM, -молекула межклеточной адгезии
TNF-cc, - фактор некроза опухоли альфа
мРНК-
PEC AM-1
VCAM
Smad5
PF-4
TIMPs-
PAI-1 (ПАИ-1)
P-Gal,
пео-ген
ECGF
матричная рибонуклеиновая кислота последовательность Von Hippel Lindau protein
кадгерин
молекула адгезии эндотелиальных клеток
молекула сосудистой адгезии
инсулиноподобный фактор роста
фактор роста фибробластов
Mothers against decapentaplegic homolog 5
тромбоспондин оксид азота фактор тромбоцитов-4 тканевой ингибитор металлопротеиназ ингибитор активатора плазминогена галактазидаза бетта ген устойчивости к антибиотику неомицину ишемическая болезнь сердца вирус саркомы Рауса сердечная недостаточность тканевой ингибитор матриксных металопротеипаз моноцитарный хемоатрактант пептид левый желудочек эхокардиография фактор роста эндотелиальных клеток
Введение к работе
Ишемические заболевания сердца и нижних конечностей, возникающие вследствие стенозирующего поражения сосудов, входят в ряд наиболее распространенных причин инвалидизации и смертности населения развитых стран. Несмотря на внедрение эффективных методов медикаментозного лечения, хирургической и эндоваскулярпои реваскуляризации, остается значительная часть больных, неподходящих для лечения этими методами или у которых с помощью этих методов удается лишь частично восстановить кровоснабжения тканей.
Раскрытие механизмов, регулирующих рост и ремоделирование сосудов, позволило разработать новую тактику лечения больных, основанную на введении в ишемизированные ткани ангиогенных факторов роста в виде рекомбинантных белков или генетических конструкций для стимуляции прорастания сосудов и улучшения их кровоснабжения и функции. Позже с этой целью стали использовать стволовые и прогениторные клетки. Эта тактика получила название терапевтический ангиогенез [Hockel М , Arras М., 1998, Yia-Herttuala S.,2000, Asahara Т,2002].
Для стимуляции ангиогенеза с помощью генной терапии используются гены ростовых факторов, которые в подавляющем большинстве являются секретируемыми белками. Большое число экспериментальных данных свидетельствует о том, что даже непродолжительная трансгенная гиперэкспрессия таких факторов роста в ограниченном числе клеток ткани приводит к возрастанию их продукции, достаточному для стимуляции роста сосудов [Takeshita S et.al.l994;Lewis B.S., 1997; Schwarz Е. Yia-Herttuala S.,2000 ].
В исследованиях на животных и в неконтролируемых клинических испытаниях по введению в ишемизированные ткани факторов роста или их генов были получены очень обнадеживающие результаты позволяющие надеяться, что ишемию миокарда и нижних конечностей таким способом можно лечить [Isner J. ; Losordo D.et.al.1998; Yia-Herttuala S.,2000]. Однако в большинстве недавно завершенных плацебо контролируемых двойных слепых испытаниях не было получено бесспорных доказательств эффективности лечения ишемии с помощью рекомбинантных белков или генов факторов роста [Yia-Herttuala S. ; Grines С ; Kastrup J. ]. Возможными причинами неудачи считаются использование одного фактора для стимуляции такого сложного и многоступенчатого процесса как ангиогенез, кратковременное действие ангиогенного фактора, неадекватные дозы и способы введения.
В связи с этим особую актуальность приобретает поиск оптимальных сочетаний ангиогенных факторов и новых факторов с полифупкционалыюй активностью.
Запуск образования новых сосудов происходит в тканях при увеличении экспрессии факторов роста, прежде всего VEGF, стимулирующего пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, увеличивающего сосудистую проницаемость. Экспрессия этого фактора и рецепторов к нему, а также ряда других ангиогенных факторов регулируется на уровне транскрипции в условиях гипоксии [Cormier-Regard.S.1998, Feldser D 1999, Tazuke SI, 1998, Semenza GL 2000, M Leel 2003]. Однако, одного только увеличения экспрессии факторов роста, недостаточно ни для запуска ангиогенеза, ни для ремоделирования сосудов в ходе адаптивного артериогенеза. Многие факторы роста связываются с белками межклеточного матрикса, что снижает концентрацию свободного белка, способного связаться с рецепторами на клеточной поверхности, а некоторые из факторов секретируются клетками в неактивном состоянии и затем подвергаются протеолитической активации [Creemers Е 2000, Ducharme А. 2000, Plouet J. 1997]. Помимо этого, для процесса неоваскуляризации необходимо разрушение связей между эндотелиальными клетками, базальной мембраны и внеклеточного матрикса, чтобы освободить клетки и пространство для их миграции и пролиферации, экстравазации моноцитов, обеспечивающих рост сосудов [Carmeliet Р. , Rakesh К Jain. 2003].
Ключевым регулятором внеклеточного протеолиза, запускающим каскад протеолитических реакций на поверхности клетки, обеспечивающим образование и рост сосудов, является урокиназный активатор плазминогена или урокиназа (иРА). Связываясь со специфическим рецептором на клеточной мембране, урокиназа активирует плазмин в строго определенных участках поверхности клетки, который в свою очередь активирует матриксные металлопротеазы, разрушающие основные белки внеклеточного матрикса, обеспечивая пространство для движения клетки [Blasi F, 1999; Bobik A.,Tkachuk V., 2003, Jianqiang Yu., 2004]. Помимо этого протеазы активируют и высвобождают из матрикса большинство ангиогенных факторов, необходимых для пролиферации, миграции и инвазии клеток [Jianqiang Yu., 2004, Naldini L. ; Plouet J. 1997, Luttun A, 2000]. И, наконец, урокиназа, взаимодействуя со своим рецептором и другими белками на поверхности клетки, модулирует внутриклеточную сигнализацию, обеспечивающую направленное движение клетки [Dumler I. ; Степанова
B.B., Ткачук В.А.,2002]. Урокиназа стимулирует развитие стенозов артерий после экспериментальной ангиопластики за счет стимуляции пролиферации и миграции гладкомышечных клеток медии и клеток неоинтимы, привлечения моноцитов/макрофагов в сосудистую стенку[Р1екЬапоуа О. ; Parfyonova . 2004]. Большинство из этих процессов ответственны и за развитие адаптивного артериогенеза при ишемии тканей. Прямые доказательства важной роли урокиназы в ангиогенезе получены в работах на трансгенных мышах, нокаутированных по гену урокиназы. У них подавлен артериогенез при ишемии задних конечностей [Deindl, ], a VEGF не способен стимулировать ангиогенез в периинфарктной зоне сердца, в то время как у диких мышей он оказывает выраженный ангиогенный эффект [Heymans S. et al., 1999]. Эти данные свидетельствуют о том, что урокиназа - необходимый посредник ангиогенных эффектов факторов роста. Мы полагаем, что увеличение синтеза урокиназы в зоне ишемии могло бы стимулировать ангиогенез и усиливать эффекты факторов роста. Для проверки этой гипотезы мы исследовали влияние транзиторной трансгенной экспрессии урокиназы на ангио-артериогенез в периинфрктной зоне сердца крысы и в ишемизированной задней конечности крысы и мыши.
Целью работы было изучение возможности стимуляции неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью прямого введения в них плазмид с кДНК урокиназы на моделях ишемии скелетных мышц и миокарда у животных.
В рамках реализации этой цели были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:
Изучить влияние гипоксии на экспрессию и продукцию урокиназы эндотелиальными клетками человека и накопление урокиназы в среде культивирования этих клеток.
Исследовать динамику экспрессии урокиназы в ишемизированном миокарде периинфарктной зоны сердца крысы
Сконструировать плазмидные векторы, несущие кДНК человеческой, мышиной и крысиной урокиназы, человеческого VEGF и маркерного гена бета-галактозидазы. Исследовать функциональную активность полученных плазмид на культурах клеток.
Исследовать эффективность трансфекции скелетных мышц и миокарда при прямом введении плазмиды с маркерным геном бета-галактозидазы; оценить длительность экспрессии трансгенов в ишемизированном миокарде крысы с помощью вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР.
Изучить влияние прямого внутримиокардиального введения плазмид с кДНК урокиназы на ангио- артериогенез в периинфарктной зоне и размер инфаркта миокарда у крысы.
Изучить влияние прямого внутримышечного введения плазмид с кДНК урокиназы на ангиогенез и восстановление кровотока в ишемизированной задней конечности крысы и мыши, сравнить с эффектом VEGF и оценить эффект совместного введения двух генов [урокиназы и VEGF]; оценить влияние генной терапии на развитие отека конечности.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В работе было впервые показано, что трансгенная экспрессия урокиназы в ишемизированных скелетных мышцах и миокарде путем прямого введения плазмид несущих кДНК урокиназы стимулирует ангио-артериогенез и ускоряет восстановление кровотока в ишемизированных тканях. В отличие от VEGF она не вызывает развития отека тканей в месте введения. Совместное использование генов урокиназы и VEGF позволяет снизить дозу VEGF без потери эффективности.
Полученные данные указывают на урокиназу как на новый перспективный терапевтический ген для стимуляции ангио- артериогенеза в ишемизированных тканях.
