Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о механизмах формирования ритмической активности 10
1.2. Структурно-функциональная характеристика электрических синапсов 17
1.3. Организация бочонков на уровне четвертого слоя колонок соматической коры крыс 27
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Постановка экспериментов 36
2.2. Электрофизиологические методы исследования 36
2.3. Морфологические методы исследования 37
2.4. Методы анализа полученных данных 42
2.4.1. Методы анализа биоэлектрической активности 42
2.4.2. Морфометрические методы исследования и анализ ультраструктуры синапсов на серийных срезах 43
Глава 3. Результаты исследования 46
3.1. Пространственно-временная характеристика таламокортикалыюй и корково-корковой веретенообразной активности 46
3.1.1. Организация веретенообразной активности в коре и таламусе 46
3.1.2. Пространственно-временная организация веретенообразной активности в баррельной коре 53
3.2. Макро и микроскопическая организация баррельной коры и экспрессия основных антигенов, специфичных для нервной ткани 69
3.3. Электронномикроскопическое исследование синаптическои организации баррельной коры и ультраструктурных особенностей электрических синапсов 86
3.4. Морфометрический анализ электрических синапсов баррельной коры крыс 106
3.5. Исследование электрических и химических синапсов на серийных ультратонких срезах 109
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 1 16
Выводы 128
Список сокращений 130
Список литературы
- Современные представления о механизмах формирования ритмической активности
- Структурно-функциональная характеристика электрических синапсов
- Морфологические методы исследования
- Организация веретенообразной активности в коре и таламусе
Введение к работе
Актуальность исследования
Одним из важнейших свойств ансамблей нейронов головного мозга является ритмическая активность. Функциональное состояние организма отражается в смене частотных диапазонов ритмов ЭЭГ. Так, дельта- ритм наблюдается в состоянии глубокого сна, а альфа-ритм характерен для спокойного и дремотного состояний (Коган, 1969; Нарикашвили и соавт., 1965; Супин, 1970; Вербицкий, 1980; Буриков, 1985; Ковальзон, 1993; Сухов, 1995). Дельта и альфа ритмы возникают при относительном балансе между тормозными и возбуждающими процессами в коре (Гусельников, 1976; Шевелев.И. А. с соавт., 2001; Шевелев И. А. с соавт., 1991). Ритмы тета-диапазона усиливаются в состоянии активного бодрствования при выработке рефлексов у животных (Котляр, 1977; Шульгина, 1978; Кураев, 1982; Кирой, 1998). По данным ряда авторов, тета ритм также участвует в механизмах квантования сенсорного потока (Гусельников, Супин, 1968; Гусельников, Изнак, 1983; Шульгина, 1978; Симонов, 1979; Данилова, 1985; Сухов, 1995). Таким образом, по мнению многих авторов, ритмы ЭЭГ играют важнейшую роль в механизмах восприятия, обработки и передачи информации в мозге.
Наличие локального автономного ритма было показано при анализе особенностей пространственно-временной организации фокальной фоновой активности в колонках соматической коры крысы в зоне проекции вибрисс (Сухов, 1995; Бездудная, 2000). Ведущими в развитии локальной веретенообразной активности корковых колонок являются не повторные залпы таламокортикальной синаптической активации, а эндогенные, внутрикорковые волны пейсмекерной гиперполяризации, обусловленные активацией потенциалзависимых калиевых, натриевых, кальциевых Н-каналов (McCormick, Раре, 1990; Раре, 1996; Santoro et. al., 2000). Вместе с тем, в ряде экспериментов по внутриклеточной и внеклеточной микроэлектродной регистрации ритмической активности показано, что в
начальной стадии развития веретен импульсная активность нейронов отсутствует вследствие доминирования процессов гиперполяризации. Эти результаты исключают участие химических синаптических контактов в процессе синхронизации осцилляторной активности нейронов (Сухов, Сердюк, Коняхина, 2007; Timofeev et. al., 2001). В этой связи, возникает вопрос относительно механизма синхронизации осцилляторной активности пейсмекерных Н-каналов разных нейронов в начальной стадии вереї єна. По современным данным, важную роль в электротонической синхронизации этих каналов, активируемых при гиперполяризации мембраны отдельных нейронов одной колонки, могут играть электрические дендро-дендритические синапсы, выявленные в локальных системах тормозных нейронов в разных отделах мозга млекопитающих, в том числе в сенсомоторной коре крыс (Deans et. al., 2001; Galarreta, Hestrin, 2002; Fukuda, Kosaka, 2003; Connors, Long, 2004; Gibson et. al. 1999, 2005). Однако до настоящего времени структурные особенности и механизмы функционирования электрических синапсов, их распределение и роль в центральной нервной системе остаются мало изученными. В частности, несмотря на то, что электрические синапсы были описаны повсеместно в коре и подкорковых структурах мозга млекопитающих, нами не обнаружено сведений о количественном соотношении электрических и химических контактов в бочонках на уровне 4 слоя соматической коры, а также сопоставления этих данных с особенностями веретенообразной активности в этих структурах.
Целью настоящей работы являлось изучение основных структурно-функциональных закономерностей организации бочонков и возможных механизмов синхронизации фокальной веретенообразной активности в колонках (баррелях) соматической коры крысы.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
Изучить особенности пространственно-временной организации фокальной веретенообразной активности в морфофункционалыгых группировках нейронов четвертого слоя соматической коры крыс — в поле бочонков и в соответствующих баррелоидах таламуса. Исследовать особенности процессов синхронизации фоновой фокальной веретенообразной активности нейронов, отводимой от бочонков одного и разных рядов.
Провести электронномикроскопическое исследование функционально идентифицированных при микроэлектродной регистрации бочонков соматической коры крыс с целью определения ультрасгруктурных характеристик электрических и химических синапсов в бочонках баррельпой коры крыс. Провести ультраструктурное исследование особенное! ей взаимного пространственного расположения электрических и химических синапсов на серийных срезах.
Выполнить иммуногистохимическое исследование экспрессии антигенов к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глпальному фибриллярному кислому белку (Synaptophysin, Myelin Basic Protein, Glial Fibrillar Protein, Neurofilament), которые позволяют выявить особенности пространственного распределения химических синапсов, глиальных клеток и аксонов нейронов в баррельной коре крыс.
Сформулировать теоретически и экспериментально обоснованную гипотезу о роли электрических и химических синапсов в локальной эндогенной генерации разных фаз веретенообразной активности в корковых бочонках с использованием собственных и литературных данных.
Научная новизна работы: 1) Разработан новый метод комплексного электрофизиологического, электронномикроскопического и иммуногистохимического исследования функционально и морфологически идентифицированных бочонков баррельной коры.
Впервые проведено иммуногистохимическое исследование баррельной коры с использованием антител к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глиальному фибриллярному кислому белку, которое позволило обнаружить некоторые особенности структурной организации бочонков с помощью реакции «антиген — антитело».
Получены оригинальные данные об особенностях пространственно-временной организации веретенообразной активности в разных бочонках баррельной коры, идентифицированных функционально по представительству вибрисс. Показано, что медленная электрическая активность в гомологичных зонах представительства вибрисс коры и таламуса формируется более или менее независимо.
Впервые проведено исследование электрических синапсов на серийных срезах бочонков баррельной коры, оценена частота встречаемости электрических и химических синапсов и их взаимное пространственное расположение.
Сформулирована новая гипотеза о роли электрических и химических синапсов в локальном ритмогенезе в бочонках баррельной коры на разных фазах развития веретенообразной активности. Предполагается, что электрические синапсы обусловливают локальную (внутри одного бочонка) электротоническую синхронизацию начальных фаз формирования веретена, в то время как химические синапсы вносят основной вклад в дистантную синхронизацию активности различных корковых бочонков.
Научно-практическая значимость работы.
На основании полученных результатов сформулирована гипотеза, согласно которой в качестве водителя ритма веретенообразной активности баррельной коры могут выступать пейсмекерные Ы-каналы гиперполяризации. Синхронизацию начальной подпороговой активности пейсмекерных Н-каналов в отдельном-бочонке могут обеспечивать щелевые контакты или электрические синапсы. В дальнейшем, когда ритмические потенциалы достигают порога импульсной активности, в процесс
синхронизации ритма в разных бочонках включаются химические синапсы.
Полученные результаты и разработанные методы комплексного морфофункционального исследования могут быть использованы как студентами и аспирантами-физиологами, так и морфологами при исследовании механизмов синхронизации и структурной организации баррельной коры крыс, а также для подробного изучения ультраструкгуры электрических и химических синаптических контактов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1)В пределах таламокортикальной системы крыс в гомологичных зонах представительства вибрисс наблюдается относительно независимое формирование медленной электрической активности в коре и таламусе.
2)Генерация веретенообразной- активности имеет локальный эндогенный характер в каждом бочонке баррельной коры крыс без закономерного разделения соседних бочонков на ведущие или ведомые, без фиксированной последовательности их вовлечениям ритмогенез.
3)Бочонки баррельной коры имеют особую клеточную и синаптическую организацию, а ультраструктура, количество и локализация электрических синапсов в баррелях позволяет рассматривать их как структуры, обеспечивающие электротонический этап синхронизации локального эндогенного ритмогенеза.
4)Ведущую роль в локальной внутриколончатой синхронизации фокальной веретенообразной активности играют электрические депдро-дендритические синапсы, которые обеспечивают электротоническую синхронизацию гиперполяризационной активности нейронов одного бочонка, особенно в начальной нарастающей фазе веретена, когда импульсная активность еще подавлена и химические синапсы не акти визированы.
5)Предложена новая гипотеза о механизме развития начальных фаз веретенообразной активности в поле бочонков соматической коры крыс, в которой ведущая роль отводится электротонической синхронизации
активности нейронов одного бочонка и формированию элементарного ансамбля тормозных нейронов, объединенных электрическими дендро-дендритическими синапсами. Апробация диссертационной работы.
Материалы диссертации были представлены на Между народної] конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов — 2006» (Москва, Россия, 2006), на 10-й Школе-конференции молодых ученых «Биология XXI века» (Пущино, Россия, 2006), на 5-й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чіення -2006» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), на 18-м Конгрессе ESRS (Европейское общество изучения сна) (Инсбрук, Австрия, 2006), на XX Конгрессе Общества физиологов имени Павлова (Москва, Россия, 2007), на Третьем Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007), на Научно-практической школе по конфокальной и флуоресцентной микроскопии «Горизонты современной микроскопии» (Leica) (Пущинский научный центр РАН, Россия, 2007), а также на конференции «Структурно-функциональные нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (отдел исследования мозга ГУ НИИ неврологии РАМН) (2007), на 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Функциональное состояние и здоровье человека» (Ростов-на-Дону, ЮФУ, 2008), на заседании ученого совета НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана ЮФУ.
Публикации.
По теме диссертации было опубликовано 11 печатных рабо і', из них две статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и одна статья в журнале Neuroscience and Behavioral Physiology, общим объемом 1,524 н.л.. личный вклад автора - 62,5%.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 151 страницах машинописного тексі а.
состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, методика, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 201 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 48 рисунками и двумя таблицами.
Современные представления о механизмах формирования ритмической активности
Как известно, общепринятой теории возникновения ритмической активности в головном мозге млекопитающих до сих пор пс существует. Одной из наиболее популярных гипотез является нейросетевая гипотеза, предложенная в 1962 году P.Andersen и J.C. Eccles. Согласно ті ой піпоіезе, за генерацию ритма коры ответственны нейроны релейного ядра таламуса, и благодаря синаптической организации таламокортикального взаимодействия, этот ритм появляется в коре, делая ее, таким образом, вторично вовлекаемой, ведомой структурой (Andersen, Eccles, 1962). Следовательно, ритмическая активность в коре должна развиваться строго после возникновения залпов возбуждения в нейронах релейного ядра таламуса и лишь с такой задержкой, которая необходима для таламокортикального проведения.
Однако такая картина ритмической активности наблюдается довольно редко, и теорию Андерсена и Экклса пересматривают и перерабатывают, предлагая на роль генераторов ритма различные подкорковые структуры. Так, например, существует предположение о том, что веретенообразная активность генерируется, в частности, в передаточном ядре специфическою таламуса (Нарикашвили, 1975). С.Г. Моянова (1977) полагала, что помимо специфической таламокортикальной системы, в генерации вере ієн участвуют также нейроны песпецифического таламуса (Моянова, 1977). В работе А.А. Бурикова и соавторов на роль генераторов ритма выдвинуты отдельные таламокортикальные единицы неспецифической таламокортикальной системы (Буриков и соавт., 1980). Вместе с тем, в исследованиях таламокортикальных связей методом ретроградною аксонного транспорта флюорохрома примулина, выполненных под руководством А.Г. Сухова, не удалось обнаружить подобных морфологических структур в таламокортикальной системе, а именно в неспецифических ядрах таламуса. В этой же работе были выявлены интенсивно меченые примулином нейроны баррелоидов специфического релейного ядра, которые имели моносинаптические связи с корковыми нейронами в соответствующих корковых колонках (Сухов, Лапенко, 1989).
Кроме того, некоторые авторы, в частности А. А. Бури ков и Н.В. Сунцова полагают, что гипоталамус также вовлекается в генерацию и синхронизацию ритмической активности. В связи этим Н.В. Сунцова высказывалась против представлений о жесткой закрепленности пейсмекерной функции за таламическими образованиями (Сунцова, Буршсов, 1996; Сунцова, 2000).
Существует предположение, что первичными водителями ритмов являются тормозные нейроны ретикулярного ядра таламуса, причем они обеспечивают развитие волн гиперполяризации в специфических и неспецифических ядрах (Steriade, Llinas, 1988). Согласно этой гипотезе, как и прочим, кора также вторично вовлекается в генерацию ритма, однако все перечисленные гипотезы не объясняют причину появления веретен в коре при отсутствии таковых в таламусе.
В исследованиях нашей лаборатории, выполняемых более 10 лег под руководством А. Г. Сухова, а также в работах многих других авторов, был показан независимый автономный характер ритмогенеза как в коре, гак и в таламусе. Эти результаты не согласуются с гипотезой нейросеїевой синаптической организации веретенообразной активности, как и с другими теориями, основанными на наличии ведущих и ведомых структур мозга. Основную роль в формировании и развитии ритмической активности, по современным данным, играют циклические волны гиперполяризации, обусловленные активацией потенциалзависимых калиевых каналов (11 (Hyperpolarization) -каналов), которые найдены повсеместно на мембранах нейронов коры и мембранах нейронов подкорковых структур млекопитающих (Камкин с соавт., 2006, 2007;Yanagihara, Irisava, 1980; Mayer, Westbrook, 1983; Bader, Bertrand, 1984; Spain et. al, 1987; McConnick, Pape, 1990; DiFrancesco, 1993; Pape, 1996; Luthi, McConnick, 1998). Такие каналы были идентифицированы в кардиомиоцитах пейсмекерных узлов и в волокнах Пуркинье, а также были найдены в нейронах центральной и периферической нервной системы (DiFrancesco, 1993; Раре, 1996; Santoro 2000). Токи, генерируемые этими каналами, получали различное название: lh, If, Ij. и IAR (h-активируемые на гиперполяризацию, f- забавный, q- странный, AR- аномально исправленный), в зависимости от того, в какой обласні головного мозга они были обнаружены. В целом вес эти токи называют Ih, так как они зависимы от гиперполяризации (НШе, 2003).
Предположительно Ih играет роль пейсмекера гиперполяризации, благодаря которой генерируется ритмическая активность. Это происходи і таким образом, что благодаря токам, проходящим через ионные каналы, провоцируется фаза гиперполяризации, на выходе из которой формируется фаза деполяризации (McCormick, Bal, 1997).
Ih регулируют степень гиперполяризационных волн благодаря выходу из клетки ионов калия и деполяризационных ответов за счет входа ионов кальция и натрия внутрь клетки (Раре, 1996). Катионные токи Ih также наблюдаются в дендритах и пресинаптических терминалях, где зіи юки регулируют синаптическую трансмиссию (Fletcher, Chiappinelli, 1992; Beaumont, Zucker, 2000).
Недавние исследования генома млекопитающих показали, что активируемые при гиперполяризации катионные токи (lh) протекают через каналы, которые кодируются семейством из четырех генов: HCN1, HCN2, HCN3, HCN4. Это так называемые, активируемые при гиперполяризации циклическим нуклеотидом регулируемые гены (Santoro et. al., 1997,1998; Lshii et. al. 1999; Seifert et.al, 1999; Vaccari et. al. 1999; Moroni et. al., 2000). Активируемые при гиперполяризации циклическим нуклеотидом регулируемые (HCN) каналы, кодируемые HCN генами, различаются в зависимости, от их биофизических назначений, а именно: от кинетики активации и дезактивации (к примеру, IICN1 самый быстреактивируемый, HCN4 — самый медленноактивируемый) (Santoro, Baram, 2003).
Структурно-функциональная характеристика электрических синапсов
Электрические синапсы - это специализированные контакты, через которые осуществляется прохождение ионных токов и небольших органических молекул от клетки к клетке. В последние годы стало известно, что многие нейроны центральной нервной системы млекопитающих связаны электрическими синапсами, морфология которых соответствует щелевым контактам или gap junction. Возможностей электрических синапсов в плане проведения сигнала вполне достаточно для осуществления на близких расстояниях синхронизации подпороговой и спайковой активности среди кластеров нейронов (Evans, Martin, 2002; Connors, Long, 2004; Bennett, Zukin, 2004; Homuzdi et. al. 2004; Sohl et. al. 2005). У млекопитающих злекірнческие синапсы в основном обнаруживаются между тормозными интернейронами неокортекса, гипоталамуса и таламуса.
Еще в 1967 году ученые пришли к выводу о том, что оба механизма синаптической передачи, как химический, так и электрический, успешно сосуществуют в мозге млекопитающих (Asada, Pappas, 1967). Однако признание возможной значимой функциональной роли электрических синапсов произошло гораздо позже, в 1996 году, когда были выполнены эксперименты по блокированию передачи сигналов в химических синапсах тетрадотоксином. Поскольку тетрадотоксин прекращает вход ионов натрия в клетку, то развитие потенциала действия, точнее его фазы деполяризации, исключено, что приводит к блокаде процесса секреции медиатора из синаптических везикул в синаптическую щель. Однако в этих экспериментах авторы наблюдали подпороговую осцилляторную активность после применения тетрадотоксин а и предположили участие электрических синапсов в процессах электротонической передачи сигналов, которые могут осуществлять синхронизацию подпороговых для импульсной активности колебаний (Шмидт, Тевса, 1996).
В последующем, это предположение было подкреплено в целом ряде работ. По данным, полученным в последние годы, именно электрические синапсы, выявленные в различных отделах ЦНС, участвуют в локальной синхронизации подпороговой осцилляторной активности, когда работа химических синапсов еще исключена (Connors, Long, 2004; Long et. al., 2002: Bierlein, Gibson, Connors, 2000; Hestrin, Galarreta, 2002).
Структурной основой электрических синапсов является близкий контакт мембран- отростков нейронов или глиальных клеток — щелевой контакт или gap junction, с подобием синаптической щели, ширина которой очень мала и при электронномикроскопическом исследовании, как правило, не превышает 2-3,5 нм (Benett, 1997). На электроннограммах синаптическая щель активной зоны щелевого контакта не остается сплошной, а прерывается мостиками из электронноплотного вещества. Эти мостики образуют повторяющуюся ячеистую структуру синаптической щели электрического синапса, причем ячейки ограничены участками сближенных мембран, расстояние между которыми в синапсах млекопитающих около 3 нм. Электронноплотные мостики щелевого контакта представляют собой кластеры трансмембранных каналов, составленных из субъединиц протеина, названного коннексином, посредством этих белковых каналов из клеіки в клетку проходят ионы (Nagy, 2004).
Как было показано методом замораживания-скалывания и последующего ультраструктурного исследования реплик, полученных с мембран, формирующих электрические синапсы, молекулы коннексииа объединяется в гексаметрические структуры — розетки коннексонов (Рис. 1).
Коннексины (Сх)- это семейство протеинов, включающее в себя 20 изоформ (Willecke et. al., 2002). Помимо этих изоформ, существует около 40 ортологий коїшексина. В наиболее часто используемой номенклатуре коннексин называют в соответствии с его молекулярным весом (например, коннексин 36 имеет молекулярный вес 36 кДа). Методом иммуногистохимического типирования было обнаружено, что в состав неирональных щелевых контактов соматической коры крыс входит протеин коннексин 36 типа (СхЗб) (DeZeeuw, 2003). Большинство клеток экспрессируют множество типов белка коннексина, кроме того, различные коннексины объединяются в гомометричные (homometric) и в гетерометричные (heterometric) комбинации, каждая из которых может иметь различные функциональные свойства (Al-Ubaidi et al. 2000; Teubner et. al. 2001; Alexender et. al., 2008).
Половина всех известных коннексинов млекопитающих формируеіся в центральной нервной системе. Установлены некоторые типы коннсксина, которые экспрессируются на астроцитах (Сх26, СхЗО, Сх43) и олигодендроцитах (С29, Сх32, С47) (Connors, Long, 2004). В то же время известно, что многие типы коннексина не экспрессируются на нейронах (Rash et.al. 2001 a,b; Odermatt et.al. 2003). Относительно СхЗб, который в мозге млекопитающих является ортологией Сх35 у рыб, в настоящее время известно, что он в основном экспрессируется в мозге (Connors, Long, 2004). При помощи метода замораживания-скалывания и иммуномечения протеина СхЗб, было обнаружено его расположение в gap junctions между двумя нейронами, но не в gap junction между астроцитами и/ или олигодендроцитами. (Rash et.al., 2001 a,b).
Между глиальными клетками (олигодендроцитами и астроцитами) описано несколько типов щелевых контактов, и, соответственно, несколько типов каналов в зависимости от вида коннексинов, когорые составляют пору канала (Рис 2). Астроциты, контактируя друг с другом, формируют два типа щелевых контактов: один из них содержит только Сх26, в то время как второй содержит только СхЗО и Сх43(Рис. 2а,Ь,с). Пока еще остается не ясным, образуют ли СхЗО и Сх43 гетерометричные соединения. Если эго іаїс, то тогда второй тип астроцитарных gap junctions похоже содержит только гетерометричные, гетеротипичные межклеточные каналы (Рис.2Ь). Если эю не так, то астроцитарные контакты могут содержать несколько типом гомометричных межклеточных каналов (Рис.2с).
Морфологические методы исследования
Объектом исследования являлись бочонки соматической коры головного мозга беспородных лабораторных белых крыс. Представленные в работе результаты были получены в опытах на 30 животных обоего пола, весом 150-200г, которые содержались в виварии в сшндаршых лабораторных условиях при оптимальном температурном режиме и стандартном питании. При постановке экспериментов соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные директором НИИ НТС РГУ имени А.Б. Когана с учетом, рекомендаций Ученого совета института Нейрокибернетики РГУ им. А. Б. Когана и заключением Комиссии по биомедицинской этике Российской Академии Наук с учетом международных регламентации экспериментов на животных (Копаладзе, 1998).
Трепанацию черепа проводили под эфирным наркозом ручным трепаном диаметром 3 мм, края кожных разрезов дополнительно инфильтрировали 1% раствором новокаина. Координаїьі трепанационных отверстий (2,0 мм каудально от брегмы, 5,5 мм латерально от сантального шва) определяли в соответствии с исследованиями, ранее выполненными в нашей лаборатории — в области локализации баррельной коры (Сухов, 1992). Диаметр трепанационного отверстия не превышал 3 мм. После трепанации подачу эфирного наркоза останавливали, крысу обездвиживали введением d-тубокурарина внутримышечно (2мг на 1кг веса), и затем переводили на искусственное дыхание, обеспечивая частоту дыхания один раз в секунду. Температура тела животного поддерживалась на уровне +36 - +37 градусов Цельсия. Оценка функционального состояния проводилась по показателям электрокардиограммы и электрокортикограммы.
Для отведения фокальной активности отдельных колонок использовали стеклянные капиллярные микроэлектроды, заполненные 2,5М рас і вором NaCl с сопротивлением 2-5 МОм и диаметром кончика 2-3 мкм. Для регистрации активности соседних баррелей использовались склейки микроэлектродов с расстоянием между кончиками 200 — 400 мкм. Склейка состояла из 2-3 микроэлектродов. Микроэлектроды погружали в мозг с помощью микроманипуляторов ММ-1 с шагом погружения 10 мкм, под контролем микрометра. Колонки коры определяли по первичному ответу (по максимальной амплитуде, минимальным латентным периодам и длительности первичного ответа) при отклонении соотве їству ющеїі вибриссы, а также оценивали на слух по вызванной нейронной активности, трансформированной в звуковые сигналы. Регистрацию фоновой активности производилась через АЦП L-205 (аналологово-цифровой преобразователь, L-Card, Россия) с помощью программы ввода с частотой дискретизации 1кГи, длительность ввода 20-30 сек. Регистрацию вызванной активности без учета фазы фоновой волны производили также с помощью программы ввода, с частотой дискретизации 1кГц. Длина записываемых участков 1,5-Зсек. Регистрировали от 30 до 50 последовательных реализаций одного стимула. Синхроимпульс для запуска стимуляторов подавали от персонального компьютера через ТТЛ выходы платы L-205 на заданном отсчете реализации. После регистрации электрической активности кончики регистрирующих микроэлектродов обрезали и оставляли в ткани мозга для определения расположения микроэлектродов в барреле по локализации их треков при последующем гистологическом контроле.
. Морфологические методы исследования В конце опыта крысе вводили нембутал в дозе 60 мг/кг и проводили транскардиальную перфузию головного мозга. Вскрывали грудную клсіку животного, пережимали нисходящие и восходящие сосуды в области диафрагмы. Затем срезали верхушку сердца, освобождая просвет правого и левого желудочков. Заполненную раствором буфера канюлю вводили через левый желудочек в аорту и закрепляли зажимом с выпиленным отверстием внутри. Перфузию проводили вначале изотоническим раствором подогретого до 37 перфузионного фосфатного буфера (рН 7,2-7,3) до вытекания из правого желудочка чистого буфера без форменных элементов крови. Время перфузии составляло 30 секунд, на перфузию уходило около 100 мл раствора. Затем в течение 60 минут мозг перфузировали раствором 4% параформальдегида (Sigma) на 0,1 молярном фосфатном буфере, рИ 7,2-7,3 (около 200 мл раствора). Скорость перфузии соответствовала скорое і и движения крови по сосудам. Фиксация таким способом считаеіся оптимальной для головного мозга, особенности выполнения транскардиальной перфузии для последующего электронномикроскопического исследования и иммуногистохимии описаны в работе A.C.Gyello (1993).
После окончания перфузии аккуратно вскрывали кости черепа, извлекали головной мозг и помещали его в тот же фиксирующий раствор на ночь для дофиксации в холодильнике (+4 С). В том случае, если сюяла задача выявления треков электродов (гистоконтроль), то стеклянные микроэлектроды сразу после опыта обрезали, при этом кончики этих микроэлектродов оставались в мозге. Далее проводили перфузию методом, указанным выше. Во время извлечения головного мозга из черепа микроэлектроды аккуратно удаляли, а след от треков оставался, что служило ориентиром при изготовлении срезов на вибратоме.
Перед изготовлением срезов на вибратоме область соматической коры выравнивали, этот участок приклеивали к столику вибратома (VT 1000В, Leica, Германия), на холоду (на льду) изготавливали тангенциальные срезы толщиной 100 мкм по ходу микроэлектродного трека. Срезы просматривали под световым микроскопом, баррели обычно обнаруживали на глубине 400-800 мкм от поверхности коры, их можно увидеть при помощи светового микроскопа или лупы.
Подготовку материала для электронномикроскопического исследования проводили по общепринятой методике (Robenson, Gray, 1990, Bozzola, Russell, 1992). После промывки в фосфатном буфере (не менее 15 минут) фрагменты баррелей (центральную часть и стенки) выделяли под инвертированным микроскопом лезвием в чашке Петри, дополнительно постфиксировали в 1% растворе Os04 на фосфатном буфере в течение 1,5 часов. Далее все образцы, содержащие фрагменты баррелей, были обезвожены в спиртах восходящей концентрации, обработаны в ацетоне и заключены в эпоксидную смолу на основе Эпон-812. Для баррелей заливка осуществлялась плоскопараллельным методом (Potts, 1965, Genoud et al., 2004). Выделенный кусочек среза баррельной коры помещали на дно пластиковой формы с плоским дном и выравнивали при помощи бамбуковых палочек до тех пор, пока кусочек не располагался строго горизонтально. Затем заливали несколько капель смолы и слегка прижимали срез к дну заливочной формы с помощью кусочка пластика. Проводили полимеризацию при 60 в течение ночи под слабым гнетом. Вторым этапом приполимеризовывали параллельно к полученному плоскому блоку капсулу, заполненную смолой, в результате на торце капсулы располагалась плоскость барреля, на которую и затачивали пирамидку для получения срезов.
Блоки с заключенными в них фрагментами ткани мозга далее затачивали на фрезе, или обычным лезвием под стереолупой. Пирамидки делали в форме неправильной трапеции, для того, чтобы было возможно определить «верх», «низ» среза. С полученных блоков изготавливали полутонкие срезы, которые окрашивали толуидиновьш синим или азуром II -основным фуксином и изучали в световом микроскопе для прицельной заточки пирамиды перед приготовлением ультратонких срезов.
Организация веретенообразной активности в коре и таламусе
Как известно, в соматической коре нейроны глубоких слоев - пятого и шестого объединяются в инфрагранулярный модуль, который является выходным для подкорковых структур. Супрагранулярный модуль - верхние (первый; второй третий) слои коры мозга - содержит малые пирамидные нейроны, осуществляющие ассоциативные внутри корковые связи между соседними колонками. Основным же корковым афферентным модулем являются нейроны четвертого слоя, которые объединяются в цитоархитектонические группировки - бочонки, причем каждый бочонок колонки соответствует рядам А, В, С, D, Е в зоне проекции вибрисс. Таким образом, отдельный бочонок является входным модулем для специфической и тактильной информации. Более высокая степень синхронизации ритмической активности внутри этого структурно-функционального клеточного объединения, по сравнению с аналогичными бочонками из соседних колонок, может являться доказательством функциональной интеграции внутри одного бочонка четвертого слоя соматической коры. Исходя из этого предположения, мы изучили особенности пространственно-временной организации веретенообразной активности в поле бочонков гранулярного слоя соматической коры крыс путем одновременной регистрации фокальной активности разных бочонков одновременно 3-4 микроэлектродами. Особое внимание уделялось данным о фоновой биоэлектрической активности бочонков разных рядов, поскольку существует предположение, что они являются самостоятельными изолированными элементами (Woolsey, Van der Loos, 1970, Woolsey, Welker, 1985, Koran, Сухов, 1977).
При изучении пространственно-временной организации веретенообразной активности в поле бочонков при одновременной регистрации активности склейками из двух, трех и четырех микроэлектродов нами было установлено, что степень синхронизации активности в проведенных экспериментах существенно различается. Установленная разница в основном зависит от расстояния между кончиками микроэлектродов, то есть, от того, один бочонок анализировался или несколько.
На рисунке 8(а, б, в) представлена фоновая веретенообразная активность, регистрируемая двумя микроэлектродами, расстояние между кончиками которых составляло не более 200 мкм. Так как размер одного бочонка составляет около 200 мкм, запись производилась из одного бочонка гранулярного слоя соматической коры крысы. Внутри бочонка веретена имели одинаковую продолжительность, которая составляла от 2 до 24 секунд. При этом, как показано на рисунке, наблюдались периоды достаточно четкой частотной сонастройки и синхронизации потенциалов, сходных и по форме и по амплитуде (рис. 8а, стрелка).
Исследование фокальной фоновой биоэлектрической активности, одновременно регистрируемой от разных бочонков четвертого слом первичной соматосенсорной коры крыс S1, выявило периодически возникающую волновую веретенообразную активность, с длительностью веретен от 500 мс до 24 секунд.
На рисунке 9 показана исходная фоновая фокальная веретенообразная активность четвертого гранулярного слоя коры головного мозга крыс, зарегистрированная в нескольких бочонках одновременно четырьмя микроэлектродами, которые погружались на одинаковую глубину- 400- 600 мкм. На данном рисунке 1 и 2 канал- это активность, регистрируемая в одном бочонке, 3 и 4- активность, регистрируемая в другом бочонке. В данном случае мы наблюдаем ту же самую высокую степень синхронизации внутри одного бочонка, как и на рисунке 1, однако, помимо этого, присутствует и различная- выраженность веретен по амплитуде и длительности в разных бочонках. Когда в одном бочонке гранулярного слоя S1 регистрировались высокоамплитудные ритмичные потенциалы, модулированные в характерные «веретена», то в другом бочонке другого ряда наблюдались меньшие по амплитуде ритмичные осцилляции. Веретена, регистрируемое в одном бочонке двумя микроэлектродами, на каналах 1 и 2 начинаются только на третьем пике внутриверетенных потенциалов, зарегистрированных в другом бочонке. На шестнадцатом пике у веретен на первом и втором канале уменьшается амплитуда, в то время как на каналах 3 и 4 амплитуда потенциалов веретен остается прежней. Кроме того, как видно на рисунке 6, верхние веретена из одного бочонка заканчиваются раньше, чем нижние, регистрируемые в другом бочонке, где веретена еще дают четыре полных внутриверетенных колебания. Такие особенности могут говорить о различном характере временной организации веретенообразной активности в двух соседних бочонках разных рядов.
